木姜葉柯茶湯中總黃酮的加工穩(wěn)定性

夏旭，庾卓思，呂宗浩，楊建琳，胡應(yīng)祥，向小樂(lè)*

1.懷化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（懷化 418000）；2.長(zhǎng)沙理工大學(xué)（長(zhǎng)沙 410000）；3.湖南富農(nóng)甜茶有限責(zé)任公司（懷化 418000）

木姜葉柯（Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun），為殼斗科柯屬常綠喬木，根據(jù)典籍記載木姜葉柯有著悠久的民間飲用歷史[1]，是一種藥食兩用，兼有茶、糖、藥三種功能的植物[2]，并于2017年被納入新食品原料目錄。木姜葉柯廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)海拔500～2 500米以上的低山密林中[3-4]，在湖南懷化地區(qū)又稱(chēng)為芷江甜茶或溆浦瑤茶，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了木姜葉柯茶的產(chǎn)業(yè)化種植。

木姜葉柯含有豐富的黃酮類(lèi)和三萜類(lèi)成分，三葉苷、根皮苷和3-羥基根皮苷等二氫查爾酮類(lèi)化合物為其主要黃酮類(lèi)成分和甜味成分[4-6]，其中三葉苷甜度為蔗糖的300倍，熱量極低。研究表明木姜葉柯及其提取物有降糖、抑菌、抗過(guò)敏、抗氧化等功效[1-5,7-8]。因此，木姜葉柯制茶與普通的綠茶相比有含有天然甜味，不易產(chǎn)生茶多酚沉淀物，具有抗氧化、降糖降脂功效等優(yōu)點(diǎn)，是一種前景廣闊的茶飲。目前研究人員對(duì)木姜葉柯葉提取物生物學(xué)活性的研究較為多見(jiàn)，對(duì)木姜葉柯茶湯的加工特性研究則尚未見(jiàn)報(bào)道，研究擬對(duì)木姜葉柯茶飲中總黃酮的加工穩(wěn)定性進(jìn)行研究，旨在為木姜葉柯茶飲的加工應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)鏈延展提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木姜葉柯茶由湖南富農(nóng)甜茶有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)地：懷化芷江。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%，上海金穗生物科技有限公司）；氯化銅：化學(xué)純；鹽酸、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、30%過(guò)氧化氫、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、無(wú)水氯化鈣、硝酸鋁、氯化鐵、L-抗壞血酸、苯甲酸鈉、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖、焦磷酸鈉、山梨酸鉀等試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；800Y多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；ATX224電子天平（日本島津）；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市普天儀器制造有限公司）；722可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 茶湯的制取

木姜葉柯干制茶葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)0.250 mm篩網(wǎng)后，作為供試茶樣。供試茶樣按0.2%茶水比于沸水中提取2 min，期間攪拌數(shù)次。提取完成后，自然冷卻，用定量濾紙過(guò)濾，即為樣品茶湯。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制和總黃酮測(cè)定

參照夏旭等[9]建立的方法，精密稱(chēng)取200 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容作為母液。吸取0，0.5，1，2，3和4 mL蘆丁母液分別置于25 mL容量瓶中，補(bǔ)加70%甲醇至10 mL，再加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加10% Al(NO3)3硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入4% NaOH氫氧化鈉溶液10 mL，再加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置15 min；以空白試劑做參比，在波長(zhǎng)510 nm處繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和測(cè)定木姜葉柯總黃酮。

1.5 不同因素對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

1.5.1 儲(chǔ)存時(shí)間和光照對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響

向潔凈的具塞試管中加入木姜葉柯茶湯，分成2組分別置于室內(nèi)試管架和室外陽(yáng)光直射下儲(chǔ)存，間隔時(shí)間取樣，按照黃酮類(lèi)化合物的檢測(cè)方法檢測(cè)吸光度，記錄數(shù)據(jù)并繪圖。

1.5.2 pH對(duì)木姜葉柯茶湯穩(wěn)定性的影響

分別量取50 mL制備好的木姜葉柯茶湯置于10個(gè)小燒杯中用氫氧化鈉稀釋液及鹽酸稀釋液將茶湯樣液pH調(diào)節(jié)至2～11，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。

1.5.3 還原劑Na2SO3對(duì)木姜葉柯茶湯穩(wěn)定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯的試管中，分別加入Na2SO3配制成0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%的溶液，避光放置30 min后，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度。

1.5.4 氧化劑H2O2對(duì)木姜葉柯茶湯穩(wěn)定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯試管中，分別加入H2O2配制成0.25%，0.5%，1%，1.5%和2%溶液，避光放置30 min后，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度。

