氮素緩解花生干旱脅迫的生理和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

丁 紅 張智猛 徐 揚(yáng) 張冠初 郭 慶 秦斐斐 戴良香

氮素緩解花生干旱脅迫的生理和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

丁 紅 張智猛 徐 揚(yáng) 張冠初 郭 慶 秦斐斐 戴良香*

山東省花生研究所, 山東青島 266100

干旱脅迫下氮素施用對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的影響。為明確氮素提高花生抗旱性的生理和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制, 本研究對(duì)施氮、干旱及旱氮同存處理下的花生生理指標(biāo)和根系轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明, 旱氮同存處理提高了干旱脅迫下花生生物量和葉片相對(duì)含水量。施用氮肥增加了干旱脅迫下花生根系的總酚和類黃酮含量, 提高其過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性, 降低其丙二醛(MDA)含量, 提高花生抗旱性。轉(zhuǎn)錄組分析表明, 施用氮肥產(chǎn)生5396個(gè)差異表達(dá)基因, 這些基因主要參與谷胱甘肽代謝、氮代謝和碳代謝相關(guān)過(guò)程及應(yīng)激和防御反應(yīng)。干旱處理和旱氮同存處理下, 次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝及碳水化合物運(yùn)輸和代謝這兩類功能差異表達(dá)基因富集。旱氮同存處理下酚類代謝物質(zhì)相關(guān)的3種途徑中有51個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá), 207個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。由此表明, 施用氮肥通過(guò)調(diào)控花生次生產(chǎn)物代謝、碳水化合物代謝等途徑提高干旱脅迫下花生植株的抗氧化能力, 從而提高花生的抗旱性。

花生; 干旱; 氮素; 抗氧化系統(tǒng); 轉(zhuǎn)錄組

花生是重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物, 干旱和養(yǎng)分缺乏是限制其生長(zhǎng)發(fā)育的2個(gè)主要因素[1]。由于全球氣候變暖, 預(yù)計(jì)干旱造成的損失將變得更加嚴(yán)重[2]。氮是植物生長(zhǎng)必需的大量營(yíng)養(yǎng)素之一, 由于氮素須溶解在水中被根系吸收, 因此缺氮通常與干旱同時(shí)發(fā)生。水分缺乏條件下, 植物通過(guò)形態(tài)、生理、生化、細(xì)胞和分子等過(guò)程抵御外界非生物脅迫。植物在干旱脅迫后產(chǎn)生大量的活性氧, 從而傷害其細(xì)胞和組織。為抵抗干旱脅迫造成的傷害, 植物通過(guò)一系列復(fù)雜的酶促和非酶促抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。干旱脅迫會(huì)造成酶促系統(tǒng)中抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)等活性降低, 積累活性氧, 使膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde, MDA)增加, 降低其光合能力[3-4]?？箟难帷⒐入赘孰?、生物堿、生育酚和酚類化合物作為非酶抗氧化防御系統(tǒng), 是強(qiáng)大的活性氧清除劑, 可保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷。酚類化合物是植物體內(nèi)次生代謝重要產(chǎn)物之一。干旱脅迫處理下, 棉花葉片、丹參等作物中酚類物質(zhì)含量顯著增加[5-6], 且酚類可以通過(guò)提高過(guò)氧化物酶的活力和減少M(fèi)DA含量來(lái)消除和減輕因干旱引發(fā)的活性氧傷害, 增強(qiáng)作物的抗旱性[7-8]。適度干旱脅迫提高紫花苜蓿葉片中黃酮合成途徑上游關(guān)鍵酶活性, 促進(jìn)地上部黃酮類化合物的積累[9]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于識(shí)別不同組織、品種和處理之間差異表達(dá)的基因。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù), 對(duì)作物干旱脅迫和缺氮條件下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析[10-11]。Bhogireddy等[12]認(rèn)為干旱脅迫下耐旱型花生激活了脫落酸(abscisic acid, ABA)和蔗糖代謝途徑中關(guān)鍵基因以保持較高的抗旱性, 另有研究表明, 耐旱型花生利用發(fā)達(dá)的根系系統(tǒng)、能量代謝的提升、次生代謝的加強(qiáng)和生長(zhǎng)的抑制4個(gè)方面共同應(yīng)對(duì)干旱脅迫[13]。提高根系發(fā)育和葉片光合系統(tǒng)穩(wěn)定性是玉米耐受低氮的主要因素[14]。

