常樂康對早產小鼠CD8+T細胞CD28和PD-1表達的實驗研究

劉萌萌，陶雪花，張士發(fā)，毛娟娟

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 兒科,安徽 蕪湖 241001)

人類免疫系統(tǒng)發(fā)育最早始于胎兒期。新生兒，尤其是早產兒，由于宮內受暴露抗原的限制，出生時適應性免疫系統(tǒng)“無經驗”,存在免疫功能失衡[1]。出生后，具有豐富抗原的外部環(huán)境將可能誘導早產兒不適度的適應性免疫應答和/或耐受的發(fā)生，從而對健康成長帶來不利影響[2-3]。適應性免疫的核心在于T細胞的增殖和分化，大約50%的CD8+T細胞會表達CD28，CD28是主要的共刺激分子，識別APC細胞表面的天然配體CD80和CD86，相互結合后激活T細胞的增殖和分化并分泌細胞因子。PD-1是一種抑制性信號分子，對效應T細胞、T細胞的分化、T細胞耐受、T細胞耗竭和外周炎癥有重要作用，能有效調節(jié)機體免疫應答[4-6]。益生菌本質上是活的微生物，可能通過控制免疫反應的“開/關”，促進免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟[7]。目前有較多新生兒使用益生菌調節(jié)免疫系統(tǒng)的文獻，主要關注于CD4+T細胞，而CD8+T細胞在適應性免疫中對機體免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟具有重要作用，目前相關研究較少。本研究通過對早產小鼠使用常樂康進行早期干預，觀察小鼠CD8+T細胞表達CD28和PD-1的差異，以探討常樂康對早產小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 常樂康(山東科興生物制品有限公司)；米福RU486(深圳市資福藥業(yè)有限公司)；FITC Hamster Anti-Mouse CD3、PE-CyTM5 Rat Anti-Mouse CD4、PE-CyTM7 Rat Anti-Mouse CD8、PE Hamster Rat Anti-Mouse CD28、PE Hamster Rat Anti-Mouse PD-1(美國BD Pharminge公司)；PBS緩沖液(HyClone)。

1.2 方法

1.2.1 新生小鼠模型 SPF級BALB/c健康成年小鼠(6～8周，體質量18～22 g)，由江蘇省南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。隨機選擇妊娠18 d的孕鼠腹腔注射RU486(劑量0.15 mg/kg)誘導早產，獲得胎齡<20 d的早產小鼠(最小胎齡18 d)；隨機選擇一部分孕鼠自然分娩，獲得胎齡>20 d的足月小鼠(最大胎齡22 d)。本研究經過皖南醫(yī)學院動物倫理委員會批準通過(LLSC-2020-070)。

1.2.2 分組及處理 將早產小鼠隨機分為實驗組(A組)和對照組(B組)，足月小鼠為足月對照組(C組)，每組各20只。A組使用常樂康灌胃(活菌散劑量為每袋500 mg，將兩袋溶于1 mL生理鹽水中，灌胃容積為每只100 uL)，剩余兩組使用等量生理鹽水灌胃，1周。

1.2.3 組織取材與標本制備 分別于第14、21天隨機在3組中各取10只小鼠，經水合氯醛麻醉摘除眼球獲取外周血，使用肝素抗凝管抗凝，靜置備用。

1.2.4 CD28、PD-1檢測 取兩只流式管分別標記為a、b，各加入外周血100 μL，依次在a管中加入5 μL CD3e、CD4、CD8a、CD28，b管中加入5 μL CD3e、CD4、CD8a、PD-1，混勻；將混合好抗體的外周血避光孵育30 min；分別于各管中加入500 μL紅細胞裂解液混勻后放置于37℃水浴箱，5 min；離心5 min，離心力400 g，棄上清，再重復1次；各管中加入2 mL PBS緩沖液進行清洗，離心5 min，離心轉速1 500轉/min，棄上清；各管中加入700 μL PBS緩沖液后上機檢測。

2 結果

2.1 外周血CD8+T細胞表面CD28和PD-1的表達 通過FlowJo X軟件分析小鼠外周血CD8+T細胞CD28和PD-1的表達。通過熒光信號或散射光信號的相對強度和相對細胞數進行圈門，從而分出T淋巴細胞，再根據表面熒光素的不同，區(qū)分CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞，最后在CD8+T細胞中圈出CD28+和PD-1，并記錄其表達百分率。見圖1。

2.2 CD8+T細胞表面CD28百分率及其平均熒光強度 第14天時，A組CD28百分率高于C組(P<0.05),但低于B組(P<0.05)；第21天時，C組高于A、B組(P<0.05)。第14天時，A組CD28 MFI高于B、C組(P<0.05)；第21天時，A組高于B組(P<0.05)，但低于C組(P<0.05)。見表1。

