諾麗酵素的化學(xué)成分及其抗菌活性研究

況家才，趙 婷，張 斌，余章昕，陳光英

（1.海南師范大學(xué) 熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158；2.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 海南省熱帶藥用植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571158）

諾麗（Morinda citrifoliaLinn）又名海巴戟天、海巴戟，別名Noni，為茜草科（Rubiaceae）海巴戟天屬（Morinda）植物，在中國(guó)海南島、臺(tái)灣島以及西沙群島等地有廣泛分布。其果實(shí)被稱為“精力果”，南太平洋地區(qū)的波利尼亞人把諾麗果作為食品和保健品已有2000多年的歷史。諾麗果主要含有生物堿類、黃酮類、酚類、糖苷類等多種活性成分，部分化合物表現(xiàn)出抗氧化、改善血液循環(huán)、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等活性[1-3]；Anwar等對(duì)諾麗果進(jìn)行研究，結(jié)果表明諾麗果乙醇提取物具有中等的抗氧化活性（IC50為101～250μg/mL）[4]；Adnyana等在四氧嘧啶糖尿病小鼠試驗(yàn)中，諾麗果乙醇提取物（劑量為500 和1000 mg/kg）顯示出顯著的降糖活性[5]；Jainkittivong等研究表明，諾麗果乙醇提取物具有抗白色念珠菌作用[6]。

由于成熟的果實(shí)具有刺激氣味且?guī)Э辔蹲屓穗y以下咽，因此目前許多企業(yè)將諾麗果發(fā)酵成果汁（稱為諾麗酵素），并不斷地開發(fā)成多種口味的果汁進(jìn)行售賣。諾麗酵素中含有黃酮類、糖苷類、萜類及生物堿類等多種活性成分[7-9]，具有降糖、保肝、抗炎等效果[10]。Horsfal等研究證明諾麗果汁對(duì)Sprague-Dawley 糖尿病大鼠具有降血糖活性[11]；采用諾麗果汁治療牙齦炎和牙周炎的研究表明，諾麗果汁的額外治療顯著降低了牙齦炎癥[12]。為了尋找其中新的活性化合物，筆者所在的課題組對(duì)諾麗酵素的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到了11個(gè)化合物，分別鑒定為blumenol A（1）、（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one（2）、4-allyl-2-hydroxyphenyl-1-O-β-D-apiosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside（3）、2-methoxy-4-vinylphenylβ-D-apiofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside（4）、4-hydroxyphenethyl-2'-R-hydroxypropanoate（5）、3-羥基-4-甲氧基肉桂酸（6）、trans-4-hydroxy cinnamic acid（7）、對(duì)羥基苯丙酸甲酯（8）、p-hydroxy-phenylpropionic acid（9）、3-甲氧基-4-羥基苯乙醇（10）和香草酸（11）?；衔?～2 為紫羅蘭酮倍半萜，3～4 為糖苷類化合物，5～11為酚酸類化合物。其中，化合物1～2、5～11為首次從諾麗酵素中分離得到，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1～11的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structures of compounds 1-11

1 儀器與材料

Bruker AV（400 MHz），瑞士Bruker公司；Agilent 1260液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；制備高效液相色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×9.4 mm，5μm）；Sephadex LH-20，瑞士Amersham Blosclences 公司；柱層析硅膠及GF254 薄層板，青島海洋化工廠。色譜純乙腈，西隴化工股份有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

供試細(xì)菌：四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

2 提取與分離

將由海南省松吉元桑有限公司提供的諾麗酵素（120 L）依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，得石油醚部位35 g，乙酸乙酯部位89 g。取乙酸乙酯部位89 g 經(jīng)正相硅膠柱層析，以氯仿-甲醇梯度洗脫，得到7 個(gè)組分（Fr.1～7）。

Fr.3組分用硅膠（48～75μm）拌樣，以氯仿-甲醇[（30∶1)～(0∶100)，v/v]進(jìn)行洗脫，得到4個(gè)組分Fr.3a～3d。對(duì)Fr.3c組分繼續(xù)用反相硅膠柱以水-甲醇[（100∶0)～(0∶100)，v/v]洗脫，得到Fr.3c1～3c3。Fr.3c1以28%的乙腈-水為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物5（15 mg）、6（17 mg）、7（10.3 mg）。Fr.3c2以20%的乙腈-水為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物8（10 mg）、9（13 mg）、10（14 mg）、11（12 mg）。