干旱脅迫影響植物生長(zhǎng)和氮代謝, 而氮素的施用在一定程度上有助于提高植物的抗旱性[15]。干旱脅迫下, 氮素供應(yīng)通過(guò)促進(jìn)根系生長(zhǎng)、保護(hù)光合系統(tǒng)、激活抗氧化防御系統(tǒng)和改善滲透調(diào)節(jié)等增強(qiáng)作物的抗旱性[16-17]。適量施用氮肥增加了干旱脅迫下棉花葉片的保護(hù)酶活性, 降低MDA含量, 提高抗旱性[18]。適度氮素供給能夠提高水稻植株酚類物質(zhì)合成代謝相關(guān)的苯丙氨酸裂解酶基因和肉桂?；虻谋磉_(dá)[19], 增加植株葉片總酚、類黃酮含量[20]。植物對(duì)單一的干旱或施用氮肥的反應(yīng)機(jī)制已被廣泛研究[1,7-9], 氮肥施用對(duì)干旱脅迫下作物的抗氧化酶活性及產(chǎn)量等影響已有報(bào)道[21-23], 但對(duì)其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制及施用氮肥提高干旱脅迫下作物抗旱性的分子機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)施氮、干旱及旱氮同存處理下的花生農(nóng)藝性狀、生理性狀和根系轉(zhuǎn)錄組分析, 探究施用氮肥提高花生抗旱性的調(diào)控機(jī)制, 挖掘重要的候選調(diào)控基因, 為干旱脅迫下氮肥施用及花生抗旱育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以花生品種‘花育25號(hào)’為試驗(yàn)材料, 在光照16 h/8 h黑暗(28℃/22℃)條件下進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)盆直徑23 cm, 高度25 cm, 每盆裝土5.5 kg, 種植2株花生。供試土壤為輕壤土, 中等供氮水平(堿解氮56.7 mg kg–1)。設(shè)置2個(gè)水分條件: 正常供水(well- watered, WW; 75%±5%田間持水量)和花針期干旱脅迫(drought stress, DS; 45%±5%田間持水量)。設(shè)置2種氮肥水平: 不施氮(none nitrogen, NN)和施用氮肥(nitrogen application, NA; 90 kg hm–2), 同時(shí)施用過(guò)磷酸鈣(450 kghm–2)和硫酸鉀(300 kghm–2), 肥料以基肥方式施入?；ㄡ樒?播種后40 d)進(jìn)行干旱脅迫, 水分降低至45%田間持水量后持續(xù)脅迫5 d再進(jìn)行樣品采集。

設(shè)置4個(gè)處理: (1) 對(duì)照(正常供水+不施氮, WWNN); (2) 施氮處理(正常供水+施用氮肥, WWNA); (3) 干旱處理(干旱脅迫+不施氮, DSNN); (4) 旱氮同存處理(干旱脅迫+施用氮肥, DSNA)。農(nóng)藝性狀、抗氧化特性(酚類物質(zhì)及抗氧化酶活性)測(cè)定及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建各3次重復(fù)。2020年6月進(jìn)行第1次試驗(yàn), 對(duì)花生農(nóng)藝性狀、轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)及酚類物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。2021年6月進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn), 對(duì)農(nóng)藝性狀和抗氧化特性進(jìn)行測(cè)定。各處理植株按地上部和根系分開(kāi)采集, 進(jìn)行農(nóng)藝性狀、抗氧化特性及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的測(cè)定?？寡趸富钚约稗D(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建所采集的根系樣品液氮速凍后–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主莖高、干物質(zhì)和葉片相對(duì)含水量的測(cè)定

主莖高為子葉節(jié)到主莖生長(zhǎng)點(diǎn)的距離。采用烘干法測(cè)定植株干物質(zhì)量。選取每株主莖倒三葉利用烘干法進(jìn)行測(cè)定葉片相對(duì)含水量(relative water content, RWC), 計(jì)算公式如下:

RWC%=(葉片鮮質(zhì)量–葉片干質(zhì)量)/(葉片飽和鮮質(zhì)量–葉片干質(zhì)量)×100%

1.3 抗氧化特性指標(biāo)的測(cè)定

將花生地上部和根系烘干測(cè)定干物質(zhì)量后進(jìn)行粉碎, 分別取0.1 g花生地上部和根系粉碎樣品進(jìn)行酚類相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。采用福林酚法[24]測(cè)定總酚含量, 60%乙醇浸提樣品后取上清液進(jìn)行反應(yīng), 利用分光光度計(jì)測(cè)定各樣品反應(yīng)液在760 nm的吸光值。利用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[25]測(cè)定類黃酮含量, 測(cè)定各樣品反應(yīng)液在470 nm的吸光值。

