大蒜提取物對B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制作用

姚欣，曾潔琳，沈衡平，劉朕，范麗霞，楊安平，劉輝*

大蒜提取物對B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的抑制作用

姚欣1，曾潔琳1，沈衡平2，劉朕1，范麗霞1，楊安平1，劉輝1*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.歐露蓮生物科技(廣東)有限公司，廣東 佛山 528051)

采用MTT法測定大蒜提取物、二勝肽和六勝肽3種物質(zhì)對B16F10細(xì)胞活力的影響，且在非毒劑量下，分別評價(jià)此3種物質(zhì)對B16F10細(xì)胞黑色素生成和細(xì)胞形態(tài)的影響；在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)大蒜提取物、二勝肽和六勝肽組合物中各組分的用量，檢測組合物對B16F10細(xì)胞黑色素生成抑制率的影響，并利用Western blot檢測最佳組合物對黑色素合成相關(guān)蛋白TYR、TRP–1和TRP–2表達(dá)的影響。結(jié)果表明：0.00～2.50 μg/mL的大蒜提取物、0.00～4.00 μg/mL的二勝肽或六勝肽對B16F10細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)均沒有顯著影響；大蒜提取物在0.00～2.50 μg/mL、二勝肽和六勝肽在0.00～4.00 μg/mL內(nèi)呈劑量依賴性的抑制黑色素的生成；當(dāng)大蒜提取物、二勝肽、六勝肽質(zhì)量濃度分別為2.50、1.00、0.50 μg/mL時(shí)的組合物抑制黑色素的生成作用效果最佳；該最佳組合物對黑色素合成相關(guān)蛋白TYR、TRP–1和TRP–2的表達(dá)具有明顯的抑制作用，表明組合物抑制黑色素的生成與TYR、TRP–1和TRP–2蛋白水平的降低有關(guān)。

B16F10細(xì)胞；大蒜提取物；二勝肽；六勝肽；黑色素；細(xì)胞活力；細(xì)胞形態(tài)；抑制作用

黑色素在保護(hù)皮膚和眼睛方面發(fā)揮了重要作用。黑色素過量會導(dǎo)致皮膚顏色加深，嚴(yán)重者可引起黃褐斑、黑色素瘤等皮膚疾病，嚴(yán)重影響人們的身心健康[1]。黑色素的生物合成受到復(fù)雜的信號通路及多種酶調(diào)控，其中酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(TRP–1)和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2(TRP–2)在黑色素生成的調(diào)節(jié)中起著重要作用，抑制TYR、TRP–1和TRP–2的表達(dá)可以顯著抑制黑色素的生成[2]?；瘖y品應(yīng)用最多的美白劑有熊果苷、曲酸等，但現(xiàn)有研究[3–4]表明上述物質(zhì)均具有一定的安全問題。尋找安全、高效的美白劑已成為社會迫切的需求。隨著人民對化妝品安全的關(guān)注與日俱增，對天然植物中活性成分的開發(fā)利用也越來越重視，成為近年來化妝品功效的研究熱點(diǎn)，尋求天然、綠色、安全的美白劑已成為化妝品研究的必然方向?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有多種食品或藥食同源來源的天然成分具有較好的抑制黑色素作用。陳易彬等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳甲醇提取物具有良好的抑制黑色素細(xì)胞形成活性。王勇恒等[6]研究發(fā)現(xiàn)，川芎提取物通過抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性、清除ROS雙靶點(diǎn)的方式發(fā)揮美白作用。

