復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒制備及安全性評(píng)價(jià)

劉磊

1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司（石家莊 051430）；2.京津冀聯(lián)創(chuàng)藥物研究（北京）有限公司（北京 100025）

視疲勞的產(chǎn)生是眼或全身器質(zhì)性因素與精神心理因素相互交織形成的結(jié)果[1-2]，通常以患者自覺(jué)眼部癥狀為突出表現(xiàn)，因此，在臨床上又常稱(chēng)為眼疲勞綜合癥。近年來(lái)，隨著視屏終端設(shè)備和3D立體影像的普及和現(xiàn)代社會(huì)工作生活節(jié)奏的加快，視疲勞人群的范圍也在不斷擴(kuò)大[3-4]。視疲勞成為影響人們生活、工作及身體健康的一大因素。具有緩解視疲勞功能的保健食品正逐漸成為市場(chǎng)焦點(diǎn)[5]，因此具有緩解視疲勞功能的保健食品投放市場(chǎng)，將為眾多視疲勞者帶來(lái)改善身體狀況的健康食品。

研究表明，藍(lán)莓提取物花青素對(duì)視物模糊、眼干澀、明視持久度及總有效率有明顯改善，可以起到緩解視疲勞的作用[6-7]。葉黃素存在于人體眼部所有組織中，但人體不能合成，只能通過(guò)攝入補(bǔ)充。研究表明葉黃素有助于視覺(jué)系統(tǒng)的發(fā)育，可提高視覺(jué)表現(xiàn)和低照明條件下的空間辨別度，對(duì)非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視力有改善作用[8-11]。葉黃素和越橘提取物均具有緩解視疲勞的保健功效，二者復(fù)合使用具有協(xié)同增效的作用[12-13]。張莉華等[14]研究發(fā)現(xiàn)葉黃素、歐洲越橘提取物、藍(lán)莓粉等制成的咀嚼片，可明顯減輕視疲勞癥狀。葡萄籽提取物富含原花青素，有研究指出葡萄籽提取物中原花青素可能因其抗氧化性有助于預(yù)防與氧化應(yīng)激相關(guān)的白內(nèi)障[15]。木糖醇是食品中常用的甜味劑，其甜度與蔗糖相當(dāng)，具有清涼感。因其具有防齲齒、不升糖等功效而被廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、無(wú)糖食品等各領(lǐng)域[16]。因此試驗(yàn)選用木糖醇作為甜味劑。

藍(lán)莓粉、越橘濃縮粉、葉黃素、維生素A醋酸酯、維生素B6、葡萄糖酸鋅、亞硒酸鈉、木糖醇、葡萄籽提取物均具有緩解疲勞的功效，因此通過(guò)這幾種原料的復(fù)配，旨在開(kāi)發(fā)一款具有緩解視疲勞功效的保健食品。通過(guò)查閱中醫(yī)藥理論及科學(xué)文獻(xiàn)，試驗(yàn)原料無(wú)配伍禁忌，單個(gè)原料及用量具有安全性，但配伍后安全性尚沒(méi)有理論依據(jù)，因此進(jìn)一步對(duì)復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒進(jìn)行毒理安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，為其食用提供安全性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓粉、越橘濃縮粉、葉黃素、葡萄籽提取物、維礦預(yù)混料（維生素A醋酸酯5 000 μg/g、維生素B675 mg/g、葡萄糖酸鋅100 mg/g、亞硒酸鈉500 μg/g、麥芽糊精）、麥芽糊精、木糖醇（均為SW公司）。

由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SD大鼠（質(zhì)量合格證號(hào)：61001700001708，61001700001904）、昆明種小鼠（質(zhì)量合格證號(hào)：61001700001747，61001700001743），均為SPF級(jí)。動(dòng)物飼料、墊料（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。試驗(yàn)動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)SYXK（陜）2012-006，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～65%。

生化試劑盒（深圳邁瑞生物有限公司）；血細(xì)胞測(cè)定試劑；疊氮化鈉；1,8-二羥基蒽醌；2-氨基芴（Sigma Aldrich公司）；環(huán)磷酰胺、敵克松（江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司）；大鼠肝微粒體酶（S9）；小牛血清；甲醇；磷酸鹽緩沖液（賽普銳思科技有限公司）；蒸餾水自制，合格備用。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（AL204型，梅特勒-托利多儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（BS42型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；血細(xì)胞分析儀（BC-2800vet型，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；電子天平（AP135W型，島津中國(guó)有限公司）；生物顯微鏡（RH3201型，南派大工科技有限公司）；離心機(jī)（TGL-16型，常州億通分析儀器制造有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-8型，常州億通分析儀器制造有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（SHPY-70F型，深圳市澳德瑪電子科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD型，蘇州凈化設(shè)備有限公司）；計(jì)時(shí)器；載玻片；試管；培養(yǎng)皿；解剖器械。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)方顆粒制備

