二球懸鈴木COL5同源基因及其表達模式分析

王 洋，謝 宇，孫海蓮，石 磊，邱 曉，劉亞紅，常 樂，高鳳云

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院 綜合試驗示范中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.華中農(nóng)業(yè)大學，湖北 武漢 430070；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院特色作物研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

二球懸鈴木（Platanus acerifolia）是一球懸鈴木（P.occidentalis）和三球懸鈴木（P.orientalis）的雜交種，為懸鈴木科（Platanaceae）懸鈴木屬（Plantanus spp.）多年生落葉大喬木，株高可達30 m以上。作為一種觀賞植物，二球懸鈴木具有生長速度快、分枝能力強、樹冠廣闊、主干高大等優(yōu)點，還有吸收硫化氫、二氧化硫、氯氣等有毒氣體的作用，不僅適合作為行道樹，也適合作為廠礦綠化樹種[1]。

環(huán)境因子能夠觸發(fā)內(nèi)源信號使其傳導，從而調(diào)控植物發(fā)育階段的轉(zhuǎn)換。基于一套復雜的分子機制，植物能夠準確感應外界環(huán)境的變化，從而調(diào)整發(fā)育策略。對于多年生植物而言，頂端分生組織還受到獨特的生長速率調(diào)控，會在活躍生長與休眠階段之間形成周期性地轉(zhuǎn)換，存在“休眠周期”模型[2]。一年生植物中的CO/FT調(diào)控模塊能夠響應日照變化以控制開花時間，同時它也能夠控制秋季短日照誘導的休眠和萌芽[3]。

CO是光周期途徑中的關(guān)鍵基因，作用是激活下游的FT基因表達，從而誘導植物開花。關(guān)于FT基因成花誘導的機制已有研究，但關(guān)于FT基因調(diào)控休眠的研究還很匱乏。已有相關(guān)試驗證明，二球懸鈴木PaFT基因同時參與了開花和休眠調(diào)控，且已經(jīng)獲得了不同休眠時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[4]，并結(jié)合數(shù)據(jù)分析選定了CO-Like基因家族中的COL5基因作為目標基因，但是，該基因在不同休眠時期的轉(zhuǎn)錄組中存在差異表達，因此有必要明確其對休眠的影響。

FT基因的表達產(chǎn)物被稱為成花素。該基因最初克隆自擬南芥，屬于小型多基因家族PEBP基因家族，該基因家族的特征在于特定的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidylethanolamine-binding proteins，PEBPs）結(jié)構(gòu)域，并且該基因家族成員在控制成花轉(zhuǎn)換方面顯示出核心作用[5-6]。有研究表明，F(xiàn)T基因的缺失會導致野生型擬南芥無論是在長日照條件下還是在短日照條件下均開花延遲，而FT基因的過表達則導致其不依賴于CO基因或光周期的極端早花，說明FT基因是擬南芥開花時間調(diào)控的關(guān)鍵基因。FT基因還具有誘導成花作用并受CO基因的正向調(diào)節(jié)，是CO基因的下游基因，能夠以拮抗方式介導植物的開花信號[7-8]。在合適的光周期調(diào)控下，CO將開花信號傳導至FT基因從而引起植物葉片中FT表達，進而誘導開花[9-11]。研究表明，F(xiàn)T基因不僅能夠在成花轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，植株個體的生理年齡本質(zhì)可能還與FT基因的表達有關(guān)[12]，MaFT基因的高表達水平反映出無性繁殖個體成年期發(fā)育狀態(tài)[13]。有研究表明，PaFT4是光周期和熱信號的集成器，不僅能夠調(diào)控植物生長節(jié)律，還能夠介導芽對光周期和光質(zhì)量的適應[14]。FT基因除了光周期響應，也能夠?qū)囟?、光質(zhì)、熱信號等環(huán)境因子的變化做出響應[15]。上述研究表明，F(xiàn)T通路可以整合光周期和溫度等環(huán)境信號從而調(diào)控植物的開花及休眠進程。

CONSTANS-Like（COL）基因家族具有保守的B-box和CCT結(jié)構(gòu)域，這已在許多物種中被證明[16]。不同物種的CO及其同源基因作用可能并不同[17-18]。長日照下，擬南芥COL9基因超表達株系出現(xiàn)晚花，COL9突變體出現(xiàn)早花表型，COL3突變體在長日照及短日照下均為早花表型，而COL5基因超表達株系僅在短日照下出現(xiàn)早花表型，說明不同CO-Like基因響應的日照長度不同[19]。CO和COL基因在整個植物生命周期中廣泛表達，但并不是所有基因都調(diào)控開花或與光周期相關(guān)[20]。在擬南芥中，AtCOL基因在調(diào)節(jié)開花時間、光形態(tài)發(fā)生、生物鐘、根發(fā)育、生長素信號傳導和花青素積累方面發(fā)揮作用。有研究表明，不同物種中的CO或COL同源基因在植物生長和發(fā)育中具有不同的功能[21]。因此，研究PaCO-Like基因參與的二球懸鈴木休眠調(diào)控具有一定的必要性。本試驗對COL5基因在單一短日照（24℃，8 h/16 h）、單一低溫（8℃，12 h/12 h）和低溫短日照（8℃，8 h/16 h）條件下的響應表達模式進行了研究，同時對二球懸鈴木成年植株柄下芽不同階段COL5基因的表達模式進行了分析，旨在明確COL5基因在表達水平上與二球懸鈴木休眠調(diào)控的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 植物材料

