沙藏對(duì)白果蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成的影響

周夢(mèng)怡，花彤彤，馬小芳，孫海軍，徐 莉

(1.南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210037； 2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.南京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 210037)

白果是我國藥食同源的典型代表。白果即銀杏果實(shí)中可食用部分，其性味甘苦，營養(yǎng)豐富，含蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮、核黃素、胡蘿卜素、鈣、磷、鐵、鉀等多種營養(yǎng)元素，并且具有多種食療保健作用及藥用價(jià)值?！侗静菥V目》中有記載，白果具有益肺氣、治咳喘等功效。白果可以通過炒、燉、蒸等方式入菜，亦可加工成各類果脯、飲料、罐頭等形式[1]。在我國及日本、韓國等東亞地區(qū)自古就有食用白果的習(xí)慣。我國是全球最大的白果生產(chǎn)國和出口國[2]。以邳州市為例，邳州市銀杏種植面積3.3萬hm2，白果年產(chǎn)量5000 t，各類銀杏保健品800 t，出口至日本、韓國、美國和歐洲等地區(qū)[3]。通常，每年10月銀杏果實(shí)成熟，采摘后經(jīng)去皮、漂洗、漂白和風(fēng)干等步驟后即可獲得白果[4]。一為全年市場(chǎng)供應(yīng)，二為來年播種，白果均需要進(jìn)行儲(chǔ)藏。在儲(chǔ)藏過程中，白果的生命活動(dòng)、重量、化學(xué)成分、營養(yǎng)價(jià)值均會(huì)悄無聲息又不可避免地發(fā)生改變。分析現(xiàn)有文獻(xiàn)可知，目前關(guān)于白果的研究集中在理化性質(zhì)[5]、成分功能[6-7]和安全性[8-9]等方面，關(guān)于儲(chǔ)藏期間營養(yǎng)成分變化的研究不足。碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)是食物三大宏量營養(yǎng)素。Ogushi等[10]研究了儲(chǔ)藏期間白果碳水化合物和脂肪的變化。但尚無關(guān)于儲(chǔ)藏對(duì)白果蛋白質(zhì)影響的相關(guān)報(bào)道。白果的儲(chǔ)藏方式主要有3種，常溫儲(chǔ)藏法(通風(fēng)的室內(nèi))、冷凍貯藏法(恒溫冷庫，-1～4 ℃)、沙藏法[4]。沙藏法又稱層積處理，即將植物種子埋入濕沙中存放于陰涼低溫環(huán)境下。在沙藏過程中，白果會(huì)經(jīng)歷生理后熟而長(zhǎng)出胚，種皮通透性增加，進(jìn)而有利于來年萌發(fā)和播種[11]。本試驗(yàn)擬采用主成分分析和Pearson相關(guān)性分析方法來探討沙藏過程中白果蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 白果樣品

供試材料采自江蘇省邳州市陳樓鎮(zhèn)銀杏種質(zhì)資源圃，共5個(gè)品種，編號(hào)1—5(表1)。手動(dòng)去外種皮，水洗，室溫風(fēng)干，然后進(jìn)行沙藏。于室內(nèi)陰涼處，先在容器底部鋪1層約10 cm厚的濕沙，然后鋪上1層約10 cm厚的白果，再鋪上1層10 cm厚的濕沙，以此類推，最后鋪1層20 cm以上的濕沙作為頂層。

表1 所用白果信息描述

儲(chǔ)藏期間隨時(shí)檢查，防止發(fā)霉變質(zhì)。儲(chǔ)藏滿0、30、90、150 d后取出部分樣品，手動(dòng)去除中種皮、內(nèi)種皮和胚乳，留種仁(即可食用部分)凍干(FD5型冷凍干燥儀，美國SIM公司)，磨成粉，存放于-20 ℃中待后續(xù)分析。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 粗蛋白含量的測(cè)定 稱取樣品5 mg左右(精確至0.001 mg)，包于錫紙中，2400Ⅱ型CHNS/O元素分析儀(美國Perkin-Elmer公司)，待空白試驗(yàn)、條件試驗(yàn)和乙酰苯胺校正后，進(jìn)行樣品分析。儀器得到的N元素含量數(shù)值乘以系數(shù)6.25，即為白果粗蛋白含量[12]，結(jié)果用g·kg-1樣品干重表示。

