基于肺胃同治法探討肅肺和胃湯對(duì)反流性胃肺疾病大鼠肺胃組織PKA、cAMP、SP及TRPV1蛋白表達(dá)的影響

崔金瑜，汝觸會(huì)，陳愛(ài)鳳，陳 曄，晏露寧，韓佳穎，何 飛

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科·浙江 杭州 310003；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科·浙江 杭州 310005)

臟腑相關(guān)理論是中醫(yī)藏象學(xué)說(shuō)的重要內(nèi)容，其在肺系疾病中應(yīng)用尤為突出[1]，肺胃同治、肺腸同治等一系列臟腑同治方法應(yīng)用廣泛。肺胃在人體生命活動(dòng)中有重要作用，肺胃相關(guān)理論已廣泛應(yīng)用于臨床，采用肺胃同治法治療胃食管反流性肺系疾病的臨床實(shí)踐行之有效[2-4]，但其作用機(jī)制尚不完全明確，需要進(jìn)一步深入闡釋其內(nèi)在的本質(zhì)聯(lián)系。胃食管返流病機(jī)為胃失和降，肺氣上逆，治以肅肺和胃降逆, 肅肺和胃湯是本院呼吸科中藥協(xié)定方，治療胃食管反流性咳嗽具有一定療效。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)在反流性胃食管肺黏膜慢性炎癥與大鼠模型肺胃組織P 物質(zhì)(SP)表達(dá)呈相關(guān)性，SP可能是中醫(yī)肺胃相關(guān)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)，但缺乏進(jìn)一步的分子機(jī)制研究[5]。本研究觀察肅肺和胃湯對(duì)反流性胃肺疾病大鼠肺與胃組織 PKA、 cAMP、 SP 表達(dá)及肺組織磷酸化 PKA、TRPV1 表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究肺胃同治法治療胃食管反流性肺系疾病的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性健康成年SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證編號(hào)：20170005028404，許可證編號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 肅肺和胃湯(旋復(fù)花、蘇子、半夏、黃芩、干姜、黨參、黃連、大棗、甘草)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院中藥制劑室制成流浸膏，生藥含量1 g/mL，飲片采購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司。雷尼替丁膠囊：瑞陽(yáng)制藥有限公司，藥品批號(hào):19061902，規(guī)格：150 mg/粒。DAB kit：MDL公司； Anti-PKA beta(catalytic subunit)抗體：美國(guó)Abcam公司；Anti-cAMP蛋白Kinase Catalytic subunit抗體：美國(guó)Abcam公司；Anti-Substance P抗體：美國(guó)Abcam公司；Anti-GAPDH抗體：美國(guó)Abcam公司；PKA alpha/beta/gamma CAT 抗體：美國(guó)Affinity公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ASP200S全自動(dòng)脫水機(jī)：德國(guó)Leica公司；EPS300電泳儀：中國(guó)天能公司；VE180C電泳槽：中國(guó)天能公司；VE186轉(zhuǎn)膜儀：中國(guó)天能公司；G1150 H加熱石蠟包埋系統(tǒng)：德國(guó)Leica公司；GL-5250A加熱磁力攪拌器：KyLin-Bell Lab Instruments公司；DM3000正置熒光顯微鏡：德國(guó)Leica公司；NIKON DS-U3成像系統(tǒng)：日本尼康公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及造模 將30只大鼠隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、模型組、中藥組、西藥組、中西醫(yī)結(jié)合組，每組6只。采用慢性食管內(nèi)灌注鹽酸(含蛋白酶)方法建立反流性胃肺黏膜慢性炎癥大鼠模型[6]。將2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔麻醉大鼠，經(jīng)口插入胃管至食管中、下段，除正常對(duì)照組外，以8滴/min的速率緩慢灌注0.1 mmol/L鹽酸(含0.5%胃蛋白酶)溶液，每次20 min，每天1次，連續(xù)14 d。正常對(duì)照組用PBS液代替鹽酸，方法與模型組相同。中藥組和西藥組從造模第15天開(kāi)始分別予肅肺和胃湯流浸膏(6.7 g/kg)和雷尼替丁(27 mg/kg)，中西醫(yī)結(jié)合組同時(shí)給予同劑量肅肺和胃湯流浸膏和雷尼替丁藥物，正常對(duì)照組及胃食管反流模型組給予同劑量生理鹽水，直到第21天。給藥途徑均采用灌胃，每日1次。

