組蛋白精氨酸甲基化酶在人體外受精發(fā)育阻滯胚胎中的功能研究

黃雪梅，樊 軍，馬蓉寧，江酉瓊，冷 媚，葉 飛

(四川省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，成都 610045)

體外受精和胚胎移植技術(shù)用于治療不孕癥已有多年1]。隨著最佳排卵誘導(dǎo)和有效胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)的發(fā)展，試管嬰兒的妊娠率有所提高，但試管嬰兒治療的效率仍然很低[2]。目前，每個(gè)胚胎移植周期的臨床妊娠率僅為30%～40%，胚胎植入率僅為20%～30%[3]。受精后第3天，只有30%～50%的胚胎可以形成囊胚。大多數(shù)胚胎被阻滯8個(gè)細(xì)胞到桑葚胚階段。10%～15%的體外受精胚胎表現(xiàn)出永久性的細(xì)胞周期阻滯狀態(tài)，40%的體外受精每個(gè)周期至少顯示1個(gè)阻塞的胚胎，這導(dǎo)致患者妊娠率較低[4]。目前研究早期胚胎發(fā)育基本發(fā)生機(jī)制的較少。

組蛋白精氨酸甲基化酶(PRMT)在早期胚胎發(fā)育中有重要作用，PRMT7的過度表達(dá)會(huì)破壞早期胚胎發(fā)育過程，導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育停滯，但發(fā)育停滯的缺陷可以通過敲低PRMT7蛋白來部分挽救[5]。組蛋白精氨酸甲基化酶6(PRMT6)是一種核酶，主要催化組蛋白H3在精氨酸2(H3R2me2a)上的不對(duì)稱二甲基化，PRMT6與許多基本的細(xì)胞過程有關(guān)，包括細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、核受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄及干細(xì)胞多能性的維持[6]。有研究[7]顯示，抑制PRMT6可導(dǎo)致多能基因的下調(diào)和分化標(biāo)記物表達(dá)的誘導(dǎo)，提示PRMT6與胚干(ES)細(xì)胞多能性和自我更新相關(guān)。本文旨在研究PRMT6在人體外受精發(fā)育阻滯胚胎中的作用。

1 材料與方法

1.1 阻滯胚胎的收集與分析

收集2019年1月到2021年12月四川省婦幼保健院丟棄的70枚體外受精人類胚胎，其中12枚正常發(fā)育的胚胎(第3天培養(yǎng)的多精受精的胚胎細(xì)胞數(shù)>5)為正常組，12枚發(fā)育阻滯胚胎(第3天培養(yǎng)的多精受精的胚胎細(xì)胞數(shù)≤5)為阻滯組，46枚發(fā)育阻滯胚胎進(jìn)行PRMT6敲除(PRMT6敲除組)。使用連續(xù)單一培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 PRMT6的敲除

使用Eurofin MWG Operon siRNA設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)PRMT6的siRNA序列，并將其克隆到pSUPER.puro載體中以表達(dá)短發(fā)夾RNA(shRNA)，用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染后，分別用嘌呤霉素(1 μg·mL-1)選擇細(xì)胞3 d，后在細(xì)胞里包裝濃縮成pLVX-IRES-ZsGreen1-hPRMT6慢病毒。顯微鏡下往每枚阻滯胚胎注射慢病毒(滴度108 TU·mL-1)3～5 nL，注射后的胚胎使用連續(xù)單一培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),觀察胚胎7 d的發(fā)育情況，最后進(jìn)行RNA提取和蛋白質(zhì)提取。

1.3 RNA提取、cDNA合成和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)

參照說明書，使用MicroElute Total RNA試劑盒提取總RNA(Omega Bio-Tek)。根據(jù)說明使用TRIzol試劑(美國Invitrogen)從胚胎中提取RNA，分光光度法驗(yàn)證RNA質(zhì)量，A260/A280比值在1.8和2.0之間，從2 μg DNase處理的總RNA樣品中用寡核苷酸(dT)引物和PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)合成cDNA。cDNA稀釋10倍，用于qRCR。使用SYBR預(yù)混料EX Taq試劑盒(中國大連Takara)在定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)(BIO-RAD)上按制造商的建議進(jìn)行熒光qPCR實(shí)驗(yàn)。