參考張蜀秋[26]的方法測(cè)定根系SOD、POD、CAT及MDA含量; 利用氮藍(lán)四唑法測(cè)定SOD活性, 紫外吸收法測(cè)定CAT活性, 愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性, 硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量。

1.4 RNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序

采用Trizol試劑(Invitrogen)提取根系總RNA, 挑選合格RNA樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。委托上海美吉生物科技有限公司完成轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。簡(jiǎn)要流程如下: 利用帶有Oligo(dT)的磁珠對(duì)樣品總RNA進(jìn)行mRNA分離, 然后將mRNA隨機(jī)斷裂。以片段化的mRNA為模板, 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈cDNA, 經(jīng)末端修復(fù)、加堿基A形成接頭。通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)富集, 進(jìn)行文庫(kù)制備工作, 將構(gòu)建好的文庫(kù)上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

將測(cè)序數(shù)據(jù)提交至NCBI (National Coalition Building Institute)數(shù)據(jù)庫(kù), 提交ID為PRJNA812634。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)處理, 首先過(guò)濾得到高質(zhì)量的clean data, 將數(shù)據(jù)序列與花生基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Peanutbase (https:/www.peanutbase.org/)進(jìn)行比對(duì), 基于定位序列進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量的評(píng)估和基因表達(dá)量等分析。利用StringTie軟件的最大流量算法, 采用FPKM作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)。表達(dá)水平差異基因(differentially expressed genes, DEGs)的篩選閾值為-value≤0.01且|log2(FC)|≥1。篩選完成后以WWNN處理為對(duì)照, 將4個(gè)處理分為3組進(jìn)行后續(xù)比對(duì)分析: (1) 施氮處理, WWNN vs WWNA; (2) 干旱處理, WWNN vs DSNN; (3) 旱氮同存處理, WWNN vs DSNA。

利用Gene Ontology (GO)數(shù)據(jù)庫(kù)和Kyoto Encyclopedia of Genes and G enomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG Pathway富集分析。

1.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)挑選6個(gè)基因采用qRT-PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證, 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù), 利用基因均一化, 采用2–ΔΔCt方法計(jì)算差異基因相對(duì)表達(dá)量[27]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差分析, 利用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)花生農(nóng)藝性狀的影響

由表2可知, 與WWNN處理相比, WWNA處理增加花生整株生物量, 2020年和2021年增加幅度分別為15.7%和7.1%, DSNN處理降低花生整株生物量, 2020年DSNA處理增加整株生物量, 增加幅度為8.0%。不同水分和氮肥水平對(duì)花生根冠比無(wú)顯著影響, 但施用氮肥降低了不同水分條件下的根冠比。與WWNN處理相比, DSNN及DSNA處理下葉片相對(duì)含水量顯著降低, 2020年和2021年降低幅度分別為21.2%、8.8%和33.1%、12.2%。由此表明, 施用氮肥提高了干旱脅迫下的葉片相對(duì)含水量, 增強(qiáng)了花生的抗旱性。方差分析表明, 2年間氮素水平對(duì)花生生物量、根冠比及葉片相對(duì)含水量均具有顯著效應(yīng), 水分和氮素互作處理對(duì)葉片相對(duì)含水量具有顯著效應(yīng)。

2.2 不同處理對(duì)酚類代謝物質(zhì)含量的影響

不同水分和氮肥水平下, 花生植株的總酚含量和類黃酮含量呈不同變化趨勢(shì)(表3), 各處理地上部和整株總酚含量和類黃酮含量變化趨勢(shì)相同。與WWNN處理相比, WWNA處理顯著降低地上部和整株總酚含量, 2020年降低幅度均為6.9%, 2021年降低幅度分別為9.2%和8.6%; DSNN處理降低了地上部、根系及整株總酚含量, 2021年根系降低幅度最大, 為26.2%。與DSNN處理相比, DSNA處理增加花生總酚含量, 2年平均, 地上部、根系和整株增加幅度分別為7.1%、15.3%和6.2%。