1.3.1.1 工藝流程

原料過(guò)篩→稱(chēng)量、混合→制軟材→制粒→干燥→整?！b

1.3.1.2 配方優(yōu)化

試驗(yàn)在前期大量試驗(yàn)研究工作基礎(chǔ)上，確定葉黃素和維礦預(yù)混料添加量分別為2%和1%。藍(lán)莓粉、越橘濃縮粉、葡萄籽提取物均含有原花青素等功效性成分，木糖醇有明顯清涼感，4種原料對(duì)終產(chǎn)品的口感風(fēng)味影響較大，因此將原料按不同比例混合拼配，采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)其用量進(jìn)行篩選，確定終產(chǎn)品配方。因素水平設(shè)定如表1所示。

表1 正交因素水平表 單位：%

1.3.1.3 感官評(píng)價(jià)

取5 g成品，用100 mL溫水溶解，組織30名專(zhuān)業(yè)人員對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，以溶液狀態(tài)、香味、風(fēng)味口感作為考察指標(biāo)進(jìn)行打分，取平均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 產(chǎn)品感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 急性毒理試驗(yàn)

選用SD大鼠20只，體重180～220 g，雌、雄各半。按最大耐受劑量法，設(shè)18.0 g/（kg·bw）為灌胃劑量（相當(dāng)于人體推薦量的216倍）。將適量樣品粉碎，稱(chēng)取180.0 g加蒸餾水至200 mL混懸，動(dòng)物禁食16 h，不禁水，按20 mL/（kg·bw）經(jīng)口灌胃1次，灌胃后連續(xù)觀察14 d內(nèi)動(dòng)物的一般健康狀況及死亡情況，試驗(yàn)開(kāi)始、第7和第14天稱(chēng)量大鼠體重，試驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物大體解剖，根據(jù)最大耐受量判斷受試物的急性毒性。

1.3.3 Ames試驗(yàn)

以多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶（S9）作為體外代謝活化系統(tǒng)，用間接致突變物（10 μg/皿的2-氨基芴用于TA97、TA98、TA100，50 μg/皿1,8-二羥基蒽醌用于TA102菌）測(cè)定S9活性。試驗(yàn)采用TA97、TA98、TA100、TA102這4種菌株，樣品設(shè)5 000，1 000，200，40和8 μg/皿5個(gè)劑量組及溶劑對(duì)照組（蒸餾水）、自發(fā)回變組和陽(yáng)性對(duì)照組。取適量樣品粉碎，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g，加蒸餾水至20 mL，混合均勻即為最高工作濃度5%的混懸液，試驗(yàn)時(shí)取100 μL該工作液加入平皿即為樣品最高濃度（5 000 μg/皿），以最高濃度為基礎(chǔ)用蒸餾水逐步5倍稀釋即得其余所需濃度混懸液，高壓蒸汽滅菌（0.103 MPa，20 min）。在加和不加S9的試驗(yàn)條件下進(jìn)行平板滲入法試驗(yàn)。每組作3個(gè)平行皿，重復(fù)試驗(yàn)1次。-S9陽(yáng)性對(duì)照物TA100用1.5 μg/皿的疊氮化鈉，其余3個(gè)菌株均采用50.0 μg/皿的敵克松；+S9陽(yáng)性對(duì)照物TA102用50.0 μg/皿的1,8-二羥基蒽醌，其余3個(gè)菌株均采用10.0 μg/皿的2-氨基芴。每組加入陽(yáng)性對(duì)照的體積為0.1 mL。

1.3.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

采用昆明種小鼠50只，體重25～30 g，雌雄各半。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)計(jì)：設(shè)10.0，5.0和2.5 g/（kg·bw）為3個(gè)劑量組，另設(shè)溶劑對(duì)照組（蒸餾水）及環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組[CP，40 mg/（kg·bw）]。樣品配制：稱(chēng)取20.0 g樣品加蒸餾水至40 mL，混合均勻作為高劑量，取20 mL高劑量混懸液，用蒸餾水依次倍比稀釋作為中、低劑量，用蒸餾水作為溶劑對(duì)照。另外取0.04 g CP加蒸餾水至20 mL，溶解，備用。灌胃體積按2 mL/（100 g·bw），試驗(yàn)采用30 h灌胃法，2次間隔24 h，于第2次給樣品后6 h取股骨骨髓涂片，固定，Giemsa染色后，在油鏡下每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE）中的微核細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核的千分率。觀察200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中成熟紅細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）。

1.3.5 小鼠精子畸形試驗(yàn)