1.4 免疫熒光

PRMT6分布使用以下一抗的免疫熒光來確定：用DAPI(Beyotime Biotechnology)染色細(xì)胞核，熒光偶聯(lián)二抗染色胞質(zhì)，用40×1.25油物鏡的共聚焦顯微鏡收集共聚焦圖像。

1.5 蛋白質(zhì)印跡

使用放射免疫沉淀測(cè)定裂解緩沖液(Solarbio)提取總蛋白，并且通過加入10 μL蛋白的裂解緩沖液。在冰上裂解30 min后，樣品以12 000 g離心20 min。電泳2 h后轉(zhuǎn)移至膜上。將膜用脫脂奶粉封閉1 h，并與一抗過夜。后將膜與二抗(1/2000；Abcam，美國)一起孵育1 h。ECL(Absin,Shanghai,China)顯色、暗室曝光、顯影后，通過凝膠成像系統(tǒng)獲得蛋白質(zhì)條帶。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PRMT6在發(fā)育阻滯胚胎中上調(diào)

免疫染色及蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果表明，與正常組相比，阻滯組的PRMT6蛋白質(zhì)水平顯著增加[(1.160±0.054)比(1.530±0.13)]，H3R2me2升高[(1.340±0.019)比(1.710±0.011)]，H3K4me3水平下降[(1.650±0.030)比(1.220±0.015)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。提示PRMT6水平的升高與胚胎分化相關(guān)。

*P<0.05與正常組比較。圖1 正常組和阻滯組PRMT6蛋白質(zhì)、H3R2me2和H3K4me3水平(免疫染色和蛋白印跡檢測(cè))

2.2 敲除PRMT6降低發(fā)育阻滯胚胎的分化標(biāo)記基因表達(dá)

qPCR和蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與阻滯組比較,PRMT6敲除組PRMT6 RNA[(1.660±0.029)比(1.230±0.017)]、PRMT6蛋白[(1.400±0.030)比(1.050±0.058)]及H3R2me2蛋白[(1.410±0.011)比(1.340±0.019)]水平顯著下調(diào)，而H3K4me3[(1.710±0.011)比(1.340±0.019)]水平升高；多能性標(biāo)記Oct4[(1.710±0.016)比(1.160±0.049)]、Nanog[(1.690±0.089)比(1.260±0.051)]和Sox2[(1.680±0.091)比(1.310±0.057)]的水平被下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

#:從PRMT6敲除組中隨機(jī)選出12枚敲除胚胎。*P<0.05，與阻滯組比較。圖2 阻滯組和PRMT6敲除組PRMT6及分化標(biāo)記基因的表達(dá)(蛋白印跡檢測(cè))

2.3 阻滯組和PRMT6q敲除組的胚胎發(fā)育情況

培養(yǎng)阻滯組和PRMT6q敲除組胚胎7 d，阻滯組沒有發(fā)育，PRMT6敲除組可以挽救部分發(fā)育停滯的胚胎，甚至單個(gè)發(fā)育受阻的胚胎也可以發(fā)育成融合胚胎數(shù)，有18枚阻滯胚胎發(fā)育成為4～7細(xì)胞，22枚阻滯胚胎發(fā)育成為8～12細(xì)胞，5枚阻滯胚胎發(fā)育成為囊胚，1枚阻滯胚胎發(fā)育成為融合胚胎。阻滯組和PRMT6q敲除組的胚胎發(fā)育情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？梢?，PRMT6水平的下調(diào)會(huì)驅(qū)動(dòng)阻滯胚胎分化成內(nèi)胚層譜系和其他的細(xì)胞類型。

