食品質(zhì)量與安全專業(yè)探究性試驗(yàn)教學(xué)的實(shí)踐
——以肉制品基因組DNA提取為例

張麗*，王小會(huì)，楊瑤，方瑩，王海英

中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)試驗(yàn)室（武漢 430074）

為主動(dòng)擁抱新科技革命和產(chǎn)業(yè)變革的機(jī)遇與挑戰(zhàn)，我國教育部、中央政法委、科技部等13個(gè)部門于2019年4月29日在天津聯(lián)合啟動(dòng)“六卓越一拔尖”計(jì)劃2.0，全面推進(jìn)新工科、新醫(yī)科、新農(nóng)科、新文科（簡(jiǎn)稱“四新”）建設(shè)，以提高高校服務(wù)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展能力[1]。新農(nóng)科要用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)改造升級(jí)涉農(nóng)專業(yè)，助力打造天藍(lán)水凈、食品安全、生活恬靜的美麗中國[2]。實(shí)踐教學(xué)是理論聯(lián)系實(shí)際、培養(yǎng)學(xué)生掌握科學(xué)方法和提高動(dòng)手能力的重要平臺(tái)，是培養(yǎng)具有創(chuàng)新意識(shí)的高素質(zhì)現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)人員的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)實(shí)踐教學(xué)存在試驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容陳舊、方法單一的問題，學(xué)生在固定的操作步驟下機(jī)械地完成試驗(yàn)過程，缺乏主動(dòng)積極思考的機(jī)會(huì)。要提高學(xué)生的綜合素質(zhì)，培養(yǎng)學(xué)生解決現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)發(fā)展中科學(xué)問題的能力，為現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)培養(yǎng)創(chuàng)新型、應(yīng)用型人才，需要對(duì)實(shí)踐教學(xué)進(jìn)行深入的改革。研究以肉制品基因組DNA提取為例對(duì)食品質(zhì)量與安全專業(yè)探究性實(shí)踐教學(xué)的改革進(jìn)行探索，為本專業(yè)的實(shí)踐教學(xué)改革提供示范。

肉及肉制品是人類飲食的重要組成部分，肉及肉制品的質(zhì)量與安全關(guān)乎人們的身體健康和生命安全[3]。然而肉制品摻假屢禁不止，肉制品以次充好時(shí)有發(fā)生。2013年歐洲馬肉冒充牛肉事件，沃爾瑪濟(jì)南泉城分店銷售的五香牛肉摻狐貍和貉肉，上海雞肉染色變牛肉事件等造成了嚴(yán)重的社會(huì)影響[4-5]。為了防止此類肉制品摻假事件發(fā)生，需要建立準(zhǔn)確可靠的鑒定方法?；贒NA的檢測(cè)方法近年來獲得了飛速的進(jìn)步以及廣泛的應(yīng)用。動(dòng)物所有的組織細(xì)胞中都含有DNA，經(jīng)過加工后的肉制品仍然可以通過DNA來進(jìn)行鑒定?；贒NA的檢測(cè)方法的實(shí)施首先需要提取高質(zhì)量的基因組DNA[6]。目前，在肉制品樣品的前處理以及基因組DNA的提取方面，不同的研究團(tuán)隊(duì)有不同的處理方式。常規(guī)提取DNA的方法有SDS法、試劑盒法、異硫氰酸胍法、CTAB法、濃鹽法等[7-8]。在樣品的前處理方面，Kim等[9]、Amaral等[10]、Meira等[11]采用121 ℃高壓滅菌處理；張菊[12]、Cai等[13]采取80 ℃、72 h的烘干處理；Hou等[14]進(jìn)行100 ℃和121 ℃烘干處理。哪一種基因組DNA提取方法效果更好？哪一種樣品前處理方式提取的基因組DNA質(zhì)量更好？圍繞這些問題展開資料檢索、試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果分析等科研探索步驟，以激發(fā)學(xué)生的主觀能動(dòng)性，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