采用雄性昆明種小鼠50只，體重25～35 g，將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。設(shè)有10.0，5.0和2.5 g/（kg·bw）3個(gè)劑量組，另設(shè)溶劑對(duì)照組（蒸餾水）及陽(yáng)性對(duì)照組[CP，40 mg/（kg·bw）]。樣品配制：稱(chēng)取20.0 g樣品加蒸餾水至40 mL，混合均勻作為高劑量，取20 mL高劑量混懸液，用蒸餾水依次倍比稀釋作為中、低劑量，用蒸餾水作為溶劑對(duì)照。另外取0.04 g CP加蒸餾水至20 mL，溶解，備用。灌胃體積按2 mL/（100 g·bw），每日經(jīng)口灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d，于首次給樣品后第35天，脫頸椎處死動(dòng)物，取雙側(cè)附睪進(jìn)行制片，經(jīng)甲醇固定、1%伊紅染液染色后，在高倍鏡下每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000條完整精子，記錄精子畸形數(shù)、畸形類(lèi)型，并計(jì)算精子畸形率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 for Windows軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（D）表示。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)采用卡方檢驗(yàn)，小鼠精子畸形試驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn)，30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方顆粒制備

通過(guò)L9(34)進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果如表3所示。

由表3可知，各因素影響感官評(píng)分的主次順序?yàn)椋浩咸炎烟崛∥锾砑恿浚灸咎谴继砑恿浚驹介贊饪s粉添加量＞藍(lán)莓粉添加量。依據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果可知，最優(yōu)配方為A2B1C1D3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

該優(yōu)選配方組合未出現(xiàn)在正交試驗(yàn)組合中，因此對(duì)該配方進(jìn)行工藝驗(yàn)證，并對(duì)制備成品進(jìn)行感官品評(píng)。該優(yōu)化配方的評(píng)分結(jié)果為43分，優(yōu)于正交試驗(yàn)中任一組合。因此該優(yōu)選配方A2B1C1D3結(jié)果可靠，即藍(lán)莓粉30%、越橘濃縮粉1.5%、葡萄籽提取物1%、木糖醇32%。

2.2 急性毒性試驗(yàn)

18.0g/（kg·bw）的劑量給予大鼠灌胃后，大鼠生長(zhǎng)良好、行為正常、反應(yīng)敏捷、體重增加、無(wú)明顯中毒癥狀，觀察14 d動(dòng)物無(wú)死亡。試驗(yàn)結(jié)束后解剖動(dòng)物，大體觀察肝、腎、脾、心、肺、胃、腸等主要臟器，均未見(jiàn)明顯異常。結(jié)果表明，復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)大鼠急性毒性MTD大于18.0 g/（kg·bw），依據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，大鼠急性毒性為無(wú)毒級(jí)。試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（D）

表4 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)大鼠急性毒性試驗(yàn)結(jié)果（D）

2.3 Ames試驗(yàn)

無(wú)論在加和不加S9的條件下，各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，無(wú)劑量關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒試驗(yàn)結(jié)果為陰性，無(wú)致突變遺傳毒性。試驗(yàn)結(jié)果如表5和表6所示。

表5 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒Ames試驗(yàn)結(jié)果（第1次）（D）

表5 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒Ames試驗(yàn)結(jié)果（第1次）（D）

表6 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒Ames試驗(yàn)結(jié)果（第2次）（D）

表6 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒Ames試驗(yàn)結(jié)果（第2次）（D）

2.4 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒各劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核率與溶劑對(duì)照組比較，差異均無(wú)顯著性（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組的微核率均顯著高于溶劑對(duì)照組（P＜0.01），各劑量的PCE/NCE值均在正常范圍內(nèi)，且各劑量組PCE/NCE值均不少于溶劑對(duì)照組的20%，提示復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒無(wú)染色體改變遺傳毒性。試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

2.5 小鼠精子畸形試驗(yàn)

各劑量組精子畸形率與溶劑對(duì)照組比較，秩和檢驗(yàn)差異均無(wú)顯著性（P＞0.05），陽(yáng)性對(duì)照組顯著高于溶劑對(duì)照組，差異有顯著性（P＜0.01）。試驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性，復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)小鼠精子無(wú)致畸作用。試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。

表8 復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)正交試驗(yàn)研究，確定復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒最終產(chǎn)品配方：藍(lán)莓粉30%、葉黃素2%、越橘濃縮粉1.5%、葡萄籽提取物1%、維礦預(yù)混料1%、木糖醇32%、麥芽糊精32.5%。經(jīng)制備，成品外觀均勻、風(fēng)味口感良好。食用安全性試驗(yàn)表明，復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒對(duì)大鼠急性毒性MTD大于18.0 g/（kg·bw），依據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，大鼠急性毒性為無(wú)毒級(jí)。Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)及小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。綜上所述，復(fù)方藍(lán)莓越橘顆粒配方工藝較為合理，且成品具有較高的食用安全性。