Fr.5 組分首先用凝膠柱以氯仿-甲醇（1∶1）進(jìn)行洗脫，再以硅膠（48～75μm）拌樣以氯仿-甲醇[（30∶1)～(0∶100)，v/v]進(jìn)行洗脫，得到3個(gè)組分Fr.5a～5c。Fr.5b以13%的甲醇-水為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物1（15 mg）、2（10 mg）。

Fr.6組分以硅膠（48～75μm）拌樣，以氯仿-甲醇[（20∶1)～(0∶100)，v/v]進(jìn)行洗脫，再繼續(xù)用凝膠柱以氯仿-甲醇（1∶1）進(jìn)行洗脫，得到5個(gè)組分Fr.6a～6e。Fr.6a以9%的甲醇-水為流動(dòng)相經(jīng)高效液相色譜分離，得到化合物3（7 mg）、4（8 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀，易溶于氯仿，UV 254 nm下顯暗斑。[α]+13.8（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:247.1[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C13H20O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH:5.86（1H，br.s，H-4），5.85（1H，d，J=2.4，H-8），5.80（1H，dd，J=2.8，1.6，H-8），4.19（1H，m，H-9），2.43（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.11（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.89（3H，s，H-13），1.21（3H，d，J=6.4 Hz，H-10），1.04（3H，s，H-12），1.01（3H，s，H-11）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC:197.8（C-3），164.5（C-5），137.0（C-7），129.4（C-8），126.8（C-4），79.4（C-6），67.7（C-9），50.4（C-2），41.8（C-1），24.4（C-12），24.2（C-10），23.4（C-11），19.3（C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物1為blumenol A。

化合物2：黃色油狀，易溶于氯仿，UV 254 nm 下顯暗斑。[α]+8.2（c 0.1，MeOH），ESI-MSm/z:231.1[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C13H20O2。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δH:5.89（1H，br.s，H-4），5.68（1H，dd，J= 15.4，6.0 Hz，H-8），5.59（1H，dd，J= 15.0，8.8 Hz，H-7），4.34（1H，m，H-9），2.51（1H，d，J=9.2 Hz，H-6），2.33（1H，d，J=16.8 Hz，H-2a），2.08（1H，d，J=16.8 Hz，H-2b），1.90（3H，s，H-13），1.29（3H，d，J=6.4 Hz，H-10），1.02（3H，s，H-11），0.95（3H，s，H-12）;13C-NMR（CDCl3，100 MHz）在δC:199.2（C-3），162.3（C-5），138.7（C-8），126.8（C-7），126.0（C-4），68.3（C-9），55.4（C-6），47.4（C-2），36.2（C-1），28.0（C-12），27.3（C-11），23.8（C-10），23.7（C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物2為（6R，7E）-9-hydroxy-4，7-megastigmadien-3-one。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇，UV 254 nm 下顯暗斑。[α]-28.3（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:467.2[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C20H28O11。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH:7.05（1H，d，J=8.2 Hz，H-6），6.63（1H，d，J=2.2，H-3），6.57（1H，dd，J=8.4，2.2 Hz，H-5），5.90（1H，m，H-8），5.01（2H，m，H-9），4.86（1H，d，J=3.2 Hz，H-1''），4.59（1H，d，J=7.2 Hz，H-1'），3.90（1H，d，J=9.4 Hz，H-4''a），3.88（1H，d，J=9.2 Hz，H-6'a），3.78（1H，d，J=3.0 Hz，H-2''），3.61（1H，d，J=9.4 Hz，H-4''b），3.47（1H，dd，J=10.0，6.0 Hz，H-6'b），3.47（1H，dd，J= 7.8，6.4 Hz，H-3'），3.36（2H，s，H-5''），3.27（1H，t，J= 9.0 Hz，H-2'），3.27（1H，m，H-5'），3.23（2H，m，H-7），3.11（1H，m，H-4'）;13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC:146.7（C-2），143.8（C-1），137.9（C-8），134.6（C-4），119.3（C-6），117.0（C-5），116.0（C-3），115.5（C-9），109.4（C-1''），102.7（C-1'），78.8（C-3''），76.0（C-2''），75.8（C-5'），75.7（C-3'），73.3（C-2'），73.3（C-4''），70.2（C-4'），67.8（C-6'），63.2（C-5''），40.6（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的一致，故鑒定化合物3 為4-allyl-2-hydroxyphenyl 1-O-β-D-apiosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside。

