E3泛素連接酶TRIM59在肺癌腫瘤相關巨噬細胞中的表達及臨床意義

范靜芝，耿 彪，付相君，趙文英

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 1.腫瘤內科；2.呼吸內科，安徽 蕪湖 241001)

據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計報告顯示，肺癌每年新發(fā)病例約220萬，死亡病例約180萬，對人類的身體健康構成了極大的威脅[1]。近年來，盡管肺癌診療水平不斷提高，但其5年生存率仍較低。腫瘤相關巨噬細胞(tumour-associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)中最豐富的免疫細胞，目前研究已證實TAMs與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在直接聯(lián)系，包括乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌和卵巢癌等[2]。三結構域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)是TRIM蛋白超家族的重要成員之一，位于細胞內質網(wǎng)上，參與調控細胞周期，具有細胞內信號傳遞、凋亡、致癌等作用[3]。本課題組前期研究揭示TRIM59可以通過外泌體在腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境之間來回穿梭，傳遞信息，促進腫瘤細胞增殖和侵襲[4]。但TRIM59蛋白在TAMs中的表達水平及其與臨床病理參數(shù)關系還未了解。本研究通過mIHC法檢測肺癌組織微陣列芯片TAMs中TRIM59蛋白表達水平，分析TRIM59的表達水平與臨床病理參數(shù)和患者預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 芯片 肺癌組織芯片(OD-CT-RsLug04-001)購于上海芯超公司，芯片納入了92例肺癌組織及配對癌旁組織，患者的臨床病理資料和生存數(shù)據(jù)完整。

1.1.2 細胞系 人肺癌A549細胞株、人肺癌H1299細胞株和人急性單核白血病THP-1細胞株均來源于中國科學院(上海)細胞庫。

1.1.3 主要試劑 TRIM59多克隆抗體(PA5-38726)和CD68多克隆抗體(PA5-109344)購于Invitrogen公司，Opal 4-color fluorescent IHC kit(NEL810001KT)購于Akoya Biosciences公司，DAPI染色工作液、RIPA裂解液和BCA試劑盒購于碧云天生物技術有限公司，β-actin抗體(3700)購于Cell Signaling Technology公司，佛波酯(16561-29-8)購于Med Chem Express公司，人TRIM59過表達慢病毒顆粒(HG25849-ACGLN)購于Sino Biological公司，TRIM59shRNA(靶標序列:CTGAGGTTCAACCCGTTGAAA)購于Sigma公司，Transwell 24孔板(孔徑為8 μm)購于BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 多重熒光免疫組化技術(mIHC) 將載玻片用二甲苯和乙醇脫蠟，通過微波進行抗原回收，3%H2O2(新鮮制備)孵育10 min后，室溫下用封閉緩沖液封閉10 min，然后4℃孵育一抗過夜，室溫下孵育二抗2 h，Opal工作溶液孵育10 min，用DAPI復染細胞核，加抗熒光淬滅劑封片后，用共聚焦顯微鏡捕捉熒光信號。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及傳代 THP-1細胞為懸浮細胞，A549細胞及H1299細胞為貼壁細胞，培養(yǎng)液由含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素和DMEM培養(yǎng)液構成，置于含5% CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。1～2 d換液1次，3～4 d傳代1次。以下實驗均取處于對數(shù)生長期細胞，所有實驗數(shù)據(jù)均重復3次。

1.2.3 細胞轉染 將傳代培養(yǎng)的THP-1細胞密度稀釋成1×106個/mL，接種于培養(yǎng)皿中，于含100ng/mL佛波酯、0.3%BSA的無血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h誘導分化。通過光鏡進行形態(tài)學觀察，鑒定細胞是否分化為巨噬細胞。取已分化的THP-1源性巨噬細胞接種于6孔板中，并分為：TRIM59過表達組(TRIM59過表達慢病毒感染)、控制對照組(GFP過表達慢病毒感染)、空白對照組(未處理)；TRIM59敲低組(TRIM59shRNA轉染)、控制對照組(scrambledRNA轉染)、空白對照組(未處理)，分別進行轉染，置于孵育箱中培養(yǎng)過夜后，培養(yǎng)液更換為無抗含血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.4 蛋白印跡法檢測 使用RIPA裂解液裂解步驟1.2.3轉染細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，加入一抗4℃封閉過夜，再加入對應二抗室溫封閉1 h，滴反應液曝光。以β-actin為內參。

