楚雄葛根提取工藝優(yōu)化及免疫調(diào)節(jié)活性初探

趙悅，李佳錦，張希，楊婧娟，馬雅鴿*

云南中醫(yī)藥大學(xué)（昆明 650500）

葛根常作為保健食品的原料。葛根中的活性成分有黃酮類(lèi)化合物（3.78%）[1]、香豆素類(lèi)、氨基酸類(lèi)等[2]，而如何提高葛根素提取效率一直是研究熱點(diǎn)。常用的傳統(tǒng)提取法有水提取法、醇提取法[3]和回流法[4]；現(xiàn)代提取工藝有微波輔助提取[5]、超聲提取[6]、酶解法、超臨界流體提取法[7]、半仿生提取法[8]、仿生提取法[9]等。水提和醇提法最為常見(jiàn)，但用這2種方法提取葛根素得率的差異需做進(jìn)一步試驗(yàn)研究。葛根素、黃酮類(lèi)含量常見(jiàn)的檢測(cè)方法有高效液相法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10]、紫外分光光度法[1]等。葛根素具有廣泛的藥理活性，如降壓[11]、降糖[12]、改善骨質(zhì)疏松[13]、保護(hù)心肌細(xì)胞[14]、抗腫瘤[15]、抗血小板聚集等[2,16]。還可用于輔助治療心腦循環(huán)障礙相關(guān)疾病[11,17-18]，及慢性酒精誘導(dǎo)的肝損傷[19]、糖尿病[16,20-23]。近年來(lái)，對(duì)于免疫類(lèi)疾病的研究也成為熱點(diǎn)，試驗(yàn)研究更是涉及細(xì)胞、動(dòng)物、通路等，相關(guān)研究技術(shù)和思路也更加成熟和系統(tǒng)。葛根素也具一定免疫調(diào)節(jié)作用，如葛根素可通過(guò)NF-κB信號(hào)通路減輕高糖誘導(dǎo)的RSC96細(xì)胞炎癥[24]，但研究并不全面。

基于此，試驗(yàn)采用高效液相色譜法[10]測(cè)定楚雄葛根粉中葛根素含量；采用均勻設(shè)計(jì)法[8]，對(duì)葛根素及黃酮的水提和醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化和對(duì)比研究；以小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞為模型，探討2種提取物對(duì)RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楚雄葛根全粉（Chuxiong Radix Puerariae thomsonii Powder，CRPTP，云南省楚雄州姚安縣）；RAW264.7細(xì)胞（RAW購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，源自Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤；sIg-、Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。RAW264.7細(xì)胞不分泌可檢測(cè)到的病毒顆粒，XC斑點(diǎn)形成試驗(yàn)陰性。RAW264.7細(xì)胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖，并且可以抗體依賴(lài)性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細(xì)胞。LPS或PPD處理2的、可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分解紅血球，但對(duì)腫瘤靶細(xì)胞無(wú)作用）。

蘆丁（99.99%，上海源葉生物科技有限公司）；葛根素（99.99%，上海麥克林生物科技有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；脂多糖（LPS，純度≥98%，Solarbio）；CCK-8試劑盒（proteintech）；胎牛血清（BI公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)gibico公司）

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（L5S，上海精密儀器儀表有限公司）；電子天平（CP214，上海奧豪斯儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（SB-5200D，寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（DK-98-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司）；低速離心機(jī)（SC-3614，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（HGZF-Ⅱ/H-101-3，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；超純水儀（LAB-250SY，南京歐鎧環(huán)境科技有限公司）；高效液相色譜儀（HITACHI L2000，美國(guó)安捷倫公司）。

1.3 方法

1.3.1 葛根素和黃酮提取方法

稱(chēng)取5.000 0 g的葛根粉，配好提取液，頻率40 kHz，功率100 W，室溫，超聲5 min，控制不同條件提取，提取物離心15 min，得到葛根提取液。

