湖南柑橘潰瘍病菌的多態(tài)性鑒定及致病力分析

羅旭釗，朱韜，郝晨星，朱亦赤，馬先鋒，鄧子牛，韓健

湖南柑橘潰瘍病菌的多態(tài)性鑒定及致病力分析

羅旭釗1,2，朱韜1,2，郝晨星1,2，朱亦赤1,2，馬先鋒1,2，鄧子牛1,2，韓健3*

(1.園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程中心，湖南 長沙 410128；2.國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙 410128；3.湖南省園藝研究所，湖南 長沙 410125)

采集湖南省6個柑橘產(chǎn)區(qū)的呈現(xiàn)典型潰瘍病癥狀的柑橘葉片、枝條或果實樣品26份，分離潰瘍病菌株，采用柑橘潰瘍病特異性引物鑒定、細菌保守的16S rDNA序列分析及重復(fù)序列PCR基因指紋分析(Rep–PCR)方法，分析具有地域代表性的12個菌株間基因組多態(tài)性。結(jié)果顯示，12個菌株在BOX–PCR和ERIC–PCR中擴增出相同數(shù)量的多態(tài)性條帶，無法通過Rep–PCR對菌株進行區(qū)分；串聯(lián)重復(fù)位點多態(tài)性分析表明，CCB–2、CCB–3和CCB–10 這3個菌株在GT1位點上出現(xiàn)片段大小多態(tài)性；通過活體注射接種方式，將12個潰瘍病菌株接種至冰糖橙葉片，結(jié)果CCB–2和CCB–4菌株表現(xiàn)出較穩(wěn)定致病力，綜合病情指數(shù)達到75%以上，表明CCB–2相比其他11個菌株可能在基因組序列水平存在多態(tài)性，且影響菌株的致病力水平。

柑橘；柑橘潰瘍??；多態(tài)性；致病力；湖南

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種(subsp.)引起的柑橘毀滅性病害[1–2]，湖南、湖北、廣東、廣西、四川、重慶、江蘇和浙江等產(chǎn)區(qū)時有發(fā)生。根據(jù)病原菌的寄主范圍、致病癥狀、噬菌體分型、DNA指紋和地理分布的不同，柑橘潰瘍病菌被分為A、B、C、D和E菌系[3]等5種細菌形式或病原體類型，其中A菌系是傳播范圍最廣、侵染力最強的致病型[4]。目前已知的2種A菌系的變種A*和Aw，寄主范圍僅限于墨西哥來檬()、塔西提來檬()和阿來檬()，可通過擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)在亞屬水平上進行區(qū)分[5]。B、C菌系被認為是A菌系的減毒類型[6]。由于細菌基因組中限制性內(nèi)切酶的酶切位點分布是獨特、穩(wěn)定、可克隆遺傳的，柑橘潰瘍病菌株的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)可用來區(qū)分B、C、D菌系和A、E菌系[7]。

楊貴兵[8]對湘南、湘西、湘中、湘北共89個果園進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)多數(shù)果園全年未噴施潰瘍病的防治藥劑，各產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)不同的感病程度。感染柑橘潰瘍病的果實癥狀在后期與柑橘瘡痂病非常類似，容易混淆[9]，因此，對柑橘潰瘍病田間癥狀觀察鑒定的結(jié)果只能視作是初步結(jié)果，必須結(jié)合潰瘍病菌系特異引物鑒定以及細菌16S測序才能對其進行判定。HARTUNG等[10]基于柑橘潰瘍病菌H I限制性片段設(shè)計引物pFL1，用于常規(guī)PCR鑒定，能夠擴增出潰瘍病菌A菌系及其2個近緣種。王中康等[11]設(shè)計的特異性引物JYF5和JYR5，具備良好的特異性和靈敏度。胡春華[12]根據(jù)致病基因末端的3個核定位序列設(shè)計的P8/P9能夠特異性檢測柑橘潰瘍病菌。

