基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥鴉膽子治療非小細(xì)胞肺癌的作用機制

桑舒柳，丁蓉珍，姜靖潔，龔亞斌*

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，上海，200437。

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，占所有癌癥死亡的18.4%[1]。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)，其中約85%為非小細(xì)胞肺癌[2]。隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中醫(yī)藥可以改善腫瘤分子靶向藥物耐藥、改善多藥耐藥、逆轉(zhuǎn)化療耐藥、協(xié)同增效及放療增敏，同時減輕放、化療副作用[3]。中醫(yī)藥在治療惡性腫瘤的應(yīng)用范圍越來越廣，通過增效減毒提高患者的生存期和生活質(zhì)量。

中藥鴉膽子（Brucea javanica）為苦木科植物鴉膽子的干燥成熟果實，具有清熱解毒、截瘧、止痢的功效；外用可治療腐蝕贅疣[4]。鴉膽子的臨床應(yīng)用大多是煉成鴉膽子油后被制備成乳劑或者軟膠囊，輔助治療各種癌癥[5]，聯(lián)合放、化療提高其抗癌療效和安全性，緩解腫瘤惡病質(zhì)[6-10]。大量研究表明鴉膽子能通過觸發(fā)活性氧(ROS)的生成、細(xì)胞色素C 的釋放、線粒體凋亡通路的激活以及一系列與癌癥相關(guān)的信號通路和蛋白的調(diào)控來抑制腫瘤細(xì)胞增殖凋亡[11,12]，但其治療非小細(xì)胞肺癌的具體活性成分和機制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能通過可視化數(shù)據(jù)采集分析預(yù)測藥物治療疾病的靶點和機制。因此，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對鴉膽子治療非小細(xì)胞肺癌的主要活性成分和作用相關(guān)通路和靶點進(jìn)行探討，以期為臨床治療疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 化合物有效成分及潛在靶點的收集

以“鴉膽子”為檢索詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http: //tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索其包含的化學(xué)成分，滿足生物利用度（OB）≥ 30%，類藥性（DL）≥0.18 的化合物被選擇。查閱文獻(xiàn)補充 TCMSP 中未預(yù)測到的有效化合物成分，在化源網(wǎng)搜CAS 號隨后在Pubchem 提取化學(xué)成分相對應(yīng)的SMILE 號，在Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中找出SMILE 號對應(yīng)的靶點。

1.2 治療靶點的篩選

設(shè)置關(guān)鍵詞為“non-small cell lung cancer”，檢索Genecard （www.genecards.org） 和DisGeNET（www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫，選擇“Homo sapiens”，檢索出NSCLC 靶點。取鴉膽子活性成分靶點與疾病靶點的并集作為“鴉膽子”治療NSCLC 的潛在靶點，繪制韋恩圖。

1.3 構(gòu)建鴉膽子活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

將上面篩選出的靶點導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.2 軟件，構(gòu)建鴉膽子活性成分-非小細(xì)胞肺癌靶點網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)節(jié)點的度值篩選出其治療NSCLC 的核心化合物。

1.4 構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將 1.2 篩選出的靶點輸入STRING（https://string-db.org） 平臺，選擇“Homo sapiens”，置信度設(shè)為 0.7，獲得蛋白互作關(guān)系。然后導(dǎo)入Cytoscape-3.7.2 中,生成PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，以節(jié)點度值超過其中位數(shù)值、BetweennessCentrality 大于中位數(shù)值為標(biāo)準(zhǔn)篩選出重要靶點。

1.5 GO 與 KEGG 富集分析

將上述1.4 的重要靶點導(dǎo)入Metascape（http://metascape.org/）平臺分析，選擇“Homo sapiens”，進(jìn)行GO 和 KEGG 通路富集分析。

1.6 篩選鴉膽子作用于NSCLC 的核心靶點

將1.4 篩選出的重要靶點導(dǎo)入GEPIA,http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)數(shù)據(jù)庫，選擇“總體生存”和“中位數(shù)”作為篩選條件。P＜ 0.05 和P(HR) ＜ 0.05 作為LUAD 數(shù)據(jù)集的顯著性閾值來篩選鴉膽子作用于NSCLC 的核心靶點。