1.3.1.1 水提法

采用DPS軟件，以葛根素和總黃酮含量為指標(biāo)，進(jìn)行提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）和料液比（X3）的三因素九水平均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)楚雄葛根水提物中葛根素和黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1.2 醇提法

采用DPS軟件，以葛根素和總黃酮含量為指標(biāo)，進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）、料液比（X4）的四因素九水平的均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)楚雄葛根醇提物中葛根素和黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.2 高效液相色譜法測(cè)定葛根素含量

色譜條件：ODSHYPERSIL色譜柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（25∶75，V/V），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。

樣品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取5.000 g葛根粉，置于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 70%的乙醇，在80 ℃水浴鍋中回流提取60 min，提取液以3 000 r/min離心10 min，取上清液，加入70%的乙醇定容至100 mL，待測(cè)。

葛根素含量的測(cè)定：用雙蒸水將100 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品母液，稀釋成質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，80，100，120和200 μg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品使用液。進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)行HPLC測(cè)定。以葛根素含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取4種市售葛根樣品液，進(jìn)樣量20 μL，根據(jù)峰面積計(jì)算葛根素含量[22]。

1.3.3 分光光度法測(cè)定葛根素含量

用30%乙醇配制100 mg/mL葛根素標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋成質(zhì)量濃度為0，10，20，30，40，50，60，80，100和120 μg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品使用液。在波長(zhǎng)250 nm處，測(cè)定吸光度。以葛根素濃度為橫坐標(biāo)，250 nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)250 nm處，測(cè)定葛根提取液的吸光度，將吸光度代入葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中葛根素含量。

1.3.4 分光光度法測(cè)定總黃酮含量

用80%乙醇體積分?jǐn)?shù)配制質(zhì)量濃度100 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液母液，稀釋成質(zhì)量濃度為0，20，30，40，50，60，70和80 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列使用液。在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)量吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，A510nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在波長(zhǎng)510 nm處，測(cè)定葛根提取液的吸光度，將吸光度代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中黃酮含量。

1.3.5 葛根粉水提物和葛根粉醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖作用的影響

將長(zhǎng)勢(shì)良好的RAW264.7細(xì)胞以1×105CFU/mL的密度取200 μL接種到96孔板[25]，在5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。設(shè)置空白組（NG）、陽(yáng)性對(duì)照組（LPS）、給藥組，給藥組分別加入葛根水提物（pueraria aqueous extract，PAE）和葛根醇提物（pueraria ethanol extract，PEE）且分別設(shè)低、中、高劑量組，濃度分別為50，200和800 μg/mL，每組5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，并加培養(yǎng)液至100 μL，將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度，按式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖率，即細(xì)胞活力。

1.3.6 葛根水提物及醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬作用的影響

將長(zhǎng)勢(shì)良好的RAW264.7細(xì)胞以1×105CFU/mL的密度，取200 μL接種到96孔板，在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)液，設(shè)置空白組（NG）、陽(yáng)性對(duì)照組（LPS）、給藥組，給藥組分別加入PAE和PEE，且分別設(shè)低、中、高劑量組，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗1次，加入50 μL中性紅染色液，染色20 min，棄去染色液，用PBS緩沖液清洗2次，在顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞染色情況。加入200 μL中性紅檢測(cè)裂解液，室溫振蕩裂解10 min，裂解50 min，用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定吸光度，按式（2）計(jì)算吞噬率。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用DPS 9.50軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合出變量之間的方程，用于最優(yōu)條件的選擇，其他所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。數(shù)據(jù)采用一般線性模型和單因素方差分析，組間差異采用Duncan’s multiple range檢驗(yàn)，采用SPSS軟件。每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次。差異顯著，P＜0.05，差異極顯著，P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC法測(cè)定種植楚雄葛根全粉中葛根素含量結(jié)果與分析