細菌基因組中廣泛存在著高度保守的串聯(lián)重復(fù)序列，Rep–PCR(REP)DNA指紋技術(shù)就是基于這些串聯(lián)重復(fù)序列在不同菌株中的多態(tài)性來區(qū)分不同菌株[13]。CUBERO等[14]和GRAHAM等[15]利用ERIC–PCR發(fā)現(xiàn)A菌系可以擴增出375 bp的基因序列，該基因序列可用來區(qū)分A菌系和屬的其他細菌；姚廷山等[16]同樣通過Rep–PCR技術(shù)分析出9個省份的柑橘潰瘍病菌具有豐富的多樣性；李文婷等[17]通過比對分析8個柑橘潰瘍病菌全基因組序列的串聯(lián)重復(fù)位點(Short Tandem Repeat, STR)，篩選出6個高度變異位點，利用這些位點對廣東省15個市(縣)14個品種共352個柑橘潰瘍病菌菌株進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)基于遺傳多樣性和遺傳距離對廣東省不同地區(qū)的柑橘潰瘍病菌株鑒定出6組類群，且同一地理來源或地理來源相鄰的菌株聚為一類，表明菌株的遺傳變異與所處的環(huán)境以及氣候條件存在一定的相關(guān)性。

湖南省不同柑橘產(chǎn)區(qū)感染柑橘潰瘍病后表現(xiàn)出差異[18]。筆者對湖南6個柑橘產(chǎn)區(qū)枝、葉、果實的潰瘍病菌進行分離和鑒定，利用Rep–PCR技術(shù)分析各菌株基因組中串聯(lián)重復(fù)序列的多樣性，并將柑橘潰瘍病菌接種至活體的冰糖橙葉片上，比較各分離菌株致病力的強弱，以期為柑橘潰瘍病的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

分別于2019年6月和2020年9月從湖南省株洲市、婁底市、永州市、郴州市、懷化市和邵陽市等柑橘產(chǎn)區(qū)采集感染柑橘潰瘍病的冰糖橙的枝條、葉片、果實樣品共26份，其中株洲市、婁底市、邵陽市、懷化市各1份，永州市12份，郴州市10份。

XacDL–509和DL–509–GFP菌株由國家柑橘改良中心長沙分中心保存[19]；突變菌株Xcc049A由上海交通大學(xué)陳功友教授團隊惠贈。

1.2　方法

1.2.1湖南柑橘潰瘍病病原菌的分離與鑒定

采用稀釋分離法[20]分離冰糖橙枝條、葉片和果實中的病原菌；以純化后的菌液為模板，采用胡春華[12]設(shè)計的P8/P9和王中康等[11]設(shè)計的JYF5/JYR5柑橘潰瘍病菌特異性引物(表1)對菌株進行潰瘍病常規(guī)PCR鑒定；采用HARTUNG等[21]設(shè)計的pFL1引物對鑒定菌株是否屬于A菌系。菌株16S rDNA的擴增采用WEISBURG等[22]設(shè)計的引物fD1/rP2，利用NCBI BLAST將16S rDNA擴增測序結(jié)果進行數(shù)據(jù)庫檢索與比對。

表1　試驗所用引物信息

1.2.2湖南柑橘潰瘍病菌株Rep–PCR及STR位點多態(tài)性分析

參照HARTUNG 等[21]的方法，采用BOX 1AR和ERIC1/ERIC2引物對鑒定出的潰瘍病菌株的DNA進行多態(tài)性分析，并基于李文婷等[17]的研究，挑選遺傳多態(tài)性較豐富的GT1、GT3位點引物對鑒定的菌株DNA進行多態(tài)性分析。

1.2.3湖南柑橘潰瘍病菌株的致病力測定

將分離鑒定后的潰瘍病菌株重新激活，挑選冰糖橙上即將達到最大葉面積且尚未轉(zhuǎn)綠的嫩葉背面進行活體注射接種，每個菌株進行3次生物學(xué)重復(fù)，并以等濃度的黃單胞桿菌屬的水稻白葉枯病原菌(pv.)作為非致病菌對照。接種后，觀察記錄第7、10、14、20和45天的癥狀；參照李建揮[23]采用病情指數(shù)的統(tǒng)計方法，在接種后第45天測量接種區(qū)域典型病斑(火山口狀或愈傷狀突起、周圍有明顯黃色暈圈)直徑，不規(guī)則形狀的病斑則取長徑與短徑的平均值，重復(fù)3次，根據(jù)病情指數(shù)比較菌株的致病力差異。