1.2.2 氨基酸的提取及其組成的測(cè)定 稱取樣品500 mg左右(精確至0.1 mg)，置于水解管中進(jìn)行鹽酸水解，具體步驟見文獻(xiàn)[13]。白果氨基酸的組成由S443D型全自動(dòng)氨基酸分析儀(德國Sykam公司)進(jìn)行檢測(cè)。該儀器基于色譜柱分離、柱后衍生、在線檢測(cè)的工作原理。樣品中的氨基酸通過4.6 mm×150 mm陽離子分析柱(LCA K06/Na)進(jìn)行捕獲和分離，流動(dòng)相為A/B/D(德國Sykam公司)梯度變化的混合液：0～11 min，0% B；11～17 min，15% B；17～23 min，20% B；23～27 min，33% B；27～30 min，80% B；30～42 min，100% B；42～45 min，100% D，流速0.45 mL·min-1，柱溫57 ℃(0～27 min)和74 ℃(27 min—結(jié)束)。柱后衍生系統(tǒng)為茚三酮溶液(德國Sykam公司)，流速0.25 mL·min-1，反應(yīng)溫度130 ℃。在線檢測(cè)器為UV-可見光檢測(cè)器，570 nm和440 nm雙波長(zhǎng)同時(shí)檢測(cè)。

采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，標(biāo)樣為17種氨基酸混標(biāo)(美國Agilent Technologies公司)，包括天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)，蘇氨酸(Threonine，Thr)，絲氨酸(Serine，Ser)，谷氨酸(Glutamic acid，Glu)，脯氨酸(proline，Pro)，甘氨酸(Glycine，Gly)，丙氨酸(Alanine，Ala)，半胱氨酸(Cysteine，Cys)，纈氨酸(Valine，Val)，蛋氨酸(Methionine，Met)，異亮氨酸(Isoleucine，Ile)，亮氨酸(Leucine，Leu)，酪氨酸(Tyrosine，Tyr)，苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)，組氨酸(phenylalanine，His)，賴氨酸(Lysine，Lys)，精氨酸(Arginine，Arg)。樣品中單個(gè)氨基酸含量的結(jié)果用mg·g-1干重表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

文中數(shù)據(jù)用均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤值(SE)表示。采用Origin 8軟件繪制色譜圖。采用SPSS 21軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，包括組間單因素方差分析(Tukey檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)、氨基酸濃度的變異系數(shù)(Coefficient of variation percentage，CV%)、氨基酸濃度變化和儲(chǔ)藏時(shí)間之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient，ρ)、以及以每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各氨基酸含量為響應(yīng)變量的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙藏過程中白果粗蛋白含量的變化

沙藏過程中各品種白果粗蛋白含量的變化見圖1。從整體上看，白果粗蛋白含量隨沙藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)出波動(dòng)式上升的趨勢(shì)，由184.7 g·kg-1(0 d)增加至234.3 g·kg-1(150 d)，增加了26.84%。沙藏期間白果不可避免會(huì)遭受真菌污染，這些真菌一方面消耗碳水化合物導(dǎo)致白果干重降低，另一方面可以從環(huán)境中吸收有機(jī)氮和無機(jī)氮[14]，而白果粗蛋白的含量是基于其N元素含量的測(cè)定結(jié)果而換算得到。以上可以解釋為什么在儲(chǔ)藏期間白果粗蛋白含量表現(xiàn)為波動(dòng)式上升。

圖1 儲(chǔ)藏期間白果粗蛋白的含量

就單個(gè)品種而言，其粗蛋白含量變化的趨勢(shì)和幅度均存在品種差異。3號(hào)品種粗蛋白含量在儲(chǔ)藏30 d后達(dá)到峰值，之后回落，趨于平穩(wěn)，最高值(30 d)與最低值(0 d)之間差值為29.6 g·kg-1。同樣地，4號(hào)、5號(hào)品種(均來自浙江省長(zhǎng)興林業(yè)局)的變化幅度分別為92.5、61.0 g·kg-1。而1號(hào)品種粗蛋白含量在90 d回落至最低值后又迅速攀升，在150 d到達(dá)峰值，最高值(150 d)與最低值(90 d)之間差值為74.4 g·kg-1。