大蒜為百合科植物大蒜(L.)的鱗莖，是日常生活中最常見的藥食兩用的植物之一，已有數(shù)千年的應(yīng)用歷史。大蒜富含蛋白質(zhì)、低聚糖和多糖類、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[7]，具有開胃健脾、驅(qū)寒除濕、抗菌、提高機(jī)體免疫力等功效[8–9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，大蒜具有降血糖[10]、抗腫瘤[11–12]、調(diào)節(jié)免疫[13]、抗氧化[14]、保護(hù)心血管[15]等活性；因其對多種細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物有不同程度的抑制或殺滅作用，又被稱為“天然抗生素”[7]?；瘜W(xué)成分研究表明，其主要包括有機(jī)硫類、皂苷類、黃酮類、多酚類等成分[16–17]。大蒜提取物已被納入了化妝品原料名稱目錄，二勝肽和六勝肽因其具有抗氧化、修復(fù)皮膚等作用也已被廣泛應(yīng)用于化妝品中[18–21]。前期，筆者對上述3種物質(zhì)作為活性添加劑制成的化妝品進(jìn)行了皮膚的刺激性實(shí)驗(yàn)[22]，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品除上述添加劑已報(bào)道的功能外，還具有一定的抑制黑色素生成作用，是哪一類添加劑發(fā)揮了作用，以及怎么樣的組合才能發(fā)揮最好的抑制黑色素生成作用還不清楚。筆者采用小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞模型，對大蒜提取物、二勝肽和六勝肽抑制黑色素的生成作用進(jìn)行研究，旨在為該組合物在美白化妝品方面的應(yīng)用及大蒜的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

大蒜提取物、二勝肽、六勝肽均由歐露蓮生物科技(廣東)有限公司提供；B16F10黑色素瘤細(xì)胞購自上海酶研生物科技有限公司。

1.2　主要試劑與儀器

二甲基亞砜、氫氧化鈉購自上海麥克林生化科技有限公司；3–(4,5–二甲基噻唑–2)–2,5–二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自Sigma；Tyrosinase(TYR)、Tyrosinase related protein–1(TRP–1)、Tyrosinase related protein–2(TRP–2)和β–actin購自Cell Signaling Technology；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco。

JJ500電子天平、JJ224BC萬分之一分析天平為常熟市雙杰測試儀廠產(chǎn)品；CSH–ZY–00032銳思捷純水系統(tǒng)為廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司產(chǎn)品；BioTek Epoch全波長酶標(biāo)儀為BioTek產(chǎn)品。

1.3　方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)B16F10細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3.2大蒜提取物和二勝肽及六勝肽處理后B16F10細(xì)胞活力的測定

按照張瑞雪等[23]的方法，采用MTT法觀察3種物質(zhì)對B16F10細(xì)胞活力的影響，分別用0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/mL的大蒜提取物，0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的二勝肽或六勝肽與B16F10細(xì)胞共孵育24 h，然后檢測其細(xì)胞活力。

1.3.3大蒜提取物和二勝肽及六勝肽處理后B16F10細(xì)胞形態(tài)的觀察

根據(jù)細(xì)胞活力試驗(yàn)結(jié)果，按照張向娜等[24]的方法，分別選擇非毒劑量下的0.00、0.50、1.00、1.50、2.50 μg/mL的大蒜提取物，0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的二勝肽或六勝肽與B16F10細(xì)胞共孵育24 h，再觀察細(xì)胞的形態(tài)。

1.3.4大蒜提取物和二勝肽及六勝肽處理后B16F10細(xì)胞黑色素含量的測定

按照于海鑫等[25]方法，分別選擇非毒劑量下的0.00、0.50、1.00、1.50、2.50 μg/mL的大蒜提取物，0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL的二勝肽或六勝肽與B16F10細(xì)胞共孵育24 h，檢測細(xì)胞中黑色素含量。

1.3.5大蒜提取物和二勝肽及六勝肽組合物對B16F10細(xì)胞黑色素生成的抑制作用的正交試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[24]的方法，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，大蒜提取物、二勝肽和六勝肽分別采用3個質(zhì)量濃度水平，設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)(表1)。以B16F10細(xì)胞黑色素生成抑制率為考察指標(biāo)。

表1　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽組合物正交試驗(yàn)的因素水平

1.3.6黑色素合成相關(guān)蛋白TYR和TRP–1及TRP–2的表達(dá)分析

為探究大蒜提取物、二勝肽和六勝肽組合物抑制黑色素生成的作用機(jī)制，通過Western blot檢測最佳組合物對B16F10細(xì)胞黑色素合成相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。參照文獻(xiàn)[26]的方法，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，取對數(shù)生長期B16F10細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加藥；每孔加最佳濃度組合物，設(shè)3個重復(fù)，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞；用BCA法測蛋白濃度，轉(zhuǎn)膜、封閉后加入一抗和β–actin，4 ℃孵育過夜；第2天加入相應(yīng)二抗，再室溫孵育2 h，用TBST緩沖液漂洗3次后用ECL檢測系統(tǒng)顯影免疫反應(yīng)蛋白；最后用View Smart系統(tǒng)對蛋白顯影的X–光片進(jìn)行灰度掃描。