2）生活習(xí)性。桃小食心蟲在渭北果區(qū)每年發(fā)生1～2代，以老熟幼蟲在土壤內(nèi)結(jié)繭越冬。一般5月下旬至6月上旬越冬幼蟲破繭出土，成蟲多產(chǎn)卵于果實(shí)梗（萼）洼處。幼蟲孵化后，蛀入果實(shí)，在果實(shí)內(nèi)蛀食20天左右，老熟后咬破果皮，脫果而出；脫果早的在土表作夏繭化蛹發(fā)生第2代，脫果晚的入土越冬。6月下旬至7月上中旬出現(xiàn)第1代成蟲，8月上中旬出現(xiàn)第2代幼蟲，在采果前大部分脫果。

生鮮牛肉、豬肉、羊肉、鴨肉等均購于附近超市，洗凈后剔除多余的結(jié)締組織和脂肪，切成小塊分裝，放于-20 ℃冰箱備用。

1.1.2 儀器與試劑

負(fù)責(zé)該段施工的班長(zhǎng)趙華寧和黨員張維柱得知這一消息，心急如焚。他倆忘記了一天的疲勞，丟下手中的飯碗，火速趕到現(xiàn)場(chǎng)。由于管線已下溝埋入泥土中，如用鐵鍬挖土，一不小心就會(huì)破壞已防腐的管線。

Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液，上海翊圣生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)為11201ES03）；氯仿、乙醇、異丙醇、氯化鈉（分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司）；EDTA、Tris-HCl、SDS、CTAB（分析純，購于Sigma-Aldrich）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

4) 按4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，使蛋白/SDS復(fù)合物沉淀出來。

RW20懸臂式攪拌器（IKA）；JK-WB-400三孔水浴鍋（上海精科）；MLS3780高壓滅菌鍋（三洋）；BSC-1304ⅡB2生物安全柜（蘇凈安泰）；5415D微型臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf）；CFXConnect熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；NanoPhotometer-N80超微量紫外分光光度計(jì)（Implen）；UVCI-1100凝膠成像系統(tǒng)（major science）。

1.2.2 DNA提取方法的比較

經(jīng)過文獻(xiàn)檢索與比對(duì)，選擇改良CTAB法、高鹽法、改良SDS法三種具有代表性的基因組DNA提取方法進(jìn)行比較研究。

1.2.2.1 改良CTAB法

1.2.2.3 改良SDS法

2) 加入5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，渦旋振蕩30 s。

3) 將離心管轉(zhuǎn)入65 ℃水浴鍋，溫浴60 min。

4) 加入5 μL 10 mg/mL RNase A，充分混勻，于65℃水浴10 min。

綠化荒山、改善區(qū)域生態(tài)環(huán)境是蘭州石化的“綠色約定”。經(jīng)過幾十年的努力，蘭州石化將蘭州市南山東起馬耳山溝底、西到大元峁一帶的2500畝荒山建成了省級(jí)森林公園。如今，這里春有花、夏有蔭、秋有果、冬有青，成為市民休閑健身的理想場(chǎng)所。

5) 按13 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的2 mL離心管，加入800 μL氯仿，顛倒混勻。

6) 重復(fù)步驟（5），取上清液，加入2倍體積沉淀緩沖液（5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl），室溫下放置60 min。

7) 按13 000 r/min離心10 min，棄上清液。

8) 加入175 μL 1.2 mol/L NaCl溶解沉淀。

9) 加入等體積的氯仿，渦旋振蕩30 s，按13 000 r/min離心10 min。

10) 吸取上清液，加入0.6倍體積的異丙醇，室溫下放置10 min。

11) 按13 000 r/min離心10 min，棄上清液，用750 μL 70%乙醇洗滌DNA沉淀。

當(dāng)然，以上對(duì)被害人陳述進(jìn)行證偽思維審查的前提是被害人必須出庭接受質(zhì)證，否則僅對(duì)被害人陳述的筆錄進(jìn)行書面審查則審查不全面或?qū)彶楦纱噙M(jìn)行不下去。有鑒于此，人民法院在刑事審判中必須通知被害人出庭接受質(zhì)證。