化合物4：白色粉末，易溶于丙酮，UV 254 nm 下顯暗斑。[α]-19.5（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:481.2[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C21H30O11。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH:7.00（1H，d，J=8.4 Hz，H-6），6.68（1H，dd，J=8.2，1.6 Hz，H-5），6.63（1H，s，H-3），5.94（1H，m，H-8），5.09（2H，m，H-9），4.81（1H，d，J= 3.2 Hz，H-1''），4.79（1H，d，J= 7.8 Hz，H-1'），3.88（1H，d，J= 9.0 Hz，H-4''a），3.86（1H，d，J=9.2 Hz，H-6'a），3.85（1H，d，J=9.4 Hz，H-6'b），3.73（1H，d，J=8.0 Hz，H-2''），3.58（1H，d，J=9.4 Hz，H-4''b），3.57（2H，s，H-5''），3.47（3H，s，H-2-OMe），3.43（1H，d，J=12.0 Hz，H-3'），3.29（1H，d，J=6.8 Hz，H-2'），3.27（1H，m，H-5'），3.21（2H，m，H-7），3.08（1H，m，H-4'）;13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC:148.9（C-2），145.0（C-1），137.9（C-8），133.6（C-4），120.5（C-5），115.7（C-6），115.6（C-1''），113.0（C-9），109.3（C-3），100.5（C-1'），78.8（C-3''），76.8（C-5'），75.9（C-2''），75.5（C-3'），73.3（C-4''），73.2（C-4'），67.7（C-2'），67.7（C-6'），63.2（C-5''），55.7（OMe-2），38.51（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的一致，故鑒定化合物4為2-methoxy-4-vinylphenylβ-D-apiofuranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranoside。

化合物5：黃色油狀，易溶于丙酮，UV 254 nm下顯暗斑。[α]+2.4（c0.1，MeOH），ESI-MSm/z:233.1[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR確定分子式為C11H14O4。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH:9.24（1H，s，4-OH），7.03（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），6.68（2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5），5.32（1H，d，J= 4.0 Hz，2'-OH），4.18（2H，ddd，J= 3.6，1.8，3.8，Hz，H-8），4.08（1H，q，J= 5.6 Hz，H-2'），2.77（2H，t，J= 7.0 Hz，H-7），1.18（3H，d，J=6.8 Hz，H-3'）;13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC: 175.0（C-1'），156.4（C-4），130.2（C-2，6），128.2（C-1），115.6（C-3，5），66.4（C-2'），65.3（C-8），34.0（C-7），20.9（C-3'）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物5 為4-hydroxyphenethyl-2'-R-hydroxypropanoate。

化合物6：無色針狀結(jié)晶，易溶于甲醇，UV 254 nm 下顯暗斑。ESI-MSm/z: 217.0 [M + Na]+，結(jié)合1HNMR 和13C-NMR 確定分子式為C10H10O4。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δH:7.59（1H，d，J=16.0 Hz，H-7），7.17（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），7.06（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6），6.81（1H，d，J=8.0 Hz，H-5），6.31（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），3.89（3H，s，OMe-4）;13C-NMR（MeOD，100 MHz）δC:171.1（C-9），150.5（C-4），149.4（C-3），146.8（C-7），127.8（C-1），124.0（C-6），111.7（C-2），116.5（C-8），116.0（C-5），56.4（OMe-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物6 為3-羥基-4-甲氧基肉桂酸。

化合物7：黃色油狀，易溶于丙酮，UV 254 nm 下顯暗斑。ESI-MSm/z:187.0[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C9H8O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH:7.61（1H，d，J=16.0 Hz，H-8），7.54（2H，d，J=8.0 Hz，H-2，6），6.90（2H，d，J=6.0 Hz，H-3，5），6.34（1H，d，J=16.0 Hz，H-7）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC: 168.3（C-9），160.3（C-4），145.5（C-8），130.7（C-2，6），126.9（C-1），116.5（C-3，5），115.6（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物7 為trans-4-hydroxy cinnamic acid。