2　結(jié)果與分析

2.1　湖南柑橘潰瘍病致病菌的鑒定結(jié)果

從湖南柑橘產(chǎn)區(qū)采集的感染潰瘍病的冰糖橙病葉癥狀存在差異，采集自永州市的病葉上的單個病斑面積較大，病斑周圍的黃綠色暈圈范圍也較廣(圖1–1)；而采集自郴州市宜章縣的病葉上單個病斑面積較小，黃綠色暈圈不明顯(圖1–2)；采集自邵陽市的病葉單個病斑木栓化程度較為嚴(yán)重(圖1–3)。根據(jù)癥狀差異，挑選出12個菌株進行后續(xù)試驗，分別命名為CCB–1、CCB–2、CCB–3、CCB–4、CCB–5、CCB–6、CCB–7、CCB–8、CCB–9、CCB–10、CCB–11以及CCB–12，其中CCB–1來源于株洲，CCB–2來源于婁底，CCB–3、CCB–5、CCB–6、CCB–7、CCB–8來源于郴州，CCB–9來源于邵陽，CCB–4、CCB–10、CCB–11、CCB–12來源于永州。對病斑周圍的黃綠色暈圈進行組織分離，梯度稀釋后，在LB固體培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)，12個菌株與3個對照菌株相比，單菌落特征一致，在LB固體平板上生長速率也基本一致(圖2)。

圖1　湖南冰糖橙潰瘍病葉片發(fā)病癥狀

　　　1～12　潰瘍病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

以純化后的菌液為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，各菌株擴增片段大小與引物P8/P9和JYF5/JYF5R預(yù)期目的片段大小相吻合，條帶清晰完整，表明分離的菌株均為柑橘潰瘍病菌(圖3)。利用PFL1–2和PFL1–3引物對菌株進行菌系鑒定，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，12個菌株均為潰瘍病A菌系(圖4)。

A　P8/P9引物鑒定結(jié)果；B　JYF5/JYR5引物鑒定結(jié)果。

M　2000 bp Marker；1～12　潰瘍病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

利用細菌16S rDNA通用引物fD1/rP2對分離的菌株和3個對照菌株進行PCR擴增，將擴增片段連接至改造的pYL–T克隆載體并測序，利用NCBI基因組數(shù)據(jù)庫檢索與各菌株16S rDNA序列相似性較高的細菌基因組序列，結(jié)果(圖5)顯示，分離的12個菌株的16S rDNA與柑橘潰瘍病菌的16S rDNA均高度相似，表明分離的12個菌株均為柑橘潰瘍病菌(表2)。

M　2000 bp Marker；1～12　潰瘍病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

表2　湖南省柑橘潰瘍病菌16S rDNA序列比對結(jié)果

2.2　基于Rep–PCR的湖南柑橘潰瘍病菌株多態(tài)性

以12個菌株的菌液為模板分別進行Rep–PCR擴增，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，BOX–PCR的擴增效率較高，共擴增出9條目的條帶，片段大小集中于500～5000 bp(圖6)，而ERIC–PCR的擴增效率較低，但分辨率更高，共擴增出7條目的條帶，片段大小集中于750～5000 bp(圖7)。Rep– PCR結(jié)果表明，各菌株之間沒有明顯的多態(tài)性。

M　5000 bp Marker；1～12　潰瘍病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

M　5000 bp Marker；1～12　潰瘍病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

利用已篩選到的2個具有高度多態(tài)性STR位點引物對12個潰瘍病菌株進行多態(tài)性鑒定。GT1多態(tài)性位點驗證結(jié)果顯示，CCB–2、CCB–3、CCB–10在300 bp左右的位置出現(xiàn)片段大小多態(tài)性(圖8–A)，而在GT3位點上未表現(xiàn)出多態(tài)性(圖8–B)。

A　GT1引物擴增結(jié)果；B　GT3引物擴增結(jié)果；1～12　潰瘍病致病菌株；13　XacDL–509；14　Xcc049A；15　DL–509–GFP。