12) 按13 000 r/min離心10 min，棄上清液，在37℃干燥DNA沉淀30 min。

13) 加入100 μL提前預(yù)熱的ddH2O溶解DNA。

14) 將提取好的DNA，儲(chǔ)存于4 ℃，若要長(zhǎng)期存放，放置于-20 ℃。

1) 將牛肉剔除結(jié)締組織，稱取5 g切碎，放入烘干機(jī)中80 ℃烘干72 h，再將其磨成牛肉粉[13]。

1) 取50 mg粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，向離心管中加入400 μL DNA提取液[0.4 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），2 mmol/L EDTA（pH 8.0），1%SDS，20 μg/mL胰RNA酶]，用漩渦混合器渦旋30 s。

2) 加入8 μL 20 mg/mL蛋白酶K（終濃度400 μg/mL）。充分混勻后，放入55～65 ℃水浴鍋中溫浴2 h。期間不停顛倒混勻，直至溶液透明。

現(xiàn)代工業(yè)經(jīng)濟(jì)不斷提升，為我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)，同時(shí)環(huán)保問題隨之顯現(xiàn)，成為了重大的環(huán)境污染源之一，所以，必須踐行制造生產(chǎn)、環(huán)保優(yōu)先的和諧發(fā)展理念［6］。

紫外分光光度法：每份DNA樣品取1.5 μL，利用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA的A260/280，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。當(dāng)A260=1時(shí)dsDNA濃度約為50 μg/mL，純度較好的DNA的A260/280在1.7～1.9之間。如果比值偏高，則說明有RNA未除干凈或基因組DNA降解；如果比值偏低，則說明存在蛋白質(zhì)和酚類等殘留[12]。

4) 加入等體積異丙醇，混勻，離心管放置在-20℃ 1 h。

被并購方：雅士利，雅士利創(chuàng)始于1983年，是中國嬰幼兒奶粉產(chǎn)業(yè)中的領(lǐng)導(dǎo)品牌，該企業(yè)還從事營養(yǎng)產(chǎn)品的開發(fā)與發(fā)展。

5) 按10 000 r/min離心15 min，棄上清液，保留底部乳白色沉淀。

6) 用250 μL 70%乙醇洗滌沉淀，靜置20 min。

7) 按10 000 r/min離心5 min，棄上清液，風(fēng)干DNA沉淀。

8) 向離心管中加入100 μL ddH2O溶解沉淀。將提取好的DNA，儲(chǔ)存于4 ℃，若要長(zhǎng)期存放，放置于-20 ℃。

由所求得的相對(duì)重要度可知，人力資源政策對(duì)精益生產(chǎn)實(shí)施結(jié)果的影響最大，其次依次是企業(yè)績(jī)效管理系統(tǒng)、持續(xù)改善思想等。由影響因素的相對(duì)重要度排序得，在企業(yè)實(shí)施精益生產(chǎn)時(shí)，最應(yīng)該注意的就是企業(yè)的人力資源政策，好的人力資源政策可以凝聚員工的向心力，使員工可以更好地全身心參與精益改革的過程中去，推動(dòng)改革的成功。

1) 取50 mg粉末轉(zhuǎn)入2 mL的滅菌離心管中。加入100 μL水和250 μL CTAB提取緩沖液（20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，20 mmol/L Na2EDTA），置于渦旋振蕩器上充分振蕩至徹底懸浮。

1) 取50 mg粉末轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，加入600 μL預(yù)冷的TE（pH 8.0），然后向裂解液中加60 μL 10% SDS溶液和10 μL 20 mg/mL的蛋白酶K，于55℃放置3～16 h。

2) 將消化液降至室溫，加入10 μL無DNase的RNase，于37 ℃放置15～60 min。

3) 將樣品降至室溫，然后加入200 μL的醋酸鉀溶液（3 mol/L，pH 4.8），在振蕩器上劇烈振蕩20 s，使其充分混合。

取2 g待測(cè)樣本，剔除結(jié)締組織和脂肪，將其切成小塊并放入研缽，向研缽中倒入液氮，迅速研磨至樣品成細(xì)小的粉末狀為止。

5) 小心將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）溶液，充分混合后，按12 000 r/min離心5 min，多次重復(fù)此操作步驟，直到兩相中間不能看到明顯的變性蛋白質(zhì)為止。