不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度測(cè)得葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=51.853x+114.48，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好，可用于葛根素含量10～200 μg/mL的樣品測(cè)定，見(jiàn)圖1。根據(jù)色譜條件測(cè)定楚雄葛根全粉中葛根素峰面積，見(jiàn)圖2，計(jì)算出樣品中葛根素含量，如表1所示。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的高效液相色譜圖

圖2 楚雄葛根全粉中葛根素含量的高效液相色譜圖

表1 楚雄葛根全粉中葛根素含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)楚雄姚安的葛根全粉中葛根素含量的測(cè)定，結(jié)果得出其葛根素含量為4.05 mg/g。

2.2 楚雄葛根中葛根素和黃酮水提工藝的優(yōu)化結(jié)果與討論

測(cè)得葛根素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.033 5x+0.115 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 2，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好，可用于葛根素含量10～100 μg/mL的樣品測(cè)定。蘆丁含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.011 1x+0.003 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 4，說(shuō)明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性良好，可用于黃酮含量20～80 μg/mL的樣品測(cè)定。楚雄葛根水提物中葛根素和黃酮含量如表2所示。

表2 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)水提葛根中葛根素和黃酮測(cè)定結(jié)果（以干重計(jì)）

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中二次多項(xiàng)式逐步回歸分析法對(duì)在各試驗(yàn)方案下所得含量進(jìn)行分析，得到水提物葛根素和黃酮含量回歸方程：Y1=557.96+82.11X1+63.58X3-29.41X22-30.60X32+28.14X1X3+79.28X2X3；Y2=647.10-250.68X2-61.08X3+30.48X22-5.85X1X2+2.87X1X3+10.79X2X3。

Y1相關(guān)系數(shù)R=0.996 7，顯著水平P=0.019 4，Y2相關(guān)系數(shù)R=0.994，顯著水平P=0.035 6，說(shuō)明2個(gè)回歸方程相關(guān)性較好。通過(guò)回歸方程分析，預(yù)測(cè)的葛根素水提的最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間135 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶50（g/mL），葛根素含量最高提取值為1 156.05 μg/g。預(yù)測(cè)的黃酮水提的最優(yōu)工藝條件為提取時(shí)間15 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶48（g/mL），黃酮含量最高提取值為5 221.02 μg/g。

綜合考慮，在時(shí)間135 min、溫度92.7 ℃、料液比1∶50（g/mL）條件下，各進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，水提物葛根素平均含量為809.42±11.32 μg/g，黃酮平均含量為3 848.08±23.43 μg/g。將葛根素和黃酮的平均值與最高含量預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，即此條件下所得葛根素含量為預(yù)測(cè)值的70.00%，黃酮含量為預(yù)測(cè)值的73.70%。2個(gè)預(yù)測(cè)值誤差較大，但仍能接受。

2.3 楚雄葛根中葛根素和黃酮醇提工藝的優(yōu)化結(jié)果與討論

楚雄葛根醇提物中葛根素和黃酮含量如表3所示。

表3 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)醇提葛根中葛根素和黃酮測(cè)定結(jié)果（以干重計(jì)）

利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中二次多項(xiàng)式逐步回歸分析法對(duì)在各試驗(yàn)方案下所得含量進(jìn)行分析，得醇提葛根素和黃酮含量回歸方程：Y1=-172.64+155.48X3+755.11X4-32.46X32-46.06X42-4.85X1X2+1.05X1X4-0.30X3X4；Y2=666.16-134.67X1-26.00X2-12.30X4+7.61X12+3.68X22+1.82X42-0.11X1X4