與WWNN處理相比, 2年條件下WWNA和DSNN處理降低了花生地上部及整株類黃酮含量, 2020年降低幅度分別為18.2%、21.5%和17.7%、27.9%; 2021年降低幅度分別為14.1%、15.8%和9.6%、14.8%。與WWNN處理相比, DSNA處理對(duì)地上部、根系及整株類黃酮含量無(wú)顯著影響, 但與DSNN處理相比, DSNA處理增加花生各器官類黃酮含量, 2020年和2021年地上部、根系及整株類黃酮含量的增加幅度分別為28.6%、7.8%、38.2%和6.2%、33.6%、7.5%。方差分析表明, 2021年氮素水平對(duì)花生各器官總酚含量具有顯著影響, 2020年水分和氮素對(duì)地上部和整株類黃酮含量互作效應(yīng)顯著。

2.3 不同處理對(duì)花生根系抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

與WWNN相比, WWNA處理增加花生根系SOD、CAT和POD活性, 增加幅度分別為12.0%、7.9%和63.6%; DSNN和DSNA處理均顯著增加根系POD活性, 增加幅度分別為72.7%和81.8%。與DSNN相比, DSNA處理增加花生根系CAT和POD活性, 增加幅度分別為9.4%和5.3%, 降低了根系MDA含量, 其降幅為6.3% (圖1)。表明干旱脅迫條件下施用氮肥對(duì)花生根系CAT和POD活性影響較大。

表1 qRT-PCR引物信息

表2 不同處理對(duì)花生農(nóng)藝性狀的影響

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(< 0.05)。*和**分別代表< 0.05和< 0.01顯著水平。WW: 正常供水條件; DS: 干旱脅迫; NN: 不施氮肥; NA: 施用氮肥, 90 kg hm–2; W: 水分; N: 氮素; W×N: 水分×氮素。

Mean values followed by different letters within a column are significantly different among treatments at< 0.05.*and**mean significant difference at< 0.05 and< 0.01, respectively. WW: well-watered condition; DS: drought stress; NN: no nitrogen application; NA: nitrogen application of 90 kg hm–2; W: water; N: nitrogen; W×N: water×nitrogen.

表3 不同處理對(duì)花生酚類物質(zhì)含量的影響

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(< 0.05)。*和**分別代表< 0.05和< 0.01顯著水平。處理同表2。

Mean values followed by different letters within a column are significantly different among treatments at< 0.05.*and**mean significant difference at< 0.05 and< 0.01, respectively. Treatments are the same as those given in Table 2.

圖1 不同處理對(duì)花生根系抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響

標(biāo)以不同小寫(xiě)字母的柱值表示處理間在0.05水平上差異顯著。處理同表2。

Bars superscripted by different letters are significantly different at the 0.05 probability level. Treatments are the same as those given in Table 2.

2.4 基因表達(dá)譜

為了解樣本之間的整體關(guān)系, 首先對(duì)基因表達(dá)矩陣進(jìn)行分層聚類, 并使用Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析, 12個(gè)樣本分為2簇: 一簇包含施用氮肥處理的樣本, 其他樣本則聚合為另一簇(圖2-A)。這些轉(zhuǎn)錄組在相同條件下具有良好的生物學(xué)重復(fù)性, 表明花生根系基因表達(dá)對(duì)處理具有穩(wěn)定和獨(dú)特的反應(yīng)。為

系統(tǒng)地探索轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài), 對(duì)不同處理間進(jìn)行了配對(duì)比較(圖2-B), 并確定差異表達(dá)基因, 發(fā)現(xiàn)共有8907個(gè)基因代表至少一種表達(dá)水平的變化。干旱處理下共篩選出差異表達(dá)基因1731個(gè), 施氮處理下篩選出差異表達(dá)基因5396個(gè), 旱氮同存處理下篩選出差異表達(dá)基因7382個(gè), 其中649個(gè)基因在所有處理中均差異表達(dá)。

圖2 不同處理間樣本相關(guān)性分析及花生根系差異表達(dá)基因維恩圖

處理同表2。Treatments are the same as those given in Table 2.