2.3 CD8+T細胞表面PD-1百分率及其平均熒光強度 第14天時，A組PD-1百分率高于B、C組(P<0.05)；第21天時，B組高于A、C組(P<0.05)。第14天時，A組PD-1 MFI高于B、C組(P<0.05)；第21天時，A、C組高于B組(P<0.05)。見表2。

3 討論

益生菌是近年研究熱門的一種微生物制劑，在臨床上應用廣泛。通過腸道消化吸收至全身進而誘導免疫調節(jié)、保護生理應激，對提高宿主的免疫功能有一定作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，早產兒使用益生菌可穩(wěn)定腸道微生物群，促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育，提高適應性免疫。

T淋巴細胞一般會表達兩套共信號受體：共刺激受體和共抑制受體。共刺激受體對幼稚T細胞的充分激活至關重要(如CD28)；共抑制受體能降低T淋巴細胞的信號強度(如PD-1)[11]。CD28表達對于T細胞活化十分重要，也是T細胞初始啟動的關鍵。CD28提供獨特的信號，激發(fā)廣泛的轉錄和代謝以及表觀遺傳的變化，進一步對T細胞的激活、擴增和分化產生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在第14天，A組CD28百分率處于兩對照組之間，但CD28 MFI顯著高于兩對照組；在第21天，A組CD28百分率和MFI均高于B組,但低于C組，提示常樂康能促進早產小鼠CD8+T細胞表達CD28，但在早期CD28的表達可能會暫時性地降低。CD28表達的缺失會導致CD8+T細胞失去細胞毒功能，同時抑制T細胞的增殖[12]。然而，由于腫瘤抗原的慢性刺激，癌癥患者CD8+T細胞會失去CD28的表達，從而呈現(xiàn)對腫瘤抗原的無應答狀態(tài)[13]。因此，CD8+T細胞表達CD28對免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟具有重要作用。本研究提示早期補充常樂康可能通過調控CD28的表達，對早產小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟具有促進作用。

圖1 CD8+T細胞表面CD28/PD-1表達圖

表1 CD8+T細胞表面CD28百分率和MFI的比較

表2 CD8+T細胞表面PD-1百分率和MFI的比較

PD-1在T淋巴細胞激活后期被誘導，在T淋巴細胞活化時快速上調，激活后減弱TCR信號的傳導和降低T淋巴細胞的活性，誘導凋亡，減輕機體過度免疫引起的免疫損傷[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在第14天，A組PD-1百分率和MFI均高于兩對照組；在第21天，A組PD-1百分率低于兩對照組，但PD-1 MFI高于B組，稍低于C組，提示常樂康可下調早產小鼠CD8+T細胞表面PD-1 MFI，但在早期可能會暫時性增加PD-1的表達。研究發(fā)現(xiàn)[16]，高PD-1的表達是在癌癥和慢性感染中因持續(xù)抗原刺激而產生的耗盡T細胞的標志，同時細胞因子的合成也受到限制，如PD-1在CD8+T細胞表面過表達是T淋巴細胞耗竭的一個重要提示。PD-1通過抑制TCR和CD28信號在效應性T細胞中發(fā)揮免疫抑制作用，也對Treg細胞產生負面影響[17]。因此，CD8+T細胞表達PD-1對免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟具有重要作用，本研究提示早期補充常樂康可能通過調控PD-1的表達，對早產小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟具有促進作用。

此外，Hui等還提出了一些新的結論，PD-1可以特異性使CD28去磷酸化，即PD-1可以直接抑制CD28的信號阻斷T細胞的激活[17]。同時也有研究證明，CD28被認為是有效的PD-1阻斷治療所必需的，CD28的缺失會削弱PD-1途徑阻斷的效果[18]。因此，CD28作為T細胞活化途徑中的關鍵一步，在控制T細胞耗竭過程中作用明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，A組在第14天時，CD8+T細胞PD-1百分率明顯高于CD28百分率，此時負性共刺激因子占主導地位，至第21天時，CD28百分率明顯高于PD-1百分率，此時正性共刺激因子占主導地位。相較于B組而言，A組正向共刺激因子恢復優(yōu)勢地位的速度更快，CD28的表達量也更高。提示早期補充常樂康可更早的恢復正向共刺激因子的主導地位，抑制負性共刺激因子，減少T細胞耗竭，有效促進早產小鼠免疫功能的成熟。

綜上所述，使用常樂康進行干預可能刺激早產小鼠外周血中CD8+T細胞的活化、增殖等，其生物學功能可能是通過平衡CD28和PD-1的表達，進而發(fā)揮適應性免疫功能，從而促進早產小鼠免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟。同時，本實驗也存在不足之處，使用常樂康處理實驗組的時間僅為7天，實驗組的表達水平仍不及足月組，在今后的實驗可以適當延長實驗組的處理時間，以獲得常樂康的最佳療效。為在臨床上積極、合理的使用益生菌制劑提供理論基礎，以減少早產兒并發(fā)癥的發(fā)生并改善預后。