1.4　數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均平行操作3次。數(shù)據(jù)運(yùn)用Graph Pad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用ANOVA進(jìn)行顯著性分析。正交試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Minitab 17進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽對B16F10細(xì)胞活力的影響

從圖1可知，在0.00～20.00 μg/mL劑量范圍內(nèi)，大蒜提取物對B16F10細(xì)胞呈劑量依賴性抑制其細(xì)胞活力；大蒜提取物質(zhì)量濃度為1.25、2.50 μg/mL時(shí)的細(xì)胞活力與空白對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)大蒜提取物質(zhì)量濃度大于等于5.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力極顯著(<0.001)低于對照組的?？梢?，當(dāng)大蒜提取物質(zhì)量濃度小于等于2.50 μg/mL時(shí)，其對B16F10細(xì)胞無毒性，質(zhì)量濃度大于等于5.00 μg/mL時(shí)，則具有明顯的細(xì)胞毒性。質(zhì)量濃度小于等于4.00 μg/mL的二勝肽或六勝肽對B16F10細(xì)胞活力均沒有顯著性影響。綜合上述結(jié)果，并結(jié)合常用添加量，選擇大蒜提取物質(zhì)量濃度小于等于2.50 μg/mL，二勝肽和六勝肽的質(zhì)量濃度小于等于4.00 μg/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

“***”示與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.2　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽對B16F10細(xì)胞形態(tài)的影響

從圖2可知，對照組的B16F10細(xì)胞呈梭形貼壁生長，有樹突，緊密連接形成單層細(xì)胞；經(jīng)非毒劑量的大蒜提取物、二勝肽和六勝肽處理后，B16F10細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量與空白對照組相比沒有明顯差別?？梢?，大蒜提取物、二勝肽和六勝肽分別在非毒劑量下對B16F10細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯影響。

1～6分別示0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 μg/mL大蒜提取物處理的細(xì)胞形態(tài)；7～12分別示0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL二勝肽處理的細(xì)胞形態(tài)；13～18分別示0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg/mL六勝肽處理的細(xì)胞形態(tài)。

2.3　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽對B16F10細(xì)胞黑色素生成的影響

從圖3可知，3種物質(zhì)在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均能明顯地抑制細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成，且呈劑量依賴性；其中，除0.50 μg/mL大蒜提取物對細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成沒有顯著影響外，其余質(zhì)量濃度的大蒜提取物對黑色素生成均具有顯著抑制作用，且在質(zhì)量濃度為2.50 μg/mL時(shí)效果最佳；二勝肽和六勝肽抑制黑色素生成的作用大于大蒜提取物的，考慮到二勝肽和六勝肽在實(shí)際應(yīng)用中的添加量，且在1.00 μg/mL時(shí)已極顯著(<0.001)降低了細(xì)胞內(nèi)黑色素的生成量，后續(xù)試驗(yàn)中，二勝肽和六勝肽的最高質(zhì)量濃度均選擇1.00 μg/mL。

“*”“**”“***”分別示與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01、P<0.001)。

2.4　正交試驗(yàn)結(jié)果

通過正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析與方差分析結(jié)果(表2和表3)可得，大蒜提取物(A)、二勝肽(B)、六勝肽(C)對B16F10細(xì)胞黑色素生成抑制作用的大小依次減小，且因素A和B對黑色素生成具有顯著性影響。再根據(jù)值的大小，確定大蒜提取物、二勝肽及六勝肽最佳質(zhì)量濃度組合為332，即大蒜提取物最佳添加質(zhì)量濃度為2.50 μg/mL、二勝肽最佳質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL及六勝肽最佳質(zhì)量濃度為0.50 μg/mL。

表2　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽組合物正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽組合物方差分析結(jié)果