2.5 施氮處理下花生根系差異表達(dá)基因分析

正常供水條件下, 與不施氮肥條件的根系轉(zhuǎn)錄組樣本相比, 施氮處理下分別有1626個(gè)基因表達(dá)上調(diào)和3770個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。為推斷這些差異基因的潛在功能, 本研究進(jìn)行基因本體(GO)分析, 并對(duì)這些基因的序列注釋進(jìn)行了表征。5396個(gè)基因中有4423個(gè)(81.97%)被分配了GO通路(圖3-A), 為生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成3個(gè)部分。這些途徑分為53個(gè)類別, 前5類分別是“催化活性” (2319, 52.43%)、結(jié)合(2259, 51.07%)、膜(1568, 35.45%)、膜部分(1468, 33.19%)和“細(xì)胞過(guò)程” (1233, 27.88%)。GO分析顯示, 碳水化合物代謝過(guò)程(GO:0005975)、脂肪酸結(jié)合(GO:0005504)、脂質(zhì)代謝過(guò)程(GO:0006629)和氧化還原酶活性(GO:0016903)等途徑相關(guān)基因在WWNA處理中顯著上調(diào)富集。

與對(duì)照處理相比, 根據(jù)校正的值, 施氮處理下根系中3943個(gè)差異表達(dá)的DEGs被分配到130個(gè)KEGG途徑, 其中顯著富集通路28條(-value<0.01)。49個(gè)谷胱甘肽代謝途徑(glutathione metabolism, ko00480)、22個(gè)氮代謝途徑(nitrogen metabolism, ko00910)、37個(gè)半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑(cysteine and methionine metabolism, ko00270)的相關(guān)基因在施氮后表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化(圖3-B)。此外, 本研究還鑒定到132個(gè)淀粉和蔗糖的代謝(starch and sucrose metabolism, ko00500)、88個(gè)碳代謝(carbon metabolism, ko01200)和27個(gè)果糖和甘露糖代謝(fructose and mannose metabolism, ko00051)等碳代謝途徑相關(guān)基因顯著變化。表明施用氮肥對(duì)正常供水條件下花生的碳氮代謝有顯著影響。

2.6 干旱處理下花生根系差異表達(dá)基因的分析

干旱脅迫導(dǎo)致根中1176個(gè)基因上調(diào), 555個(gè)基因下調(diào)。功能富集分析表明, DEG以GO形式富集, 大量DEGs與各種應(yīng)激反應(yīng)相關(guān), 如刺激反應(yīng)(GO:0050896)和催化活性反應(yīng)(GO:0003824)、抗氧化活性反應(yīng)(GO:0016209)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性(GO:0004871)和結(jié)合(GO:0005488)。COG分類顯示次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝(secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)及碳水化合物代謝(carbohydrate transport and metabolism)這2類功能相關(guān)基因數(shù)量較多, 占比均在14%以上(圖4-A)。此外, 觀察到根中142種轉(zhuǎn)錄因子在干旱脅迫下表現(xiàn)出顯著的表達(dá)變化, 其中80種轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá), 62種轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)表達(dá)。圖4-B顯示了前15個(gè)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子家族, 大部分AP2/ERF、GRAS和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá), 而bHLH、C2H2和SRS類等轉(zhuǎn)錄因子家族在干旱脅迫下下調(diào)表達(dá)基因數(shù)目較多。

圖3 施氮處理下差異表達(dá)基因的功能注釋分析

AP2/ERF: AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子; GRAS: GRAS轉(zhuǎn)錄因子; WRKY: WRKY轉(zhuǎn)錄因子; G2-like: G2-like轉(zhuǎn)錄因子; LOB: 側(cè)生器官邊界結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子; bHLH: 堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子; C2H2: 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子; NAC: NAC轉(zhuǎn)錄因子; B3-ARF: B3-ARF轉(zhuǎn)錄因子; MYB: MYB類轉(zhuǎn)錄因子; MYB-related: MYB-related轉(zhuǎn)錄因子; B3: B3轉(zhuǎn)錄因子; C2C2-CO-like: C2C2-CO-like轉(zhuǎn)錄因子; bZIP: 堿性亮氨酸拉鏈類轉(zhuǎn)錄因子; SRS: SRS轉(zhuǎn)錄因子。

AP2/ERF: apetala 2/ethylene-responsive element binding factor; GRAS: GRAS transcription factor; WRKY: WRKY transcription factor; G2-like: G2-like transcription factor; LOB: lateral organ boundaries domain transcription factor; bHLH: basic Helix-Loop-Helix transcription facto; C2H2: zinc finger domain transcription factor; NAC: NAC transcription factor; B3-ARF: B3-ARF transcription factor; MYB: MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) transcription factor; MYB-related: MYB (v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog) related transcription factor; B3: B3 domain transcription factor; C2C2-CO-like: C2C2-CO-like transcription factor; bZIP: basic region/leucine zipper motif ; SRS: SRS transcription factor.