1.7 化合物-靶點-通路圖

通過R 語言畫出鴉膽子化合物-靶點-通路關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子活性成分篩選和疾病靶點篩選

通過已有文獻(xiàn)報道及TCMSP 以“OB≥30%、DL≥0.18”篩選出鴉膽子活性化合物共16 種。刪除化合物對應(yīng)的靶點重復(fù)值后進(jìn)行合并，共獲得靶點230個。通過GenCards 等數(shù)據(jù)庫收集到NSCLC 相關(guān)靶點共3813個，將鴉膽子和疾病靶點進(jìn)行映射取交集共得到152個交叉靶點，即鴉膽子治療NSCLC 靶點，見圖1。

圖1 鴉膽子和肺癌交集靶點的韋恩圖

2.2 構(gòu)建與分析鴉膽子活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

如圖2，成功構(gòu)建了鴉膽子活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。其中，自由度排名前十的鴉膽子活性成分見表1。

表1 鴉膽子主要活性成分

圖2 鴉膽子活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將鴉膽子治療NSCLC 的152個潛在靶點導(dǎo)入STRING 平臺,根據(jù)置信度＞0.7 進(jìn)行篩選，隨后導(dǎo)入Cytoscape-3.7.2 將結(jié)果可視化。以BetweennessCentrality ＞中位數(shù)值（0.00264092），degree ＞中位數(shù)值（5）為參數(shù)篩選出重要靶點共50個，具體見圖3。

圖3 鴉膽子PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 與KEGG 信號通路分析

對鴉膽子的50個重要靶點進(jìn)行GO 和 KEGG 富集分析，其中生物過程主要包括蛋白質(zhì)磷酸化、調(diào)控細(xì)胞周期等，細(xì)胞成分主要包括周期蛋白依賴的蛋白激酶、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體等，分子功能主要包括蛋白絲氨酸激酶活性等。KEGG 分析顯示鴉膽子治療NSCLC 涉及多種信號通路，主要包括：VEGF 和PI3KAkt 信號通路等，見圖4。

圖4 鴉膽子富集分析網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 鴉膽子成分-NSCLC 治療靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用Cytoscape 建立鴉膽子治療NSCLC 的活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。此網(wǎng)絡(luò)由73個節(jié)點和364條邊組成(圖5)。

圖5 鴉膽子治療NSCLC 成分-靶點-通路圖

2.6 鴉膽子核心靶點分析

在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中搜索39個重要靶點,通過總體生存率篩選出了14個核心靶點(表2)。然后，我們繪制了鴉膽子治療非小細(xì)胞肺癌化合物-靶標(biāo)-通路的關(guān)系圖（圖6）。

表2 鴉膽子核心靶點分析

接上 表2 鴉膽子核心靶點分析

接上 表2 鴉膽子核心靶點分析

圖6 鴉膽子治療NSCLC 成分-核心靶點-通路分析圖

2.7 鴉膽子治療NSCLC 成分-核心靶點-通路分析

我們繪制出鴉膽子治療NSCLC 成分-核心靶點-通路圖，即鴉膽子8 種化合物通過11個核心靶點作用于前20個通路上（通路上沒有富集的靶點被剔除）。

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了鴉膽子治療NSCLC 的作用機制。通過活性成分-疾病靶點的網(wǎng)絡(luò)分析顯示鴉膽子共有16 種化合物。根據(jù)鴉膽子治療NSCLC 成分-靶點-通路圖，鴉膽子同一化合物能調(diào)控不同靶點，而同一靶點又能調(diào)控不同通路，其中木犀草素、鴉膽亭和鴉膽醇共同靶向CDK1 和PTGS2，主要作用于VEGF 信號通路，從而抑制肺癌血管生成。