二球懸鈴木的柄下芽均采自華中農(nóng)業(yè)大學校園內(nèi)30～40 a樹齡的成熟二球懸鈴木，于2020—2021年，分別在休眠誘導期的9月17日、9月29日、10月15日，深度休眠期的11月1日、11月15日、12月15日，次年萌芽期的1月15日、2月15日、3月2日直接采集并置于8 L液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

二球懸鈴木實生小苗群體，分別在單一短日照（24℃，8 h/16 h）、單一低溫（8℃，12 h/12 h）和低溫短日照（8℃，8 h/16 h）條件下處理，然后分別處理0（對照）、1、4、7、14、21 d后收集葉片并置于液氮中備用。所有樣品均進行至少3次獨立重復。

1.2 方法

1.2.1 二球懸鈴木CO-Like同源基因的篩選

將休眠誘導期（9—10月）、深度休眠期（11—12月）和次年萌芽期（1—3月）的二球懸鈴木柄下芽作為樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合基因注釋從測序數(shù)據(jù)庫中篩選出表達量有變化的PaCO-Like基因，逐條在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上 比對，將與其他物種中COL5同源基因一致性較高的序列作為克隆對象。

1.2.2 COL5同源基因的克隆

根據(jù)已知的DNA序列信息，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，具體引物見表1，以cDNA為模板進行擴展，克隆得到COL5基因的CDS序列。PCR體系含DNA模板1 μ/L，北京天根有限責任公司生產(chǎn)的10×酶反應緩沖液2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL，北京擎科有限責任公司生產(chǎn)的引物（10 μmol/L）各1 μL，北京天根有限責任公司生產(chǎn)的Taq酶（5 U/L）0.2 μL，加水至20 μL。反應程序為94℃預變性4 min，94℃變性30 s，61℃退火30 s（溫度可變），72℃延伸，共35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用DNA凝膠回收試劑盒將目的片段回收純化，連接于克隆載體pMD18-T上，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a菌株中。通過菌落PCR鑒定，將陽性克隆基因送上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

表1 特異性擴增引物

由于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的PaCOL5基因序列不完整，因此本試驗采用Tail-PCR（交錯式熱不對稱PCR）進行片段補全。Tail-PCR是根據(jù)已知DNA序列，設(shè)計3條同向和退火溫度較高的特異性引物，兼并退火溫度較低的引物（使用MAD1-9和PAD1-2），進行熱不對稱PCR反應。第1次擴增采用Tail-PCR體系，兼并引物（通引）為MAD1-9。Tail-PCR體系含DNA模板1 μL、10×酶反應緩沖液2 μL、dNTP（10 mmol/L）0.4 μL、兼并引物（通引）2 μL、特異性引物2 μL、Taq酶（5 μ/L）0.2 μL，加水至20 μL。第2次擴增采用Tail-PCR體系，模板為第1次擴增產(chǎn)物，兼并引物（通引）為PAD1。第3次擴增采用Tail-PCR體系，模板為第2次擴增產(chǎn)物稀釋20倍，兼并引物（通引）為PAD2。Tail-PCR反應程序及條件見表2。利用瓊脂凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物，將目的片段用DNA凝膠回收試劑盒回收純化后，與克隆載體pMD18-T連接，熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a菌株中，鑒定陽性后送公司測序。

表2 Tail-PCR反應程序及條件

1.2.3 二球懸鈴木RNA的提取

二球懸鈴木器官總RNA的提取采用蔡芳芳[22]的相關(guān)技術(shù)體系。

1.2.4 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析

采用實時熒光定量PCR檢測COL5同源基因在二球懸鈴木中的周期表達模式以及在單一低溫、單一短日照和低溫短日照條件下的響應表達模式。實時熒光定量PCR反應采用Takara公司生產(chǎn)的熒光定量qRT-PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）進行后續(xù)試驗。利用Invitrogen Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，具體引物見表3。提取待測樣本的RNA，隨后經(jīng)北京天根有限責任公司生產(chǎn)的DNA水解酶（DNase）處理后反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，以PaTPI基因為內(nèi)參基因。實時熒光定量PCR反應體系為10 μL，含cDNA模板1 μL、染料0.2 μL、引物（10 μmol/L）各0.2 μL、酶（5 U/L）5 μL，加水至10 μL。反應過程為95℃2 min；95℃5 s，60℃34 s，40個循環(huán)；95℃Melt（溶解曲線）15 s。并用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表3 實時熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 二球懸鈴木COL5同源基因的克隆與序列特征