2.7 旱氮同存處理下花生根系差異表達(dá)基因的分析

旱氮同存處理下火山圖表明, 7382個(gè)DEGs發(fā)生表達(dá)變化(圖5-A), 其中2585個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá), 4797個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。COG分類顯示DEGs蛋白功能主要集中在一般功能預(yù)測(cè)(general function prediction only)、次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝(secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism)、碳水化合物運(yùn)輸和代謝(carbohydrate transport and metabolism)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝(signal transduction metabolism)等方面(圖5-B)。KEGG通路富集顯示DEGs共富集在130個(gè)通路中, 其中顯著富集通路27條(-value< 0.01), 這些通路涉及初生代謝中的氮代謝(nitrogen metabolism, ko00910)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism, ko00500)、半乳糖代謝(galactose metabolism, ko00052)等途徑; 次生代謝中的苯丙烷生物合成(phenylpropanoid biosynthesis, ko00940)、類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis, ko00941)、異黃酮生物合成(isoflavonoid biosynthesis, ko00943)、異喹啉生物堿生物合成(isoquinoline alkaloid biosynthesis, ko00950)等途徑; 以及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters, ko02010)、玉米素生物合成(zeatin biosynthesis, ko00908)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction, ko04075)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝途徑(圖5-C)。這表明干旱和氮肥交互作用下, 花生植株通過(guò)復(fù)雜的物質(zhì)交換和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)自身適應(yīng)干旱逆境。

對(duì)旱氮同存處理下酚類物質(zhì)相關(guān)的苯丙烷生物合成、類黃酮生物合成及異黃酮生物合成途徑的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。與對(duì)照處理相比, 旱氮同存處理下3種途徑中有51個(gè)差異基因上調(diào)表達(dá), 207個(gè)基因下調(diào)表達(dá)(圖6-A)。聚類分析將4個(gè)處理分為2類(圖6-B), 其中對(duì)照與干旱處理表現(xiàn)出相似的基因表達(dá)模式, 而施氮處理與旱氮同存處理表現(xiàn)出與之相反的調(diào)控模式。與對(duì)照相比, 干旱處理提高了次生代謝酚類相關(guān)物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá), 而旱氮同存處理下次生代謝酚類相關(guān)物質(zhì)合成基因表達(dá)呈相反趨勢(shì)。表明, 與氮肥相比, 花生次生代謝酚類相關(guān)物質(zhì)的合成對(duì)干旱的響應(yīng)更敏感。

(圖5)

圖6 不同處理下酚類物質(zhì)相關(guān)途徑DEGs表達(dá)分析

處理同表2。Treatments are the same as those given in Table 2.

2.8 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)量的準(zhǔn)確性,隨機(jī)挑選了6個(gè)基因進(jìn)行不同處理下的qRT-PCR驗(yàn)證。將qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn), 6個(gè)差異表達(dá)基因與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致(圖7-A～F), 同時(shí)RNA-seq數(shù)據(jù)與qRT-PCR結(jié)果在0.01水平上線性關(guān)系良好,2達(dá)到0.61 (圖7-G), 表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的可靠性, 可以用來(lái)分析不同氮素水平下花生對(duì)干旱脅迫響應(yīng)的差異表達(dá)基因。

3 討論

干旱條件下的養(yǎng)分缺乏會(huì)加劇干旱脅迫的抑制作用[28]。已有研究表明, 適量施氮可以減輕干旱脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制作用, 顯著緩解干旱脅迫的不利影響[29-30]。本試驗(yàn)中, 干旱脅迫顯著降低了花生的生物量和葉片相對(duì)含水量。干旱脅迫下施氮增加了花生生物量和葉片相對(duì)含水量, 增強(qiáng)了花生的抗旱能力。酚類化合物是植物中重要的抗氧化物質(zhì), 植物可以通過(guò)增加酚類化合物的含量來(lái)消除環(huán)境脅迫下產(chǎn)生的氧自由基, 減少環(huán)境脅迫下細(xì)胞的損傷, 增強(qiáng)細(xì)胞的保護(hù)功能[31-32]。酚類物質(zhì)含量的增加及POD和CAT活性的提高對(duì)茶樹(shù)抵制干旱脅迫具有重要作用[33]。適量施用氮肥提高了干旱脅迫下棉花、小麥、玉米等作物葉片的抗氧化酶活性, 降低MDA含量[18,21,34]。本研究表明, 正常供水條件下, 施用氮肥降低花生地上部的總酚和類黃酮含量, 對(duì)根系的總酚和類黃酮含量無(wú)顯著影響。施用氮肥增加了干旱脅迫下花生地上部和根系的類黃酮和總酚含量及POD和CAT活性, 降低了根中MDA含量。由此表明, 根系中類黃酮和總酚含量的增加激發(fā)了細(xì)胞抗氧化反應(yīng), 保護(hù)了細(xì)胞質(zhì)膜的完整性, 增強(qiáng)了花生的抗旱性。