1.2.5 Transwell實驗 消化收集1.2.3分組轉染后的THP-1細胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為1.6×105個/mL，取600 μL細胞懸液接種于24孔板Transwell下室。再收集A549細胞、H1299細胞，消化離心后，用無血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞密度為4×105個/mL，取200 μL細胞懸液接種于24孔板Transwell上室與下室THP-1源性巨噬細胞共培養(yǎng)。放入孵育箱內繼續(xù)培養(yǎng)約48 h后，取出24孔板中的Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上層的細胞。用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.1%結晶紫染色20 min，PBS液沖洗干凈，倒扣小室自然風干。在倒置顯微鏡下隨機取5個視野，拍照并計算細胞的個數(shù)及平均值。

1.2.6 細胞克隆形成實驗 消化步驟1.2.3分組轉染后的THP-1細胞，將其離心后，用無FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸細胞密度為3×103個/mL，取1 mL細胞懸液接種于6孔板中。同時消化收集A549細胞、H1299細胞，用無FBS的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為3×103個/mL，每孔取1 mL細胞懸液接種于對應6孔板中與THP-1源性巨噬細胞共培養(yǎng)。每天觀察，當肉眼可觀察到克隆形成時，終止培養(yǎng)(2周左右)。棄上清，PBS洗滌細胞2次，用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.1%結晶紫染色20 min，后用PBS液浸洗干凈，自然風干。用數(shù)碼相機拍照儲存圖片，計數(shù)。

2 結果

2.1 肺癌TAMs中E3泛素連接酶TRIM59的表達水平與臨床病理參數(shù)的關系及對患者預后的影響 mIHC法檢測結果顯示，與癌旁肺組織中的巨噬細胞相比，肺癌TAMs中E3泛素連接酶TRIM59的表達水平明顯上調(見圖1)。應用Image J軟件定量分析肺癌微環(huán)境TAMs中TRIM59的表達水平，TAMs中TRIM59的平均熒光強度(MFIs)<100a.u.(arbitrary units,a.u.)時為低表達，而TRIM59的MFIs≥100a.u.時則為高表達。根據(jù)TAMs中TRIM59的MFIS評分，92例患者中有45例患者為高表達，47例患者為低表達。結果顯示，TAMs中E3泛素連接酶TRIM59的高表達與淋巴結轉移、腫瘤分期、遠處器官轉移有關(P<0.05)，見表1。

TRIM59表達(紅色熒光)，CD68標記巨噬細胞(黃色熒光)，細胞核用DAPI標記(藍色熒光)。

表1 TAMs中TRIM59蛋白表達水平與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關系

Kaplan-Meier生存分析表明，與TAMs中TRIM59低表達的患者相比，TAMs中TRIM59的表達水平升高的患者總生存期較差(P<0.001)，見圖2。

圖2 肺癌TAMs中TRIM59的表達與患者總生存期的Kaplan-Meier生存曲線

2.2 巨噬細胞過表達TRIM59促進肺癌細胞侵襲 Transwell實驗結果顯示，巨噬細胞過表達TRIM59可增強肺癌細胞A549和H1299的侵襲能力(P<0.01)；相反通過TRIM59shRNA敲低THP-1源性巨噬細胞TRIM59蛋白后，則抑制巨噬細胞的促腫瘤侵襲作用(P<0.01)，見圖3C、D。

2.3 巨噬細胞過表達TRIM59促進肺癌細胞的增殖 細胞克隆形成實驗結果顯示，與控制對照組細胞相比，巨噬細胞過表達TRIM59可增強肺癌細胞A549和H1299的增殖能力(P<0.01)；相反通過TRIM59shRNA敲低THP-1源性巨噬細胞中TRIM59蛋白后，則抑制巨噬細胞的促腫瘤增殖作用(P<0.01)，見圖4B、C。

A.Transwell實驗中THP-1源性巨噬細胞與肺癌細胞共培養(yǎng)實驗示意圖。B.WB法檢測THP-1源性巨噬細胞過表達或敲低TRIM59蛋白水平。C～D.THP-1源性巨噬細胞過表達或敲低TRIM59對A549、H1299細胞侵襲能力的影響(C：F=28.661和F=208.726，D：F=80.479和F=461.314，P<0.01)。**P<0.01。