2.5　大蒜提取物和二勝肽及六勝肽組合物對細(xì)胞黑色素合成相關(guān)蛋白的影響

從圖4可知，最佳組合物可極顯著(<0.01或<0.001)抑制B16F10細(xì)胞的TYR、TRP–1和TRP–2蛋白的表達(dá)。

“**”“***”分別示與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01、P<0.001)。

3　結(jié)論

本研究中，發(fā)現(xiàn)大蒜具有一定的抑制黑色素生成作用；同時(shí)也證實(shí)了在0.25～4.00 μg/mL范圍內(nèi)，二勝肽和六勝肽具有劑量依賴性的抑制黑色素生成的作用。通過正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大蒜提取物質(zhì)量濃度為2.50 μg/mL、二勝肽質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL及六勝肽質(zhì)量濃度為0.50 μg/mL時(shí)，該組合物抑制黑色素生成作用效果最佳。

黑色素的生物合成受到復(fù)雜信號通路的調(diào)節(jié)，TYR、TRP–1和TRP–2是黑色素合成的關(guān)鍵酶，在哺乳動物體內(nèi)的黑色素合成中發(fā)揮了重要作用[27]。本研究中，與空白對照組相比，該最佳組合物極顯著(<0.01)降低了TYR、TRP–1、TRP–2的表達(dá)。表明組合物抑制黑色素的生成與TYR、TRP–1和TRP–2蛋白水平的降低有關(guān)。

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Inhibitory effects of the extracts ofon the melanogenesis in B16F10 melanoma cells

YAO Xin1，ZENG Jielin1，SHEN Hengping2，LIU Zhen1，F(xiàn)AN Lixia1，YANG Anping1，LIU Hui1*

(1.School of Medicine, Foshan University, Foshan, Guangdong 528000, China; 2.Oululian Biotechnology(Guangdong) Co. Ltd, Foshan, Guangdong 528051, China)

The effects of extracts of, dipeptide-2 and acetyl hexapeptide-8 on B16F10 cells viability were determined using MTT method. And the effects of these three substances on the melanin synthesis and morphology of B16F10 cells were evaluated with the nontoxic dose. With the single factor experiment, orthogonal experiments were used to explore the concentration of extracts of, dipeptide-2 and acetyl hexapeptide-8 on the inhibitory effects of the melanin synthesis. The expression of proteins of TYR、TRP-1 and TRP-2 in B16F10 cells were detected using western blot. The results showed that the extracts of(0.00-2.50 μg/mL), dipeptide-2 and acetyl hexapeptide-8 (0.00-4.00 μg/mL) had no effect on the cell viability and morphology of B16F10 cells. The extracts of(0.00-2.50 μg/mL), dipeptide-2 and acetyl hexapeptide-8(0.00-4.00 μg/mL) could inhibit the melanogenesis in B16F10 cells with a dose-dependent manner. The optimal inhibition effect on melanogenesis was extracts of2.50 μg/mL, dipeptide-2 1.00 μg/mL, and acetyl hexapeptide-8 0.50 μg/mL. The optimal composition could significantly inhibit the expression of TYR, TRP-1 and TRP-2 proteins, indicating that the inhibition of melanogenesis by the composition was linked to the reduction of TYR, TRP-1 and TRP-2 protein levels.

B16F10 cell; extract of; dipeptide-2; acetyl hexapeptide-8; melanogenesis; cell viability; cell morphology; inhibition effect

S633.4

A

1007-1032(2022)06-0666-06

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YAO X，ZENG J L，SHEN H P，LIU Z，F(xiàn)AN L X，YANG A P，LIU H．Inhibitory effects of the extracts ofon the melanogenesis in B16F10 melanoma cells[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(6)：666–671．

http://xb.hunau.edu.cn

2021–06–02

2022–11–20

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2019A1515110696)；廣東省教育廳項(xiàng)目(2019KQNCX171)

姚欣(1995—)，女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事食品活性成分研究，2821185388@qq.com；*通信作者，劉輝，博士，講師，主要從事藥食同源活性成分研究，tianmahui2011@163.com

10.13331/j.cnki.jhau.2022.06.006

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正