Salusinβ減輕內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的大鼠離體心臟功能損傷

邵柯捷，任安經(jīng)

(海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院a.學(xué)員五大隊(duì)十三隊(duì)2018級(jí)； b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海 200433)

Salusins蛋白由扭轉(zhuǎn)應(yīng)力障礙基因經(jīng)選擇性剪接后翻譯而來，有salusinα(28個(gè)氨基酸)和salusinβ(20個(gè)氨基酸)2種形式[1-2]。Salusins廣泛分布于骨髓、內(nèi)分泌腺和腦等組織[3-4]，具有降低血壓、減慢心率和減少心輸出量等作用[1,5-7]。筆者前期工作[8-9]發(fā)現(xiàn)，Salusins通過上調(diào)GRP78保護(hù)新生大鼠心肌細(xì)胞免受血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，表明其可通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而減輕缺血-再灌注引起的心肌細(xì)胞損傷。此外，salusinβ可以抑制心肌細(xì)胞L型鈣電流[10]和鈉鈣交換電流，增加瞬時(shí)外向鉀通道電流和縮短動(dòng)作電位時(shí)程[11]。

心肌缺血-再灌注損傷是Ca2+、K+、自由基、兒茶酚胺、內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)等多種內(nèi)源性的化學(xué)介質(zhì)共同參與并相互作用的結(jié)果。ET-1是一種作用強(qiáng)烈的縮血管活性物質(zhì)，在心肌缺血-再灌注損傷中起著非常重要的作用[12-14]。心肌缺血時(shí)內(nèi)源性ET-1合成和分泌增加，可收縮心臟冠狀動(dòng)脈從而加重心肌缺血[15]；與此同時(shí)，由于內(nèi)皮素A受體(endothelin receptor A，ETA)上調(diào)和血管內(nèi)皮功能的障礙引起內(nèi)皮素B受體(endothelin receptor B，ETB)所介導(dǎo)的舒血管反應(yīng)減弱，冠狀動(dòng)脈對(duì)ET-1的縮血管反應(yīng)增強(qiáng)。體內(nèi)許多心血管活性物質(zhì)之間存在相互作用，或協(xié)同、或拮抗。本研究以外源性ET-1誘導(dǎo)離體心臟灌流損傷為模型，觀察salusinβ能否改善離體心臟的功能，旨在明確salusinβ對(duì)心肌的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)8～10周齡雄性SD大鼠購(gòu)自海軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重280～350 g。Salusinβ和ET-1 1-21購(gòu)自日本大阪肽研究所；其他鹽類試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Langendorff灌流系統(tǒng)購(gòu)自上海奧爾科特生物科技有限公司。Rm6240B型多道生物信號(hào)分析系統(tǒng)購(gòu)自成都儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 離體心臟灌流模型的構(gòu)建

SD大鼠腹腔注射氨基甲酸乙酯(烏拉坦)1.0 g·kg-1麻醉，并注射300 U劑量的肝素抗凝，迅速開胸，取出心臟，置于4 ℃預(yù)冷的Krebs-Henseleit(KH)液中，分離大鼠主動(dòng)脈，快速將主動(dòng)脈結(jié)扎于Langendorff灌流裝置上，經(jīng)主動(dòng)脈逆行以95% O2和5%CO2(V/V)混合氣飽和的KH液恒溫(37 ℃)恒壓(8 kPa)灌注心臟。剪去部分左心耳后將一端扎有乳膠球囊的PE導(dǎo)管經(jīng)左心房插入到左心室，球囊內(nèi)充入少量水使左室舒張末壓達(dá)到6 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，導(dǎo)管的另一端連接壓力換能器，用Rm6240B型多道生物信號(hào)分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)左室內(nèi)壓變化。操作完畢后預(yù)灌流15 min，待心臟狀態(tài)穩(wěn)定后開始正式實(shí)驗(yàn)。以0.5 nmol·L-1ET-1灌流10 min制備心肌損傷模型。

KH液成分(mmol·L-1)：NaCl 118.0，KCl 4.7，MgSO41.2，KH2PO41.2，CaCl22.5，NaHCO325.0，Glucose 11.0。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理

18只雄性SD大鼠按照隨機(jī)對(duì)照表法分為對(duì)照組、ET-1組和salusinβ+ET-1組，每組各6只。對(duì)照組：心臟平衡灌流20 min后繼續(xù)用KH液灌流40 min。ET-1組：心臟平衡灌流20 min，0.5 nmol·L-1ET-1灌流10 min后繼續(xù)用KH液灌流30 min。Salusinβ+ET-1組：心臟平衡灌流15 min，10 nmol·L-1salusinβ 灌流5 min，再以0.5 nmol·L-1ET-1灌流10 min后用KH液灌流30 min。

1.2.3 觀察指標(biāo)

從心臟開始平衡灌流到灌流結(jié)束期間記錄心率(HR)和心功能指標(biāo)，包括左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓(LVSP)和左室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。實(shí)驗(yàn)過程中每隔5 min收集1 min 的心臟流出液作為冠狀動(dòng)脈流量(CF)，CF數(shù)值采用CF除以心臟濕重進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組HR的變化

以ET-1開始灌流為時(shí)間軸的0點(diǎn)，灌流之前3組各時(shí)間點(diǎn)的HR差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，灌流后3組HR在灌流期間均保持相對(duì)恒定，各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖1。