圖7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR 驗(yàn)證

A～F為6個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)圖; G為相關(guān)性分析圖。處理同表2。**,< 0.01。

A–F are the relative expression profiles of six validated genes, respectively; G is the correlation diagram of validated gene. Treatments are the same as those given in Table 2.**,< 0.01.

轉(zhuǎn)錄組分析是鑒定植物響應(yīng)環(huán)境變化關(guān)鍵基因和途徑的重要手段之一。對(duì)不同處理獲得的差異基因進(jìn)行聚類分析表明, 12個(gè)樣品分為施氮和不施氮2組, 表明施氮對(duì)花生根系基因表達(dá)有較大影響。施用氮肥影響了干旱脅迫下花生根系的基因表達(dá)。氮缺乏條件下, 與正常供水條件相比, 干旱脅迫下存在1731個(gè)差異表達(dá)基因, 而氮肥施用條件下干旱脅迫僅得到227個(gè)差異表達(dá)基因。由此表明, 氮肥施用使干旱脅迫下的花生的轉(zhuǎn)錄組圖譜趨于對(duì)照轉(zhuǎn)錄組圖譜, 表明花生對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)依賴于氮素營(yíng)養(yǎng)水平, 與前人在楸樹(shù)中的研究結(jié)果一致[23]。本研究中鑒定的干旱脅迫響應(yīng)基因數(shù)量遠(yuǎn)小于氮素響應(yīng)基因數(shù)量, 這可能是由于花生的根瘤固氮特性使其對(duì)氮素的響應(yīng)更為顯著。不同氮肥水平下根系差異表達(dá)基因主要集中在氮代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程, 與其他作物中氮素影響的基因表達(dá)相一致[35-36]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nitrate transporter, NRT)和銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ammonium transporter, AMT)是氮素吸收運(yùn)輸?shù)?種基因家族。施氮處理下, 花生根系相關(guān)基因在上調(diào)和下調(diào)均有表達(dá), 而相關(guān)基因僅上調(diào)表達(dá)。已有研究表明植物中不同基因家族表達(dá)受氮素水平的調(diào)控上調(diào)或抑制[37], 作物類型、氮素形態(tài)及處理時(shí)間等可能是影響結(jié)果不一致的原因。

干旱脅迫下, 植物會(huì)產(chǎn)生多種抗逆性響應(yīng), 如滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除及碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)等。本研究表明, 干旱脅迫影響了如過(guò)氧化氫分解過(guò)程、活性氧代謝過(guò)程、氧化還原酶活性和過(guò)氧化物酶活性等抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)量。KEGG分析表明, 次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝與碳水化合物代謝等過(guò)程與干旱脅迫密切相關(guān), 與前人在油菜等植物中的研究一致[38-39]。由此表明, 抗氧化系統(tǒng)、次生代謝物質(zhì)及碳水化合物代謝在花生抗干旱脅迫中具有重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子是植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的重要調(diào)節(jié)因子[40]。本試驗(yàn)表明, 干旱脅迫下與AP2/ERF、GRAS和WRKY家族相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá)數(shù)目最多, 而bHLH、C2H2和SRS類等轉(zhuǎn)錄因子家族下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目較多。已有一些研究表明bHLH和C2H2家族的幾個(gè)成員的過(guò)度表達(dá)可以提高抗旱性[41-42]。本研究結(jié)果與前人研究不一致, 可能是干旱脅迫下不同植物中這些轉(zhuǎn)錄因子具有不同的作用。干旱脅迫下不同轉(zhuǎn)錄因子家族中的基因表達(dá)量受到調(diào)控, 這可能促進(jìn)花生對(duì)干旱逆境的適應(yīng)。