6) 將上清液轉(zhuǎn)移到加有600 μL異丙醇的新離心管中，充分混合后在室溫下按12 000 r/min離心5 min，收集DNA沉淀。

7) 將DNA沉淀溶解于100 μL ddH2O中。將提取好的DNA，儲(chǔ)存于4 ℃，若要長(zhǎng)期存放，放置于-20 ℃。

1.2.3 前處理方法的比較

對(duì)樣品進(jìn)行前處理可以減少水、脂肪等成分對(duì)肉制品定量檢測(cè)的干擾。在進(jìn)行干燥處理的同時(shí)需避免對(duì)基因組DNA提取質(zhì)量產(chǎn)生影響。根據(jù)查閱文獻(xiàn)中所使用的方法，最終選取以下5種前處理方法進(jìn)行比較，每種處理重復(fù)提取2次。

1.2.2.2 高鹽法

2) 將牛肉剔除結(jié)締組織，稱取5 g切碎，放入烘干機(jī)中100 ℃烘干至恒重，再向研缽中加入液氮，將樣品研磨成粉末[15]。

3) 將牛肉剔除結(jié)締組織，稱取5 g切碎，放入烘干機(jī)中60 ℃烘干72 h，再將其磨成牛肉粉[16]。

4) 將牛肉剔除結(jié)締組織，稱取5 g切碎，用蒸餾水洗凈，放入蒸餾水中浸泡過夜后，放入烘干機(jī)中70 ℃烘干4 h，將樣品研磨成粉末[17]。

5) 將牛肉剔除結(jié)締組織，稱取5 g切碎，在121 ℃和150 kPa的高壓鍋中加熱15 min，再將其磨成牛肉粉[9]。

1.2.4 DNA提取質(zhì)量評(píng)估

3) 加入300 μL 6 mol/L NaCl，在旋渦混合器上高速混合30 s，按10 000 r/min離心30 s，移上清液到另一離心管中。

瓊脂糖凝膠電泳法：每份DNA樣品取2.5 μL，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶。基因組DNA的濃度越高，亮度越亮；如果泳道上有彌散條帶，則表明基因組DNA有降解；如果點(diǎn)樣孔很亮，表明基因組DNA中有蛋白質(zhì)殘留[8]。

PCR法：采用真核生物18S rDNA通用引物對(duì)所稀釋的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，引物序列為18S-EUKF：AGCCTGCGGCTTAATTTGAC，18S-EUKR：CAACTAAGAACGGCCATGCA，擴(kuò)增片段為120 bp。實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系：2×Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，基因組DNA模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，讀板，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增Ct（閾值循環(huán)數(shù)，Cycle threshold）值判斷基因組DNA的可擴(kuò)增性，擴(kuò)增曲線典型、Ct值較低，則表明基因組DNA質(zhì)量較好[16]。

根據(jù)工程的復(fù)雜程度，對(duì)設(shè)計(jì)資質(zhì)提出具體要求，如對(duì)提灌站、壓力輸水管道、100 m以上的深井、規(guī)模較大的建筑物等技術(shù)含量較高的工程必須聘請(qǐng)有相應(yīng)資質(zhì)的單位進(jìn)行設(shè)計(jì)，從源頭抓好工程質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法比較

2.1.1 紫外分光光度法評(píng)估

將1.2.2小節(jié)所述三種方法提取的鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA采用紫外分光光度法測(cè)定濃度與純度。檢測(cè)結(jié)果如表1所示。從濃度上進(jìn)行比較，改良SDS法提取的濃度最高，改良CTAB法提取的濃度最低，高鹽法居中。從純度上比較，改良CTAB法所提取出的DNA的A260/280基本都接近2.0，改良SDS法所提取出的DNA的A260/280大多低于1.7，高鹽法所提取的DNA的A260/280在1.7～1.9之間，相對(duì)其他兩種方法較為理想。

配置根保護(hù)主要為了防止新加入到網(wǎng)絡(luò)中的交換機(jī)被選舉為根交換機(jī)，從而影響網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定.當(dāng)交換機(jī)端口啟用根保護(hù)后，該端口將會(huì)成為指定端口，并且在任何情況下也不會(huì)被選舉為根端口.在這里我們以交換機(jī)SW2為例，給出根保護(hù)的詳細(xì)配置命令.