3 討論

早期胚胎發(fā)育阻滯是人類生育治療效率低下和反復(fù)治療失敗的主要原因。早期胚胎發(fā)育在胚胎發(fā)育過程中起著突出的作用[8]。本研究中，與正常發(fā)育胚胎相比，發(fā)育阻滯胚胎中的PRMT6升高。提示發(fā)育阻滯缺陷可以通過PRMT6蛋白的降低來部分挽救。

近年來，組蛋白精氨酸修飾已成為多能性的新調(diào)節(jié)劑，組蛋白精氨酸甲基化酶4(PRMT4)先前曾被報(bào)道在維持細(xì)胞多能性方面起重要作用[9]。ES細(xì)胞中CARM1的缺失導(dǎo)致Oct4和Sox2的下調(diào)，最終引導(dǎo)ES細(xì)胞分化成各種譜系[10]。最近的PRMT5敲除研究表明，組蛋白精氨酸甲基化酶5(PRMT5)對(duì)于早期內(nèi)細(xì)胞質(zhì)量形成至關(guān)重要[11]。這些結(jié)果都強(qiáng)調(diào)了PRMT在早期胚胎的重要性。研究發(fā)現(xiàn)PRMT6具有甲基化自身的能力，它是PRMT家族的I型酶，催化不對(duì)稱精氨酸二甲基化[12]。PRMT6是負(fù)責(zé)H3R2甲基化的主要甲基轉(zhuǎn)移酶，PRMT6通過介導(dǎo)H3R2甲基化在拮抗H3K4殘基的甲基化中起作用[13]。鑒于H3K4甲基化一直與多能分化基因(包括Nanog和Oct4)相關(guān)，本研究分析了H3R2me2與發(fā)育阻滯胚胎的發(fā)育作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)育阻滯胚胎中PRMT6升高。此外，發(fā)育阻滯胚胎組H3R2me2升高，而H3K4me3水平下降，這表明PRMT6水平的升高與胚胎分化相關(guān)。

有研究[14]發(fā)現(xiàn),Oct4、Sox2和Nanog組成的復(fù)雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)于維持細(xì)胞分化十分重要，包括組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑在內(nèi)的表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)細(xì)胞多能性中起重要作用。H3K4me3的富集在核心轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog的啟動(dòng)子中，并通過招募核小體重塑酶作為基因激活標(biāo)記，而H3K4me3可促進(jìn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來抑制基因表達(dá)[15]，PRMT6介導(dǎo)的H3R2me2拮抗H3K4甲基化，可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT6的下調(diào)使H3K4me3水平升高，導(dǎo)致H3R2me2降低，發(fā)現(xiàn)多能性標(biāo)記Oct4、Nanog和Sox2的水平被下調(diào)。這表明PRMT6有助于維持阻滯胚胎的未分化狀態(tài)。

IVF的人類胚胎容易發(fā)育停滯，這大大降低了IVF治療的效率[5]。正如預(yù)期的一樣，本研究觀察阻滯組和PRMT6敲除組胚胎發(fā)育情況至第7天時(shí)，PRMT6敲除組有18枚阻滯胚胎發(fā)育成為4～7細(xì)胞，22枚阻滯胚胎發(fā)育成為8～12細(xì)胞，5枚阻滯胚胎發(fā)育成為囊胚，1枚阻滯胚胎發(fā)育成為融合胚胎，而阻滯組未見胚胎發(fā)育。這表明敲除PRMT6可以挽救部分發(fā)育停滯的胚胎。該研究的局限性:首先，本研究為單中心、小樣本研究，其結(jié)論需要在多中心、大樣本研究中得到證實(shí)；其次，阻滯胚胎是來自不同患者的胚胎,沒有分析患者胚胎間的不同。

總之，與對(duì)照胚胎相比，阻滯胚胎中的PRMT6蛋白質(zhì)水平顯著增加，敲除PRMT6后，阻滯胚胎中H4R3me2s的甲基化水平也顯著升高。擊倒PRMT6可以挽救部分發(fā)育阻滯的胚胎，甚至單個(gè)阻滯胚胎的胚胎也可以發(fā)育成融合胚胎。故PRMT6的敲除會(huì)促進(jìn)阻滯胚胎發(fā)育。