1.5.5 食品添加劑和糖對(duì)木姜葉柯茶湯穩(wěn)定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯試管中，分別加入下列食品添加劑配制成相應(yīng)濃度的溶液：0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%抗壞血酸、檸檬酸，0.05%，0.1%，0.15%，0.20%和0.25%苯甲酸鈉、山梨酸鉀，以及2%，4%，8%，8%和10%蔗糖和葡萄糖。搖勻后，避光放置30 min，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度。

1.5.6 金屬離子對(duì)木姜葉柯茶湯穩(wěn)定性的影響

在加有10 mL樣品茶湯的試管中，分別加入金屬離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+溶液，使得金屬離子在茶湯中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.01%，0.02%，0.03%，0.04%和0.05%，避光放置30 min后取上層清液，在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 木姜葉柯茶湯中總黃酮含量測(cè)定

測(cè)定蘆丁標(biāo)品的吸光度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程：y＝30.067x+0.046 1（R=0.999 2），說(shuō)明總黃酮含量與吸光度線(xiàn)性關(guān)系良好。木姜葉柯茶湯的吸光度為0.194±0.025，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得木姜葉柯茶湯中總黃酮含量約為0.005 mg/mL，折合總黃酮提取率約為0.25%，顯著低于有關(guān)研究[10-11]，可能是因?yàn)椴铚笾茣r(shí)間太短。為表示方便，下文均以吸光度的變化來(lái)表示木姜葉柯總黃酮含量的變化。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 儲(chǔ)存時(shí)間和光照對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

在室內(nèi)避光貯藏，木姜葉柯總黃酮吸光度隨時(shí)間（0～8 h）的延長(zhǎng)保持平緩不顯著降低的趨勢(shì)，茶湯顏色隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加深，可能原因是茶湯中存在的黃酮類(lèi)和兒茶素類(lèi)等呈色成分發(fā)生氧化所致[12]；在室外陽(yáng)光直射條件下（6月），木姜葉柯總黃酮吸光度變化較大，先上升后又隨之下降，可能是黃酮類(lèi)化合物在自然光的條件下發(fā)生水解、異構(gòu)化、氧化等原因?qū)е碌模S后又因?yàn)楣庋趸饔脤?dǎo)致黃酮類(lèi)成分進(jìn)一步被破壞[13-14]，茶湯顏色也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加深但是加深的程度比室內(nèi)的更少，可能是因?yàn)槭枪庋趸M(jìn)一步破壞了呈色成分，這說(shuō)明室內(nèi)避光條件下，木姜葉柯總黃酮的穩(wěn)定性?xún)?yōu)于陽(yáng)光直射條件。

圖2 儲(chǔ)存時(shí)間和光照對(duì)總黃酮穩(wěn)定性

2.3 pH對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

由圖3可知，在pH 2～7范圍內(nèi)，木姜葉柯茶湯的吸光度在酸性條件下變化較小，且隨著pH的增加吸光度逐步升高，在pH 6附近有最大吸光度，說(shuō)明此時(shí)的木姜葉柯總黃酮含量最高，研究結(jié)果和朱新鵬等[15]的相關(guān)研究類(lèi)似，原因可能是總黃酮苯環(huán)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，顯弱酸性，所以總黃酮在該pH附近的弱酸性環(huán)境中比較穩(wěn)定[16]。在堿性條件下，木姜葉柯黃酮穩(wěn)定性較差，當(dāng)pH＞9時(shí)吸光度迅速降低，說(shuō)明木姜葉柯茶湯中黃酮類(lèi)化合物在堿性較強(qiáng)的環(huán)境中容易受到破壞，表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，在酸性條件下穩(wěn)定性較好，因而弱酸性條件有利于木姜葉柯總黃酮的儲(chǔ)存。

圖3 pH對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響

2.4 還原劑Na2SO3對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

從圖4可以看出，還原劑Na2SO3的加入使得吸光度降低，可見(jiàn)還原劑Na2SO3對(duì)木姜葉柯黃酮化合物有較強(qiáng)的破壞作用?？赡艿脑蚴荖a2SO3使得黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)被破壞[17]，從而導(dǎo)致總黃酮含量下降，隨著Na2SO3濃度的增大，黃酮類(lèi)化合物的呈現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)。所以，在木姜葉柯茶湯的生產(chǎn)、存儲(chǔ)過(guò)程中應(yīng)該避免與還原能力較強(qiáng)的還原劑Na2SO3等接觸。

圖4 還原劑Na2SO3對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響

2.5 氧化劑H2O2對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

從圖5可以看出，與空白樣相比，0～2%濃度處理下隨著H2O2濃度的增大，吸光度不斷下降，這表明木姜葉柯總黃酮在氧化劑的環(huán)境中容易受到破壞，在加工和儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)注意避免與氧化劑的接觸。有文獻(xiàn)[18]表明，總黃酮會(huì)表現(xiàn)出一定的抗氧化性，但研究吸光度呈現(xiàn)出快速下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)榭傸S酮含量過(guò)低。