2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳法評(píng)估

綜上所述，在開展小學(xué)語文教學(xué)的過程中，合理地借助網(wǎng)絡(luò)資源開展教學(xué)，不僅能夠開拓學(xué)生的學(xué)習(xí)層面，提升學(xué)生的人文素養(yǎng)，同時(shí)也能夠提高學(xué)生的實(shí)踐能力以及表達(dá)能力，促進(jìn)學(xué)生的綜合發(fā)展。因此，在開展教學(xué)的過程中，教師需要下載網(wǎng)絡(luò)資源，并對(duì)其進(jìn)行分析篩選，選擇適合學(xué)生接受的知識(shí)開展教學(xué)，保證學(xué)生的學(xué)習(xí)質(zhì)量，促進(jìn)學(xué)生綜合素養(yǎng)的形成。

將提取的鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。三種方法提取出來的基因組DNA都有明亮的主帶，但改良SDS法提取的基因組DNA條有明顯的彌散條帶，表明基因組DNA降解較為嚴(yán)重。高鹽法和改良CTAB法提取的基因組DNA在瓊脂糖凝膠電泳中條帶差別不大。

圖1 三種方法提取鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法評(píng)估

4.家長(zhǎng)的榜樣作用不夠。父母是孩子的第一任老師，是孩子成長(zhǎng)的榜樣。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，有許多的學(xué)困生父母，都有價(jià)值觀不正確或生活習(xí)慣差的問題。

用真核生物18S rDNA通用引物對(duì)所提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線及其擴(kuò)增Ct值如圖2和表2所示。圖2表明3種方法所提取的基因組DNA對(duì)18S rDNA引物均有典型擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增獲得的Ct值進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，改良CTAB法、高鹽法、改良SDS法提取的DNA在Ct值之間具有顯著差異（P＜0.05）。SDS法的Ct值最低，改良CTAB法的Ct值最高，高鹽法居中。這與紫外分光光度法測(cè)得的DNA濃度結(jié)果較為一致，DNA濃度越高，Ct值則越低。結(jié)合圖1中瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，雖然改良SDS法提取的基因組DNA有較為明顯的降解，但是該降解并未對(duì)18S rDNA 120 bp短片段靶標(biāo)的擴(kuò)增造成影響。Kim等[9]研究也表明短片段靶標(biāo)適合于DNA有降解的檢測(cè)。

圖2 三種方法提取鴨、豬、牛、羊肉基因組DNA 18S rDNA定量擴(kuò)增曲線

表2 不同基因組DNA對(duì)18S rDNA擴(kuò)增Ct值

2.2 前處理方法比較

2.2.1 紫外分光光度法評(píng)估

整個(gè)教學(xué)設(shè)計(jì)由導(dǎo)入、體驗(yàn)和歸納三個(gè)階段組成。在導(dǎo)入階段，以一部學(xué)生已經(jīng)非常熟悉的電影展開回顧并提問，在這一過程中導(dǎo)入本課主題的概述；在體驗(yàn)階段，教師將電影內(nèi)容分層次再現(xiàn)，并布置合理的學(xué)習(xí)任務(wù)，要求學(xué)生模仿完成練習(xí)并加以運(yùn)用；在歸納階段，學(xué)生根據(jù)教師引導(dǎo)，對(duì)所學(xué)虛擬語氣的三個(gè)基本形態(tài)予以歸納總結(jié)，形成系統(tǒng)知識(shí)，進(jìn)一步提高他們的自學(xué)能力。

利用高鹽法提取經(jīng)過5種不同前處理方法的牛肉，將提取后的DNA用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定3次，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。從60 ℃至121 ℃提取的DNA濃度越來越低，證明隨著處理溫度的提高，DNA的得率降低。其中，121 ℃所提取的基因組DNA的A260/A280比值小于1.7，且濃度較低，說明經(jīng)過高溫高壓處理后，提取的DNA降解嚴(yán)重，質(zhì)量較差。