2.2 各組心功能的變化

以ET-1開始灌流為時(shí)間軸的0點(diǎn)，灌流之前3組LVSP、LVEDP、±dp/dt均無顯著變化。與對(duì)照組比較，ET-1組ET灌流后LVSP、+dp/dt、-dp/dt急劇下降，灌流10 min后LVSP、+dp/dt、-dp/dt分別為(61.65±6.17)mmHg、(1138±48)mmHg·s-1和(818±57)mmHg·s-1。與ET-1組比較，Salusinβ+ET-1組給予ET-1 10 min后LVSP、+dp/dt、-dp/dt分別為(90.89±7.44)mmHg、(1573±89)mmHg·s-1和(1178±78)mmHg·s-1，均顯著高于ET-1組(均P<0.05)。ET-1組KH灌流后LVSP、±dp/dt有所回升，但LVSP于30 min前、+dp/dt于35 min前、-dp/dt于15 min前仍明顯低于salusinβ+ET-1組。各組LVEDP保持在6 mmHg左右，灌流后期略有上升，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖2。

圖1 3組離體灌流大鼠心臟HR變化

*P<0.05、**P<0.01與對(duì)照組比較；#P<0.05、##P<0.01與ET-1組比較。圖2 各組離體灌流大鼠心臟心功能的變化

2.3 各組CF的變化

以ET-1開始灌流為時(shí)間軸的0點(diǎn)，灌流之前3組CF無顯著變化。ET-1組灌流后CF急劇下降，ET-1灌流后5、10、15 min CF分別為(7.1±0.5)mL、(5.9±0.4)mL和(5.8±0.4)mL；KH液灌流后CF有所上升，但仍明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)。與對(duì)照組比較，Salusinβ+ET-1組灌流后CF均下降，但ET-1灌流后5、10、15 min CF分別為(10.1±0.3)mL、(9.1±0.4)mL、(9.4±0.5)mL，顯著高于ET-1組(均P<0.01)，而灌流20 min后ET-1組和salusinβ+ET-1組CF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見圖3。

*P<0.05、**P<0.01與對(duì)照組比較；##P<0.01與ET-1組比較。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校?.5 nmol·L-1ET-1灌流10 min 引起LVSP、±dp/dt等反映心功能的指標(biāo)明顯降低，而salusinβ預(yù)處理明顯縮小ET-1灌流引起的這些指標(biāo)的降低幅度，提示salusinβ可以拮抗ET-1對(duì)心功能的抑制。值的注意的是，本研究ET-1組心率并未見明顯下降，提示0.5 nmol·L-1的ET-1對(duì)心率無明顯影響。

有文獻(xiàn)[16-22]報(bào)道ETA受體特異性拮抗劑BQ610和BQ123、ET受體非特異性拮抗劑bosentan和TAK044以及ET單克隆抗體均可減輕整體或離體動(dòng)物缺血-再灌注損傷，表明內(nèi)源性ET-1具有引起心肌缺血-再灌注損傷的作用。另有研究[23-24]顯示，低劑量(1～30 pmol·L-1)ET-1對(duì)大鼠離體心臟具有正性肌力作用[23]，而較大劑量ET-1(30～90 pmol·L-1)對(duì)豚鼠離體心臟首先表現(xiàn)為短暫的正性肌力作用，隨后出現(xiàn)持續(xù)的負(fù)性肌力作用[24]。也有研究[25]報(bào)道較大劑量ET-1對(duì)離體心臟產(chǎn)生負(fù)性肌力作用。本研究采用0.5 nmol·L-1ET-1灌流離體心臟，觀察到其可使大鼠離體心臟收縮和舒張功能下降。較大劑量ET-1引起離體灌流心臟負(fù)性心肌作用的機(jī)理較為復(fù)雜。一方面，ET具有較強(qiáng)的收縮冠狀動(dòng)脈血管的作用，故可導(dǎo)致心肌因缺血、缺氧而使心室舒張不全，充盈不足，進(jìn)而產(chǎn)生負(fù)性肌力作用。另一方面，ET可不依賴于血管收縮，直接對(duì)心肌產(chǎn)生損傷作用和致心律失常作用[26]。

筆者前期工作[9]發(fā)現(xiàn)在結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈前降支引起心肌缺血導(dǎo)致的心肌梗死模型中，salusinβ預(yù)處理可顯著減輕冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的心肌梗死面積，其機(jī)制是減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為進(jìn)一步研究salusinβ改善缺血引起心功能降低的作用，本研究以離體灌流心臟為模型，利用ET-1灌流引起冠狀動(dòng)脈流量急劇下降而導(dǎo)致心肌缺血，發(fā)現(xiàn)salusinβ+ET-1組LVSP、±dp/dt等反映心功能的指標(biāo)顯著高于ET-1組，而且冠狀動(dòng)脈流量也顯著高于ET-1組，說明salusinβ預(yù)處理顯著減輕高劑量ET-1灌流引起的冠狀動(dòng)脈收縮，這可能是salusinβ減輕ET-1的心肌損傷作用的重要原因。CAKIR等[27]報(bào)道salusinβ具有減輕缺血-再灌注引起的腎臟損傷的作用，其機(jī)制是增強(qiáng)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低丙二醛、腫瘤壞死因子α、白介素6的水平。Salusinβ對(duì)ET-1引起的心功能損傷的保護(hù)作用是否也存在類似的的機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。此外，salusinβ的受體是G蛋白偶聯(lián)受體[28]，而ETA和ETB受體也均是G蛋白偶聯(lián)受體。因此，ET與平滑肌細(xì)胞ETA和ETB結(jié)合可引起血管收縮，而salusinβ是否可能與平滑肌細(xì)胞ETA和ETB結(jié)合從而降低ET-1與ETA和ETB受體的結(jié)合能力，進(jìn)而降低血管收縮程度，減輕心肌缺血，改善ET的心功能抑制作用，這值得進(jìn)一步研究。