圖5 氧化劑H2O2對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響

2.6 食品添加劑對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

從圖6可以看出，在不同濃度的山梨酸鉀、苯甲酸鈉、L-抗壞血酸和檸檬酸處理下的木姜葉柯總黃酮吸光度呈平穩(wěn)趨勢(shì)，說(shuō)明在食品添加劑允許使用的濃度范圍內(nèi)，山梨酸鉀、苯甲酸鈉、L-抗壞血酸和檸檬酸對(duì)木姜葉柯總黃酮的穩(wěn)定性影響較小，這和有關(guān)報(bào)道相似[15]。

圖6 食品添加劑對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

2.7 糖類(lèi)對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

從圖7可以看出，2%～10%不同濃度的蔗糖和葡萄糖對(duì)木姜葉柯總黃酮吸光度影響均較小，黃酮的穩(wěn)定性良好，有文獻(xiàn)[19]表明白糖對(duì)黃酮有一定的保護(hù)作用，可能原因是白糖含量增加，溶液中含氧量隨之降低，繼而抑制了黃酮的氧化分解。

圖7 蔗糖和葡萄糖對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響

2.8 金屬離子對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性的影響

木姜葉柯總黃酮的穩(wěn)定性與溶液中的金屬離子關(guān)系較密切，在相同濃度不同金屬離子條件下的木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性差異很大。如表1所示，K+、Na+對(duì)木姜葉柯總黃酮的穩(wěn)定性基本沒(méi)有影響；Mg2+及Ca2+對(duì)木姜葉柯黃酮類(lèi)化合物有較小影響；Al3+離子隨著濃度的升高對(duì)黃酮類(lèi)化合物有比較大的影響，且茶湯由橙黃色變黃紅色后又逐漸消退，可能是發(fā)生了絡(luò)合顯色反應(yīng)[20]；而金屬離子Fe3+、Cu2+對(duì)木姜葉柯總黃酮的穩(wěn)定性有顯著影響，其中Cu2+可引發(fā)褐色絮凝沉淀，而Fe3+引起輕微渾濁并導(dǎo)致茶湯顏色變黑，原因可能是Cu2+與木姜葉柯總黃酮的發(fā)生絡(luò)合沉淀反應(yīng)，而Fe3+與總黃酮的發(fā)生絡(luò)合顯色以及氧化還原反應(yīng)[21-22]。因此，在生產(chǎn)、貯存及使用過(guò)程中應(yīng)避免與含F(xiàn)e3+、Cu2+、Al3+的容器接觸，木姜葉柯茶湯用水應(yīng)盡量去除這些離子。

表1 不同金屬離子對(duì)總黃酮穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論與討論

以木姜葉柯為原料，探究了木姜葉柯茶湯中總黃酮的加工穩(wěn)定性。結(jié)果表明：隨著光照時(shí)間的增長(zhǎng)會(huì)降低木姜葉柯茶湯中總黃酮的穩(wěn)定性；木姜葉柯總黃酮在pH為6左右的弱酸性條件下比較穩(wěn)定，氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3均會(huì)導(dǎo)致木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性下降；食品添加劑苯甲酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸和山梨酸鉀以及糖類(lèi)蔗糖、葡萄糖等對(duì)木姜葉柯總黃酮穩(wěn)定性影響較??；金屬離子中Na+、K+對(duì)木姜葉柯總黃酮無(wú)影響，Mg2+、Ca2+有較小影響，Al3+離子隨著濃度的升高導(dǎo)致木姜葉柯茶湯中的黃酮類(lèi)化合物穩(wěn)定性降低，而Cu2+、Fe3+可分別導(dǎo)致絡(luò)合反應(yīng)以及絡(luò)合和氧化還原反應(yīng)，對(duì)其穩(wěn)定性有明顯影響。研究結(jié)論可為木姜葉柯茶飲加工提供一定的技術(shù)參考。

有研究表明，黃酮類(lèi)有機(jī)分子與金屬元素絡(luò)合形成金屬配合物，不僅有可能增強(qiáng)其原有的活性，甚至還可能產(chǎn)生新的藥理作用[23]，絡(luò)合形態(tài)的黃酮相比游離態(tài)的黃酮有更強(qiáng)的生理活性[24]。研究發(fā)現(xiàn)木姜葉柯黃酮與Cu2+極易生成絡(luò)合物沉淀，未來(lái)將對(duì)木姜葉柯黃酮的金屬絡(luò)合純化法和木姜葉柯黃酮-金屬離子絡(luò)合物的抑菌活性等做進(jìn)一步研究。