2.2 沙藏過程中白果氨基酸組成的變化

圖2為氨基酸分析儀對(duì)白果氨基酸組成進(jìn)行定性和定量分析的色譜圖。由圖2可知，在本試驗(yàn)色譜條件下，氨基酸混合標(biāo)樣得到了較好的分離(圖2 A)，同時(shí)白果樣品的17個(gè)目標(biāo)峰分離度良好，且保留時(shí)間與標(biāo)樣一致(圖2 B)，證明色譜條件合適，可以進(jìn)行后續(xù)的定性和定量分析。

圖2 氨基酸混合標(biāo)樣(A)和白果樣品(B)氨基酸色譜圖

與粗蛋白含量變化不同，白果中總氨基酸(Total amino acids，TACs)的含量呈現(xiàn)波動(dòng)式減少，整體上由84.36 mg·g-1(0 d)下降至75.60 mg·g-1(150 d)，減少了10.39%，較粗蛋白含量變化幅度小(圖3)。就單個(gè)品種而言，1號(hào)品種波動(dòng)最大，最大值(90 d)與最小值(150 d)之間差值為61.96 mg·g-1；4號(hào)品種波動(dòng)最小，最大值(90 d)與最低值(30 d)之間差值為13.32 mg·g-1；5號(hào)品種居中，最大值(90 d)與最低值(0 d)之間差值為22.47 mg·g-1。

圖3 儲(chǔ)藏期間白果總氨基酸的含量

白果氨基酸組成見表2～表3。在儲(chǔ)藏期間，各氨基酸的含量均發(fā)生了不同程度變化。在10個(gè)必需氨基酸中，只有Cys和Met的含量在經(jīng)歷150 d沙藏后增加了，分別增加315.30%和17.06%；而其余氨基酸中，除Lys在儲(chǔ)藏30 d時(shí)達(dá)到最大值后回落外，其余均在90 d后達(dá)到最高值再快速下降，并低于初始含量(0 d)。為了評(píng)估各氨基酸含量在儲(chǔ)藏期間的變化大小，計(jì)算了變異系數(shù)值(CV)。變異系數(shù)又稱為離散系數(shù)，主要用于比較不同樣本數(shù)據(jù)的離散程度，是統(tǒng)計(jì)學(xué)當(dāng)中常用的一個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)[15]。由CV值可以看出，儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)Cys含量的影響最為明顯，表現(xiàn)為其CV數(shù)值最大，為54.55%；Met緊隨其后(CV=33.95%)。值得注意的是，Cys和Met均屬于含硫氨基酸，該類氨基酸很容易從人體內(nèi)丟失[16]。Thr、Val、Leu、Phe和His的CV值均小于20%，說明其在儲(chǔ)藏期間相對(duì)較穩(wěn)定。在7個(gè)非必需氨基酸中，只有Ser在經(jīng)歷150 d儲(chǔ)藏之后增加了6.06%，其余均在波動(dòng)變化中減少。從整體上看，非必需氨基酸CV值均低于30%，提示非必需氨基酸受儲(chǔ)藏的影響較必需氨基酸小。就儲(chǔ)藏時(shí)間來看，除了Cys、Lys和Arg外，其余氨基酸濃度均在90 d時(shí)達(dá)到最高。

表2 儲(chǔ)藏期間白果必需氨基酸的組成

表2(續(xù))