2.3　湖南柑橘潰瘍病致病菌菌株的致病力

接種20 d后，不同菌株致病的癥狀有差異。接種CCB–1的區(qū)域在第20天基本不表現(xiàn)癥狀(圖9–1)，僅在局部區(qū)域形成少量的針孔大小的油漬狀斑點，未形成典型的火山口病斑凸起，與缺失致病效應(yīng)子的Xcc049A表現(xiàn)的癥狀類似，而接種其他菌株的區(qū)域均出現(xiàn)典型病斑(圖9–2和圖9–3)。此外，接種CCB–4的區(qū)域病斑數(shù)量較多，病斑形成的速率較快且癥狀穩(wěn)定。通過統(tǒng)計各菌株接種區(qū)域病斑大小，計算病情指數(shù)，綜合評價的結(jié)果顯示CCB–2、CCB–4與CCB–13菌株致病力明顯優(yōu)于其他菌株(表3)。

圖9　冰糖橙葉片活體注射接種潰瘍病致病菌株后第20天癥狀

表3　冰糖橙葉片活體注射接種潰瘍病致病菌株的病情指數(shù)

同列不同字母表示菌株間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(<0.05)。

3　討論

湖南柑橘栽培歷史悠久，品種資源豐富，但抗柑橘潰瘍病的種質(zhì)資源極其稀少，柑橘產(chǎn)區(qū)受潰瘍病為害嚴(yán)重，已有65個縣(市)發(fā)病，疫區(qū)縣(市)占全省總縣(市)的57.5%，甜橙和柚發(fā)病果園占43%[2]，且不同產(chǎn)區(qū)受害程度不同，推測不同產(chǎn)區(qū)對柑橘潰瘍病的耐感性差異可能是由于菌系多態(tài)性導(dǎo)致。基于本研究中柑橘潰瘍病特異性引物鑒定，湖南不同柑橘產(chǎn)區(qū)的柑橘潰瘍病菌均為致病力最強的A菌系，且細菌保守的16S rDNA序列分析結(jié)果表明各產(chǎn)區(qū)柑橘潰瘍病菌多態(tài)性較為單一，各產(chǎn)區(qū)感病程度的差異可能更多地與各地防治手段有關(guān)[18]。田間調(diào)查中觀察到各柑橘產(chǎn)區(qū)不同柑橘品種感染潰瘍病的癥狀不盡相同[24]。潘貞珍觀察了‘滑皮金柑’‘建陽橘柚’和‘沃柑’3個品種的葉片結(jié)構(gòu)，測定了葉片生化物質(zhì)含量及其與柑橘潰瘍病感病程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)這3個品種的葉片氣孔密度與柑橘潰瘍病感病程度呈極顯著正相關(guān)，氣孔面積與柑橘潰瘍病感病程度呈顯著正相關(guān)，葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、蠟質(zhì)含量等與柑橘潰瘍病感病程度均呈極顯著負相關(guān)[25]，為不同柑橘品種對柑橘潰瘍病的抗感性差異給出了初步解釋。而筆者所收集的不同產(chǎn)區(qū)病葉雖為同一品種，但葉齡不一致，導(dǎo)致同一品種葉片結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，也可能導(dǎo)致發(fā)病癥狀的不同。

采集自湖南不同柑橘產(chǎn)區(qū)的冰糖橙潰瘍病葉片癥狀有差異，通過葉片組織分離法獲得的潰瘍病菌單個菌落的特征一致，且采用柑橘潰瘍病特異引物P8/P9和JYF5/JYF5R鑒定的結(jié)果表明這些葉片的癥狀均是由潰瘍病菌引起，但冰糖橙葉片活體注射接種分離鑒定的菌株后，在葉片上形成的癥狀和病斑特征存在差異。這可能是由于來自不同產(chǎn)區(qū)的潰瘍病菌系不同或者同一菌系的多態(tài)性有差異，導(dǎo)致各菌株的致病力不同，注射接種冰糖橙葉片后葉片表現(xiàn)的癥狀不同。徐磊[26]對不同產(chǎn)地的柑橘潰瘍病菌株進行鑒定時發(fā)現(xiàn)，柑橘潰瘍病菌存在嚴(yán)重的小種分化情況，且Eric–PCR的分辨率較Box–PCR更高，本試驗結(jié)果與其研究結(jié)果一致?；铙w注射接種菌株至冰糖橙葉片，CCB–2、CCB–4引起的癥狀穩(wěn)定，但CCB–2、CCB–3、CCB–10在GT1位點上表現(xiàn)出同樣的多態(tài)性條帶，可能表明STR位點上缺失或插入重復(fù)單元并不影響菌株致病力。