3 討論

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、復雜的過程，涉及到復雜的網(wǎng)絡調控機制[5]。TME是腫瘤細胞賴以生存的內環(huán)境，主要包括血管、免疫細胞、成纖維細胞和細胞外基質等[6]。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用是促成惡性腫瘤轉移的必要條件[7]。腫瘤細胞可通過自分泌和旁分泌，改變和維持有利于自身生存和發(fā)展的局部微環(huán)境條件[8]；腫瘤微環(huán)境亦可通過代謝、分泌、免疫等功能的改變，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[9]。

有研究[10]表明，TRIM59在胃癌組織中的表達水平高于癌旁組織，且TRIM59表達水平與腫瘤分期、遠處轉移、腫瘤浸潤深度存在相關性，生存分析顯示，與TRIM59低表達患者相比，TRIM59高表達患者的總生存期明顯縮短。通過體外、體內功能驗證實驗發(fā)現(xiàn)，TRIM59通過促進P53泛素化蛋白酶體降解，抑制P53活性從而促進腫瘤細胞的增殖、克隆形成和轉移。另有研究[11]同樣表明，在肺癌患者中，與癌旁組織相比，腫瘤組織中TRIM59的表達水平顯著上調，并且TRIM59的表達水平與患者的腫瘤負荷存在相關性，TRIM59可以作為患者預后的獨立危險因素，機制研究顯示，TRIM59主要通過調控CDK6的表達來發(fā)揮其促腫瘤作用。本研究用mIHC法檢測肺癌組織微陣列芯片發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織中的巨噬細胞相比，TRIM59蛋白在肺癌TAMs中表達水平顯著升高，其表達水平與淋巴結轉移、腫瘤分期、遠處器官轉移有關。生存分析結果顯示，TAMs中高表達TRIM59的肺癌患者總生存期較差，這些臨床數(shù)據(jù)表明，TRIM59作為一個重要的癌蛋白，可能會作為肺癌的潛在預后和治療靶標。

A.細胞克隆形成實驗中THP-1源性巨噬細胞與肺癌細胞共培養(yǎng)示意圖。B～C.THP-1源性巨噬細胞過表達或敲低TRIM59蛋白對A549、H1299細胞增殖能力的影響(B：F=126.539和F=154.600，C：F=364.628和F=273.067，P<0.01)。**P<0.01。

免疫環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用，巨噬細胞是多種疾病發(fā)生的關鍵免疫細胞，對其進行研究可以為腫瘤治療提供更多的可能[12]。TAMs具有很強的可塑性，容易被其所處的環(huán)境誘導而極化成不同的類型[13]。在腫瘤環(huán)境的應激馴化下，TAMs大多表現(xiàn)為促癌作用，如刺激腫瘤細胞增殖、轉移和血管生成[14]。TAMs可以迅速適應腫瘤微環(huán)境的變化，在功能上接近但不完全等同M2型巨噬細胞表型，并促進微環(huán)境免疫抑制與腫瘤進展[13]。TAMs介導的免疫抑制主要與微環(huán)境中浸潤的T細胞的種類、功能相關。為了模擬腫瘤微環(huán)境TAMs中TRIM59的表達水平，本研究利用TRIM59過表達慢病毒感染THP-1源性巨噬細胞、TRIM59shRNA轉染THP-1源性巨噬細胞，Transwell實驗和細胞克隆形成實驗結果表明，與對照組相比，巨噬細胞過表達TRIM59增強肺癌細胞侵襲和增殖能力，抑制TRIM59表達，則遏制了巨噬細胞的促腫瘤細胞侵襲和增殖作用，表明TAMs中TRIM59表達水平升高促進了肺癌細胞的侵襲轉移和增殖能力。

綜上所述，E3泛素連接酶TRIM59在肺癌TAMs中表達水平升高，其表達水平與淋巴結轉移、腫瘤分期、遠處器官轉移有關。肺癌TAMs中TRIM59的表達水平升高的患者總生存期較差。體外實驗也進一步證明上調巨噬細胞中TRIM59的表達水平促進了肺癌細胞的侵襲和增殖能力，下調TRIM59的表達則遏制了巨噬細胞的促腫瘤作用。這些結果的發(fā)現(xiàn)表明TAMs中E3泛素連接酶TRIM59蛋白表達水平升高對肺癌腫瘤進展起到重要作用。