化合物8：無色油狀，易溶于丙酮，UV 254 nm 下顯暗斑。ESI-MSm/z:203.1[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C10H12O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH: 6.92（2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6），6.62（2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5），3.47（3H，s，-OMe），2.67（2H，t，J= 7.6 Hz，H-8），2.42（2H，t，J=7.6 Hz，H-7）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC: 173.5（C-9），156.6（C-4），132.4（C-1），130.1（C-2、6），116.0（C-3，5），51.5（-OMe），36.6（C-7），30.8（C-8）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物8 為對(duì)羥基苯丙酸甲酯。

化合物9：黃色油狀，易溶于丙酮，UV 254 nm 下顯暗斑。ESI-MSm/z:189.1[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定分子式為C9H10O3。1H-NMR（Acetone-d6，400 MHz）δH: 7.07（2H，d，J= 8.0 Hz，H-2，6），6.75（2H，d，J=7.6 Hz，H-3，5），2.81（2H，t，J=7.6 Hz，H-8），2.55（2H，t，J=7.6 Hz，H-7）;13C-NMR（Acetone-d6，100 MHz）δC:173.5（C-9），155.7（C-4），131.8（C-1），129.2（C-2，6），115.1（C-3，5），35.6（C-8），29.9（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道對(duì)照基本一致，故鑒定化合物9 為p-hydroxy-phenylpropionic acid。

化合物10：白色油狀物，易溶于氯仿，UV 254 nm 下顯暗斑。ESI-MSm/z:191.1[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 確定分子式為C9H12O3。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δH: 6.86（1H，d，J= 8.0 Hz，H-5），6.75（1H，dd，J=7.6 Hz，H-6），6.55（1H，d，J=2.0 Hz，H-2），3.89（3H，s，-OMe），3.84（2H，t，J=6.4 Hz，H-8），2.82（2H，t，J=6.4 Hz，H-7）;13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δC:146.7（C-3），144.4（C-4），130.4（C-1），121.8（C-6），111.7（C-2），114.6（C-5），64.0（C-8），56.1（-OMe），38.9（C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物10 為3-甲氧基-4-羥基苯乙醇。

化合物11：無色針晶，易溶于甲醇，UV 254 nm 下顯暗斑。ESI-MSm/z:191.0[M+Na]+，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 確定分子式為C8H8O4。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δH:7.56（1H，br.s，H-2），7.55（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），6.84（1H，d，J= 9.6 Hz，H-5），3.88（3H，s，OMe）;13C-NMR（MeOD，100 MHz）δC: 170.0（C-7），152.6（C-3），148.6（C-4），125.3（C-6），123.0（C-1），115.8（C-5），113.7（C-2），56.4（-OMe）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的基本一致，故鑒定化合物11 為香草酸。

4 抗菌實(shí)驗(yàn)

將5 種致病菌接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10 h 后稀釋[稀釋梯度為(1∶500)～(1∶1 000）]備用。采用微量稀釋法，將稀釋后的含菌培養(yǎng)液分別定量加至96孔板的第一排各孔中，然后將各樣品分別加入至各列孔中，單個(gè)化合物濃度范圍是0.312 5～20.000 0μg/mL，以環(huán)丙沙星作為陽性對(duì)照，用2倍濃度遞減稀釋的方法對(duì)96孔板進(jìn)行逐行稀釋。將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，MIC定義為孔板內(nèi)明顯抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低樣品濃度。

研究結(jié)果表明，化合物2對(duì)蠟狀芽孢桿菌顯示出較弱的抑制活性，MIC值為2.5μg/mL（陽性對(duì)照環(huán)丙沙星MIC值為0.625μg/mL）；其他化合物的MIC值均大于20μg/mL，未顯示出明顯抗菌活性。

5 結(jié)論

本研究運(yùn)用各種色譜技術(shù)對(duì)諾麗酵素乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從中分離鑒定了11個(gè)化合物，化合物1～2及5～11均為首次從諾麗酵素中分離得到。采用微量稀釋法對(duì)所有化合物進(jìn)行了抗菌活性測(cè)試，結(jié)果顯示化合物2對(duì)蠟狀芽孢桿菌顯示出較好的抑制活性，MIC值為2.5μg/mL，其他化合物未顯示出明顯抗菌活性。本研究為諾麗酵素的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了一定的理論基礎(chǔ)，為諾麗酵素的品質(zhì)評(píng)價(jià)和基于諾麗果的產(chǎn)品開發(fā)提供了依據(jù)。