ABE等[27]研究發(fā)現(xiàn)，2個或2個以上基因的缺失比單個缺失更能顯著降低柑橘潰瘍病菌在植物中的生長繁殖，表明基因在柑橘潰瘍病菌致病性和適應(yīng)能力上具有疊加作用，這種疊加作用與感病基因中效應(yīng)子結(jié)合原件(effector-binding elements)的核苷酸多態(tài)性有關(guān)。作為潰瘍病菌的致病效應(yīng)子，在潰瘍病菌侵染植株形成典型病斑的過程中起到至關(guān)重要的作用[28]，且表達水平與柑橘潰瘍病菌的致病力呈正相關(guān)[29]。從對照菌株Xcc049A(缺失菌株)的致病表型可以看出，潰瘍病典型病斑的火山口癥狀依賴于的表達，而分離的湖南柑橘潰瘍病致病菌株所致典型癥狀的差異是否與的表達水平以及序列差異相關(guān)，有待進一步驗證。

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Polymorphism and pathogenicity analysis of citrus canker pathogens in Hunan

LUO Xuzhao1,2，ZHU Tao1,2，HAO Chenxing1,2，ZHU Yichi1,2，MA Xianfeng1,2，DENG Ziniu1,2，HAN Jian3*

(1.Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding, Changsha, Hunan 410128, China; 2.National Center for Citrus Improvement, Changsha, Hunan 410128, China; 3.Hunan Horticultural Research Institute, Changsha, Hunan 410125, China)

Twenty-six citrus leaf, branch or fruit samples showing typical symptoms caused bysubsp.() were collected from six citrus producing areas in Hunan Province, and the citrus canker pathogen strains were isolated. Genomic polymorphisms among 12 geographically representative pathogen strains were analyzed by bacterial conserved 16S rDNA sequence analysis and repetitive sequence PCR gene fingerprinting (Rep-PCR) methods using citrus canker-specific primer. The results showed that the 12 strains showed the same number of polymorphic bands in BOX-PCR and ERIC-PCR and could not be distinguished by Rep-PCR, while tandem repeat polymorphism analysis showed that 3 strains, strain CCB-2, strain CCB-3 and strain CCB-10, showed fragment size polymorphism at the GT1 locus. Twelve strains of citrus canker were inoculated by in vivo injection into the leaves of ‘Bingtang’ sweet orange and two strains, strain CCB-2 and strain CCB-4, showed stable pathogenicity with a combined disease index of over 75%, indicating that strain CCB-2 may have polymorphism at the genomic sequence level compared to the other 11 strains and affect the pathogenicity level of the strain.

; citrus canker; polymorphism; pathogenicity; Hunan

S436.661+2

A

1007-1032(2022)06-0691-08

羅旭釗，朱韜，郝晨星，朱亦赤，馬先鋒，鄧子牛，韓健．湖南柑橘潰瘍病菌的多態(tài)性鑒定及致病力分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2022，48(6)：691–698．

LUO X Z，ZHU T，HAO C X，ZHU Y C，MA X F，DENG Z N，HAN J．Polymorphism and pathogenicity analysis of citrus canker pathogens in Hunan[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(6)：691–698．

http://xb.hunau.edu.cn

2022–02–26

2022–06–28

國家自然科學(xué)基金項目(31720103915)；湖南省自然科學(xué)基金項目(2020JJ4040)；湖南省科學(xué)技術(shù)廳湖湘高層次人才聚集工程項目(2019RS1052)；湖南省教育廳研究生科研創(chuàng)新項目(CX20200665)

羅旭釗(1997—)，男，湖南新邵人，碩士研究生，主要從事果樹遺傳與育種研究，luoxuzhao@126.com；*通信作者，韓健，碩士，助理研究員，主要從事柑橘育種和病蟲害防治研究，hanjian1020@163.com

10.13331/j.cnki.jhau.2022.06.010

責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維