表3 不同處理方法提取?；蚪MDNA純度與濃度測(cè)定結(jié)果

2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳法評(píng)估

將經(jīng)過5種不同前處理方法的牛肉基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)60 ℃處理后提取的基因組DNA總體上清晰完整，條帶明亮。70，80和100 ℃所提取的基因組DNA條有明顯的彌散條帶。121 ℃處理后所提取的基因組DNA無明顯可見的基因組DNA條帶，表明基因組DNA隨著處理溫度的提高逐漸發(fā)生降解。

圖3 牛肉不同處理方法提取DNA電泳結(jié)果

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法評(píng)估

用真核生物18S rDNA通用引物對(duì)60，70，80，100和121 ℃ 5種不同前處理方法提取到的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增Ct值及其擴(kuò)增曲線如表4和圖4所示。結(jié)果表明所提取的基因組DNA對(duì)引物18S rDNA引物均有擴(kuò)增，且Ct值均小于36，表明提取的樣品基因組DNA均具有可擴(kuò)增性，能夠滿足PCR檢測(cè)的需求。其中60 ℃處理后提取的DNA的Ct值最低，這與紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)得的濃度最高相符。60，70和80 ℃處理總體上對(duì)DNA的Ct值影響較小。100 ℃和121 ℃處理后，Ct值有明顯的增大。

表4 不同處理?；蚪MDNA對(duì)18S rDNA擴(kuò)增Ct值

圖4 不同處理方式提取牛基因組DNA 18S rDNA定量擴(kuò)增曲線

3 結(jié)論與討論

分別使用改良CTAB法、高鹽法、改良SDS法三種不同的提取方法提取鴨、豬、牛、羊肉的基因組DNA，并且采用五種不同的方式對(duì)牛肉進(jìn)行前處理。對(duì)所提取的基因組DNA分別通過紫外分光光度法測(cè)定A260/280、瓊脂糖凝膠電泳法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定Ct三種不同的方法評(píng)估DNA質(zhì)量。研究結(jié)果表明，高鹽法提取的基因組DNA沒有明顯的DNA降解和蛋白質(zhì)殘留，質(zhì)量較好。且高鹽法在操作過程中不涉及氯仿、異戊醇等有毒有害試劑，操作步驟和時(shí)間也較短，在本科試驗(yàn)教學(xué)中優(yōu)先推薦該方法的使用。在樣品的前處理方面，60，70，80，100和121 ℃的不同肉制品前處理方式中，60 ℃處理所提取的DNA濃度最高，質(zhì)量也較好。研究結(jié)果為快速、簡(jiǎn)單地提取肉制品基因組DNA提供參考，為基于基因組DNA的肉制品成分鑒定提供技術(shù)支持。

此研究是食品質(zhì)量與安全專業(yè)探究性試驗(yàn)教學(xué)改革實(shí)踐。在整個(gè)實(shí)踐教學(xué)過程中，首先需要檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，查閱肉制品基因組DNA提取的方法、了解各種方法的基本原理，確定試驗(yàn)方案。文獻(xiàn)檢索與文獻(xiàn)分析實(shí)踐過程，有助于培養(yǎng)大學(xué)生的信息素養(yǎng)。然后要掌握評(píng)估基因組DNA質(zhì)量的方法，這些方法在理論課中多有提及，但是學(xué)生往往一知半解，通過實(shí)踐操作，可以加深學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解與應(yīng)用。綜合使用三種不同的評(píng)價(jià)方法來對(duì)基因組DNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，有助于學(xué)生對(duì)知識(shí)的融會(huì)貫通與綜合運(yùn)用，讓學(xué)生獲得完整的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，以防止學(xué)生的知識(shí)點(diǎn)零散、知識(shí)體系窄化脫離實(shí)際應(yīng)用。此研究以肉制品基因組DNA提取為例對(duì)實(shí)踐教學(xué)進(jìn)行改革，在凸顯教學(xué)內(nèi)容的系統(tǒng)性及完整性的同時(shí)，強(qiáng)調(diào)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)性，有助于提高學(xué)生的實(shí)踐能力和創(chuàng)新思維能力，培養(yǎng)符合現(xiàn)代化社會(huì)發(fā)展需求的創(chuàng)新型、應(yīng)用型人才。