2.2 標(biāo)本采集 腹腔注射2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)麻醉大鼠，心臟穿刺放血處死動(dòng)物。立即在冰塊上取出肺及胃食管組織，分離右下肺及胃竇部(0.5 cm×1cm)，取兩者其中部分組織作病理學(xué)檢查。兩者的剩余部分放入容器保存于-80 ℃冰箱備用。

2.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定

2.3.1 光鏡下觀察肺、胃組織病理學(xué)變化 對(duì)標(biāo)本取材、脫水、包埋和切片后，進(jìn)行HE染色，通過(guò)顯微鏡拍照(100倍和200倍)，采集分析樣本相關(guān)部位，并進(jìn)行HE半定量分析。肺部炎癥病理分級(jí)采取半定量方法評(píng)估其炎癥嚴(yán)重度[7]，0分：無(wú)炎癥細(xì)胞；1分：少許炎癥細(xì)胞，肺泡壁正常；2分：炎癥細(xì)胞成環(huán)狀，層厚為1個(gè)細(xì)胞，肺泡壁輕度增厚，肺泡腔內(nèi)及較多巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞；3分：炎癥細(xì)胞成環(huán)狀，層厚為2～4個(gè)細(xì)胞，肺泡壁顯著增厚，肺泡內(nèi)可及30%～50%巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞；4分：炎癥細(xì)胞成環(huán)狀，層厚>4個(gè)細(xì)胞，肺泡壁顯著增厚，肺泡內(nèi)>50%巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；5分：完全實(shí)變。胃黏膜炎癥程度根據(jù)黏膜中慢性炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分[8]。

2.3.2 免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠肺、胃組織PKA、cAMP、SP表達(dá) 大鼠肺與胃組織分別放入10%中性甲醛中固定，取材包埋，石蠟包埋切片。經(jīng)抗原修復(fù)后行免疫雜交：切片經(jīng) PBS 沖洗，滴封閉液(5%BSA)，室溫孵育30 min。用濾紙擦去封閉液，滴加適宜濃度的PKA、cAMP與SP一抗(均1∶50)置濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜，再用PBS 洗去一抗，用濾紙擦去PBS。滴加生物素化二抗，室溫孵育20 min，用PBS洗去二抗，用濾紙擦去PBS。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫孵育20 min，用PBS洗去，用濾紙擦去PBS。DAB顯色劑顯色，自來(lái)水沖洗。蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。10×40倍顯微鏡選取各組大鼠肺與胃組織切片各6張，觀察陽(yáng)性反應(yīng)(鏡下棕黃色表現(xiàn))，測(cè)定平均光密度值(AOD)。

2.3.3 Western blot檢測(cè)大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá) 各取100 mg大鼠肺、胃組織樣品，剪碎，組織勻漿機(jī)中進(jìn)行勻漿，冰上靜置裂解15～30 min。將勻漿液離心，取上清，測(cè)濃度。BCA法測(cè)出濃度后，進(jìn)行蛋白變性，沸水煮 5 min，室溫冷卻，-20 ℃保存。進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜并作好標(biāo)記，用TBST洗膜。免疫印跡：將PVDF膜放入孵育盒中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2 h進(jìn)行封閉；封閉結(jié)束后，用TBST洗膜，將膜放入含一抗稀釋液的孵育盒中，4 ℃搖床振蕩孵育過(guò)夜后取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗10 min×3次；用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h；二抗反應(yīng)結(jié)束后，回收二抗。然后用TBST洗膜5～10 min×3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光儀顯影拍攝，保存圖像。用酶標(biāo)儀測(cè)定各標(biāo)本吸光度。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺、胃組織病理形態(tài)學(xué)變化 模型組大鼠肺組織可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，胃組織胃黏膜上皮出現(xiàn)胃黏膜下間質(zhì)水腫、黏膜下可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。各給藥組大鼠肺、胃組織病理?yè)p傷程度較模型組為輕。見(jiàn)圖1，表1。

圖1 各組大鼠肺胃組織病理形態(tài)學(xué)改變(HE，×200)

表1 各組大鼠肺、胃組織炎癥病理半定量積分比較分)

3.2 各組大鼠肺、胃組織PKA、cAMP與SP表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2～圖4，表2。

圖2 各組大鼠肺、胃組織PKA表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

圖3 各組大鼠肺、胃組織cAMP表達(dá)的免疫組化接測(cè)結(jié)果(×400)

圖4 各組大鼠肺、胃組織SP表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×400)

表2 各組大鼠肺、胃組織PKA、cAMP、SP表達(dá)的免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較值)