Y1相關(guān)系數(shù)R=1，顯著水平P=0.05，Y2相關(guān)系數(shù)R=1，顯著水平P=0.002 9，說(shuō)明2個(gè)回歸方程相關(guān)性較好。通過(guò)回歸方程分析可知，在此方案下醇提葛根素的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)90%、提取時(shí)間15 min、溫度33.5 ℃、料液比1∶48（g/mL）。醇提黃酮的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間135 min、溫度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）。在此工藝條件下，預(yù)測(cè)的葛根素含量和黃酮含量最高提取值分別為638.67和3 136.78 μg/g?？蓪?duì)此試驗(yàn)方案下所得最佳指標(biāo)的試驗(yàn)方案進(jìn)行驗(yàn)證。

綜合考慮，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間135 min、溫度60 ℃、料液比1∶50（g/mL）條件下，分別進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，葛根素含量為590.21±21.44 μg/g，黃酮含量為3 089.72±45.36 μg/g。分別將葛根素和黃酮的平均值與最高含量預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，即此條件下所得葛根中葛根素含量為預(yù)測(cè)值的92.41%，黃酮含量為預(yù)測(cè)值的98.50%。在誤差允許的范圍內(nèi)驗(yàn)證成功。

在水提法和醇提法2種最優(yōu)工藝條件下，水提物葛根素平均含量為809.42±11.32 μg/g，黃酮平均含量為3 849.08±23.43 μg/g，醇提物葛根素平均含量為590.21±21.44 μg/g，黃酮平均含量為3 089.72±45.36 μg/g。結(jié)果表明在最佳工藝條件下水提所得到的葛根素和黃酮含量都略高，但是差異不顯著。

2.4 PAE及PEE對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用影響

由圖3（A）可知，與NG組比較，LPS組，100，200和400 μg/mL PAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞的促進(jìn)作用具有顯著性差異，提示PAE對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖均有一定促進(jìn)作用。由圖3（B）可知，與空白組比較，LPS組，200，400和800 μg/mL葛根水提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的促進(jìn)作用具有顯著性差異，PEE對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖均有一定促進(jìn)作用。同時(shí)，隨著濃度的增加，PAE和PEE對(duì)細(xì)胞的增殖作用都呈現(xiàn)先上升后降低趨勢(shì)，但是兩者增殖作用的差別不顯著。PAE最佳濃度為200 μg/mL，PEE最佳濃度為400 μg/mL。

圖3 PAE（A）和PEE（B）對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活力的影響

2.5 PAE和PEE對(duì)RAW264.7細(xì)胞中性紅吞噬作用影響

由圖4可知，與NG組比較，陽(yáng)性組能極顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，PAE濃度50和200 μg/mL，PEE濃度200 μg/mL時(shí)能極顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，且隨著濃度的增加，對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的作用呈先上升后下降趨勢(shì)。低濃度時(shí)，PAE大于PEE；高濃度時(shí)，PAE小于PEE，但兩者吞噬作用的差別不顯著。結(jié)果表明PAE及PEE均能有效激活RAW264.7細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用，而且兩者的差異不顯著。

圖4 PAE和PEE對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬作用的影響（平均值）

3 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，水提法在最優(yōu)提取工藝下所得葛根素和黃酮含量都略高。由此可見(jiàn)，不同提取方法下的葛根素得率存在一定差異，因此，實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)確定最佳提取方法，才能提高生產(chǎn)效率，避免原料、人工、資金等的浪費(fèi)。通過(guò)PAE和PEE刺激RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)兩者在促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖和吞噬能力方面不存在顯著差異，但試驗(yàn)并未進(jìn)一步研究葛根提取物提高免疫的機(jī)制，后續(xù)試驗(yàn)可將細(xì)胞因子及相關(guān)通路中蛋白的表達(dá)作為檢測(cè)指標(biāo)，深入探索葛根提取物通過(guò)調(diào)控具體通路及通路蛋白發(fā)揮免疫作用的機(jī)理。綜上，實(shí)際生產(chǎn)中可用PAE作為原料，開(kāi)發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)功能的食品，以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求，為功能食品工藝研究、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定和開(kāi)發(fā)其免疫相關(guān)功能食品奠定理論基礎(chǔ)。