木犀草素是一種多酚類植物黃酮類化合物，研究表明木犀草素具有良好的抗腫瘤活性[13,14]，通過多種機制抑制癌細(xì)胞的生長，如刺激腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞復(fù)制、腫瘤生長、提高耐藥性、防止癌細(xì)胞侵入和轉(zhuǎn)移[15]。研究表明木犀草素能顯著抑制kras 突變型肺癌的增殖，并下調(diào)IFN-γ誘導(dǎo)的PD-L1 表達(dá)，從而提高kras 突變肺癌的抗腫瘤免疫能力[16]。Zhang M 等[17]通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)木犀草素能通過下調(diào)LIMK1 抑制肺癌細(xì)胞增殖。Wu B 等[18]發(fā)現(xiàn)木犀草素單獨或聯(lián)合腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）均可降低A549 細(xì)胞和H1975 細(xì)胞的活力，增加細(xì)胞凋亡。鴉膽亭 (bruceantin,BCT)是鴉膽子中的主要有效成分，1973年首次被發(fā)現(xiàn)可以從鴉膽子中分離,并具有抗白血病[19]和抗腫瘤作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)[21]鴉膽亭能上調(diào)miR-29a-3p 抑制NSCLC H1299 細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有關(guān)鴉膽亭治療NSCLC 的研究比較鮮見，其作用于NSCLC 的機制值得進(jìn)一步深入探討。有研究表明鴉膽醇是一種新型的STAT3 抑制劑，在結(jié)腸癌體外和體內(nèi)實驗中能抗腫瘤[22]。

細(xì)胞周期依賴性激酶1（Cyclin-dependent kinases 1,CDK1）參與細(xì)胞周期、有絲分裂等過程[23]。研究發(fā)現(xiàn)CDK1 是肺腺癌潛在預(yù)后分子標(biāo)志物[24]，而miR-496 能降低CDK1 的表達(dá)使肺癌A549 細(xì)胞凋亡[25]，同時Chk1 抑制劑在體內(nèi)外實驗中對小細(xì)胞肺癌具有抗腫瘤作用，并能延緩其耐藥[26]。環(huán)氧合酶-2（COX-2）是一種誘導(dǎo)型酶，由PTGS2 基因編碼，被認(rèn)為是“快速反應(yīng)基因”[27]。研究發(fā)現(xiàn)COX-2 在肺腺癌中高表達(dá)[28]，而COX-2 抑制劑能抑制肺癌細(xì)胞增殖，促肺癌細(xì)胞凋亡[29]。

GO 富集分析顯示，鴉膽子的作用靶點與蛋白質(zhì)磷酸化、調(diào)控細(xì)胞周期等生物過程，蛋白絲氨酸激酶活性等分子功能及周期蛋白依賴的蛋白激酶、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體等細(xì)胞成分有關(guān)。KEGG 結(jié)果顯示，鴉膽子治療 NSCLC 涉及多種信號通路。其中，在癌癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，VEGF 在腫瘤血管生成和血管生成依賴性轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用[30]。研究發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞分泌VEGF 的方式為自分泌和旁分泌，激活癌細(xì)胞中的VEGF/VEGFR 信號通路達(dá)到促進(jìn)腫瘤生長的目的[31]。此外，VEGF 在肺腺癌患者中高表達(dá)，表明其預(yù)后較差[32]，在臨床上，抗血管生成藥物能抑制NSCLC，聯(lián)合化療、靶向或免疫治療等可發(fā)揮協(xié)同作用[33]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出鴉膽子中的主要活性成分，構(gòu)建了活性成分-疾病靶點之間的網(wǎng)絡(luò)圖，并得出了鴉膽子治療 NSCLC 潛在的作用靶點及相關(guān)通路，為進(jìn)一步的試驗驗證和臨床治療方面提供了理論基礎(chǔ)。然而本研究的數(shù)據(jù)主要從各個平臺數(shù)據(jù)庫中獲取，具有一定的片面性和局限性，故具體結(jié)果仍需進(jìn)一步實驗驗證。