3.3 各組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖5。

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01(動(dòng)物數(shù)：6 只)圖5 各組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果及比較

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1的蛋白表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，其中，中西醫(yī)結(jié)合組蛋白降低程度最明顯。

4 討論

反流性胃肺疾病是指胃食管反流性疾病并發(fā)肺部病變，最常見(jiàn)的是胃食管反流性咳嗽。肺胃相關(guān)理論在此類疾病中有著重要體現(xiàn)，前期研究表明SP可能是中醫(yī)肺胃相關(guān)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)[5]，為該理論提供了現(xiàn)代研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)中指出，蛋白激酶 A(PKA)、環(huán)腺苷酸(cAMP)、P 物質(zhì)(SP)對(duì)上述信號(hào)傳遞可能存在主要的影響[9]。cAMP 由腺苷酸環(huán)化酶催化 ATP 反應(yīng)生成，而cAMP 對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能主要是通過(guò)激活依賴 cAMP 的 PKA 來(lái)實(shí)現(xiàn)。瞬時(shí)感受器電位香草酸受體 1(TRPV1)是瞬時(shí)受體感受器電位通道的成員之一。最早是由Caterina等[10]發(fā)現(xiàn)，可被辣椒素激活，是一種非選擇性陽(yáng)離子通道,廣泛分布于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等。在呼吸系統(tǒng)主要分布于氣管、支氣管及肺泡的神經(jīng)軸突，咳嗽患者的TPRV1表達(dá)增加，TPRV1通道有可能成為治療咳嗽的有效靶向藥物[11]。筆者推測(cè)激活后的PKA/cAMP信號(hào)通路，促使下游靶蛋白磷酸化，使TRPV1通道開(kāi)放，Na+、Ca2+等陽(yáng)離子內(nèi)流增加，從而使肺胃組織釋放神經(jīng)肽類SP，可能介導(dǎo)了反流性胃肺疾病的病理生理過(guò)程。本課題研究發(fā)現(xiàn)：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺、胃組織PKA、cAMP與SP的蛋白表達(dá)量均顯著升高(P<0.01)，而Western blot檢測(cè)結(jié)果表明大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01或<0.05)。說(shuō)明PKA/cAMP信號(hào)通路及TRPV1、SP參與了反流性胃肺疾病病理生理過(guò)程。

中醫(yī)認(rèn)為五臟六腑皆令人咳，非獨(dú)肺也，胃失和降,則肺不布津,水濕停胃而為痰為飲,又可上逆犯肺而為咳變。中醫(yī)從肺胃同治法入手治療胃食管反流咳嗽臨床取得了較好的臨床療效。肅肺和胃湯是本院科室制劑，由半夏瀉心湯化裁而來(lái)，主要藥物有旋復(fù)花、蘇子、半夏、黃芩、干姜、黨參、黃連、大棗、甘草。方中蘇子降氣止咳；旋復(fù)花、半夏降逆止嘔、化痰散結(jié)；干姜溫中散寒，其溫中之功可助半夏溫化寒痰；黃芩、黃連清熱燥濕,苦寒泄降,善清泄肺胃之熱；黨參、大棗健脾益氣，甘草調(diào)和諸藥。該方辛開(kāi)苦降，寒溫并用，肺胃同治。本研究結(jié)果表明：與模型組比較，中西醫(yī)結(jié)合組和西藥組大鼠肺組織PKA、cAMP與SP的蛋白表達(dá)量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，中藥組、西藥組及中西醫(yī)結(jié)合組大鼠胃組織PKA、cAMP和SP蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，中西醫(yī)結(jié)合組較中藥組PKA、cAMP和SP蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。中西醫(yī)結(jié)合組和西藥組3 個(gè)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，與模型組比較，中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組大鼠肺、胃組織p-PKA和TRPV1的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。提示各給藥組治療反流性胃肺疾病能更好地阻斷PKA/cAMP 信號(hào)通路，減少TRPV1和SP的激活釋放，從而降低咳嗽的敏感性。雖然中西醫(yī)結(jié)合組和西醫(yī)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但中西醫(yī)結(jié)合組各類指標(biāo)下降程度更明顯，后續(xù)研究過(guò)程中可適當(dāng)提高各組樣本量，同時(shí)分組過(guò)程中可增加西藥半量聯(lián)合中醫(yī)組，更能體現(xiàn)中醫(yī)增效作用及中西醫(yī)結(jié)合治療的優(yōu)勢(shì)。