2.3 白果各氨基酸含量與沙藏時(shí)間之間的相關(guān)性分析

為了更好地描述各氨基酸含量與儲(chǔ)藏時(shí)間的關(guān)系，采用皮爾森相關(guān)性系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。皮爾森相關(guān)系數(shù)是一種簡(jiǎn)單的度量2個(gè)變量關(guān)系之間線性關(guān)系的統(tǒng)計(jì)量，其相關(guān)性系數(shù)r值介于-1～1之間，|r|越大說明相關(guān)性越強(qiáng)[17]。由表4可知，大部分氨基酸的含量均與儲(chǔ)藏時(shí)間表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性，意味著隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加其含量降低。該結(jié)果與表2、表3一致。值得注意的是，5個(gè)品種的Cys含量與儲(chǔ)藏時(shí)間呈極顯著的正相關(guān)(0.798，P<0.01)，表明Cys含量可能是判斷沙藏時(shí)間的一種潛在指標(biāo)。

表3 儲(chǔ)藏期間白果非必需氨基酸的組成

表4 白果內(nèi)各氨基酸含量與儲(chǔ)藏時(shí)間的皮爾森相關(guān)性

2.4 白果氨基酸成分主成分分析

為進(jìn)一步分析儲(chǔ)藏過程中白果各氨基酸含量的響應(yīng)變化規(guī)律，對(duì)5個(gè)品種、各取樣時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)氨基酸含量及TCA含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)。PCA分析一種標(biāo)準(zhǔn)的降維方法，可以將大量變量轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)[18]。根據(jù)PCA降維思想，將儲(chǔ)藏期TCA和17種氨基酸的含量劃分為若干主成分，提取到3個(gè)主成分(PC1、PC2和PC3)，累積貢獻(xiàn)率為85.307%(圖4)。

●為1號(hào)品種白果；◆為2號(hào)品種白果；▲為3號(hào)品種白果；-為4號(hào)品種白果；■為5號(hào)品種白果 圖4 主成分分析得分圖

Cys(-0.946)和Thr(0.812)是PC3最重要的判別變量，從圖4可以看出，0 d和150 d分別集中在上方和下方，30 d和90 d集中在中部，說明在整個(gè)儲(chǔ)藏期間，Cys含量在增加，Thr含量在減少，與表2相符。Met(0.946)、His(0.839)、Pro(0.838)和Asp(0.734)是PC2最重要的判別變量，在PCA2這個(gè)維度上，30 d集中在左側(cè)，90 d集中在右側(cè)，說明這4種氨基酸總含量在30 d時(shí)最低，90 d時(shí)最高。這個(gè)規(guī)律與TACs變化規(guī)律一致，提示該4個(gè)氨基酸總量的變化可以反映TACs的變化趨勢(shì)。其余大部分的氨基酸屬于PC1，居前3位的為L(zhǎng)ys(0.856)、Arg(0.833)和Phe(0.808)；在這個(gè)維度上，不能將時(shí)間這個(gè)變量區(qū)分出來，但是不同品種表現(xiàn)出了差異：1號(hào)品種最分散，2號(hào)和4號(hào)則相對(duì)較集中，提示儲(chǔ)藏過程中1號(hào)品種受到的影響最大，2號(hào)和4號(hào)較小。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選取5個(gè)品種的白果，連續(xù)沙藏150 d，考察沙藏對(duì)其蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成的影響。結(jié)果顯示，隨著沙藏時(shí)間的增加，白果粗蛋白含量呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)；而總氨基酸含量則表現(xiàn)為下降；就單個(gè)氨基酸而言，大部分的氨基酸含量均表現(xiàn)出在波動(dòng)中顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)，而Met和Ser的含量則在波動(dòng)變化中增加了。更特別的是Cys，其含量隨儲(chǔ)藏時(shí)間增加而增加，并表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)性(ρ=0.798**，P<0.01)，提示該氨基酸含量具有作為檢查白果沙藏時(shí)間或預(yù)測(cè)其品質(zhì)的一種指標(biāo)的潛能?；赑CA分析結(jié)果得知，2號(hào)(葉籽銀杏)和4號(hào)(長(zhǎng)興1號(hào))這2個(gè)品種的白果蛋白含量和氨基酸組成在沙藏期間變化相對(duì)較小，提示沙藏對(duì)這2個(gè)品種影響小。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，沙藏顯著改變了白果蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì)，且該影響具有品種特異性，對(duì)未來白果品種的篩選具有參考價(jià)值。在接下來的試驗(yàn)中，將開展更大規(guī)模的品種比較。