旱氮同存處理使根系差異表達(dá)基因集中在次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝、碳水化合物代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)代謝等相關(guān)途徑。次生代謝產(chǎn)物途徑中與酚類物質(zhì)相關(guān)分析表明, 與對(duì)照相比, 旱氮同存處理下41個(gè)與苯丙烷生物合成相關(guān)、11個(gè)類黃酮生物合成相關(guān)、7個(gè)異黃酮生物合成相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)。苯丙烷生物合成途徑的激活有助于各種酚類化合物的積累, 具有清除有害活性氧物質(zhì)的潛力?？寡趸匦詼y(cè)定結(jié)果表明, 施用氮肥增加了干旱脅迫下花生根系的總酚和類黃酮含量。茶樹(shù)中研究表明干旱脅迫下外源施用ABA顯著影響了葉片類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá), 提高了葉片中類黃酮、異黃酮等物質(zhì)含量, 提高了茶樹(shù)的抗旱性[43]。楊樹(shù)中研究亦表明干旱脅迫下施用氮肥增強(qiáng)了抗氧化系統(tǒng)和次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)[44]。由此推測(cè), 外源氮的施用提高了花生根系酚類物質(zhì)合成相關(guān)部分基因的表達(dá), 增加了其酚類物質(zhì)含量, 使其抗氧化酶活性增強(qiáng), 提高了干旱脅迫下花生的抗旱性。酚類物質(zhì)對(duì)花生抗旱性的調(diào)控功能及其合成與代謝基因在花生抵御干旱脅迫中的作用需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)施氮、干旱及旱氮同存處理下花生的植株表型及生理分析表明, 與對(duì)照相比, 旱氮同存處理提高了干旱脅迫下花生生物量與葉片相對(duì)含水量。氮肥施用增加了干旱脅迫下花生根系的總酚和類黃酮含量及其POD和CAT活性, 降低其MDA含量, 提高了花生抗旱性。根系轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 氮肥

施用使根系差異表達(dá)基因主要集中于氮代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑, 而干旱脅迫處理下主要集中于酚類物質(zhì)合成、淀粉和蔗糖代謝、MAPK 信號(hào)通路及玉米素生物合成等途徑。旱氮同存處理下施用氮肥可能通過(guò)調(diào)控次生代謝物(抗氧化酶類、黃酮類、苯丙素等)代謝、碳水化合物代謝等途徑緩解干旱脅迫。

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Physiological and transcriptional regulation mechanisms of nitrogen alleviating drought stress in peanut

DING Hong, ZHANG Zhi-Meng, XU Yang, ZHANG Guan-Chu, GUO Qing, QIN Fei-Fei, and DAI Liang-Xiang*

Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong, China

Nitrogen application has an important effect on plant growth and development under drought stress. The aim of this study is to clarify the physiological and transcriptional regulation mechanism of nitrogen for improving drought resistance in peanut. The physiological indexes and root transcriptome of peanut under nitrogen application, drought stress and drought and nitrogen application simultaneously exist treatments were determined. The results showed that the drought and nitrogen application simultaneously exist treatment increased peanut biomass and the relative water content of leaves under drought stress. The content of total phenols and flavonoids in peanut roots were increased by nitrogen application under drought stress. Meanwhile, the activities of POD and CAT were increased, the content of MDA was decreased, which improved the drought resistance of peanut. Transcriptome analysis showed that the relative expression of 5396 genes changed due to nitrogen application. These genes were mainly involved in glutathione metabolism, nitrogen metabolism, and carbon metabolism, as well as stress and defense responses. Under drought stress, the drought and nitrogen application simultaneously exist treatments, the differentially expressed genes of secondary metabolite biosynthesis, transportation and catabolism and carbohydrate transport and metabolism were enriched. Among the three pathways related to phenolic metabolites, 51 differential genes were up-regulated and 207 genes were down-regulated under the drought and nitrogen application simultaneously exist treatment. In conclusion, the application of nitrogen fertilizer could enhance the antioxidant capacity of peanut plants under drought stress through regulating secondary metabolites and carbohydrate metabolism, and thus improve the drought resistance of peanut.

peanut; drought stress; nitrogen; antioxidant system; transcriptome analysis

10.3724/SP.J.1006.2023.24020

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31971854, 31971856), 山東省花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(SDAIT-04-06)和山東省重大科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2019JZZY010702)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31971854, 31971856), the Shandong Peanut Industry Technology System (SDAIT-04-06), and the Major Scientific and Technological Innovation Projects in Shandong Province (2019JZZY010702).

通信作者(Corresponding author):戴良香, E-mail: liangxiangd@163.com

E-mail: dingpeanut@163.com

2022-01-15;

2022-05-05;

2022-05-13.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220512.1759.008.html

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