2.1.1 二球懸鈴木CO-Like5同源基因的克隆

根據(jù)已知的PaCOL5基因片段分別設(shè)計特異性引 物：PaCOL5-1F、PaCOL5-1R和PaCOL5-2F、PaCOL5-2R，以PaCOL5基因表達量較高的二球懸鈴木次年萌芽期的DNA為模板，經(jīng)過測序、拼接和驗證，擴增得到2個PaCOL5基因全長，分別命名為PaCOL5-1、PaCOL5-2，再加上前期已經(jīng)克隆得到的PaCOL5（重新命名為PaCOL5-3）基因作為二球懸鈴木COL5同源基因在二球懸鈴木中的3個復制（圖1）。PaCOL5-1全長為1 444 bp，包括1 134 bp CDS區(qū)，推測編碼377個氨基酸；PaCOL5-2全長為1 371 bp，包括1 131 bp CDS區(qū)，推測編碼376個氨基酸；PaCOL5-3全長為1 186 bp，包括1 125 bp CDS區(qū)，推測編碼374個氨基酸。

圖1 二球懸鈴木COL5同源基因的PCR擴增結(jié)果

2.1.2 二球懸鈴木COL5同源基因預測蛋白序列分析

將所克隆的3條PaCOL5基因的預測蛋白序列與其他物種中同源蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，所有序列中均含有2個B-box和1個CCT結(jié)構(gòu)域，屬于典型的COL蛋白（圖2）。在以PaFT基因作為組外基因繪制的的系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥COL5基因能夠與本試驗克隆得到的3個PaCOL5基因同源基因聚在一起（圖3）。二球懸鈴木COL5同源基因預測蛋白序列與其他植物同源蛋白序列的比對表示該蛋白與荷花（Nelumbo nucifera）、葡萄（Vitis vinifera）中的COL5同源蛋白的親緣關(guān)系很近，暗示它們的功能可能具有保守性。

圖2 二球懸鈴木COL5同源基因預測蛋白序列與其他植物同源蛋白序列的比對

圖3 植物COL5同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 二球懸鈴木COL5同源基因的表達分析

2.2.1 COL5同源基因在二球懸鈴木中的周期表達模式

為了研究二球懸鈴木COL5同源基因的周期表達模式，在休眠誘導期的9月17日、9月29日、10月15日，深度休眠期的10月31日、11月15日、12月15日，次年萌芽期的1月15日、2月15日、3月2日，采集樣品進行了定量實時熒光定量PCR試驗。由圖4可知，二球懸鈴木COL5同源基因PaCOL5-1與PaCOL5-3基因的表達節(jié)律較為相近，基因表達前期與PaCOL5-2的趨勢相似，都是從休眠誘導期較高的表達量開始下降。但是基因表達中后期有所不同，PaCOL5-1與PaCOL5-3都是從12月開始表達量有所上升，但是PaCOL5-2則是從1月才開始上升。這可能是PaCOL5-1和PaCOL5-3基因與PaCOL5-2基因的功能在基因表達中后期出現(xiàn)了分化所致。

圖4 PaCOL5-1（a）、PaCOL5-3（b）和PaCOL5-2（c）基因的周年表達模式分析

2.2.2 PaCOL5在低溫和短日照條件下的響應表達模式

由圖5可知，在單一低溫處理下，僅PaCOL5-1呈現(xiàn)出表達水平下降的趨勢；而PaCOL5-2和PaCOL5-3則沒有表現(xiàn)出明顯的表達規(guī)律。此外，由于PaCOL5-3的表達量極低且誤差較大，因此不能確定該基因的表達模式。在低溫短日照處理下，PaCOL5-1和PaCOL5-3的表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其表達峰值都出現(xiàn)在處理后7 d，而PaCOL5-2的表達水平則沒有發(fā)生明顯的變化。

圖5 PaCOL5-1、PaCOL5-2和PaCOL5-3在單一低溫（a）、單一短日照（b）和低溫短日照（c）條件下的表達模式分析

3 結(jié)論與討論

序 列 比 對 發(fā) 現(xiàn)，PaCOL5-1、PaCOL5-2和PaCOL5-3序列在氨基酸水平上都高度相似。其中，PaCOL5-1和PaCOL5-2序列在氨基酸水平上的相似度為85.1%，PaCOL5-2和PaCOL5-3序列在氨基酸水平上的相似度為84.1%，PaCOL5-1和PaCOL5-3序列在氨基酸水平上的相似度為90.0%。PaCOL5-1、PaCOL5-2和PaCOL5-3擬南芥AtCOL5同源性也較高，達96.1%，但擬南芥COL5基因只有1個單復制，說明二球懸鈴木PaCOL5的3個拷貝是在二球懸鈴木中獨立進化產(chǎn)生的。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)，二球懸鈴木COL5同源基因與荷花的COL5同源基因序列一致性最高，這與系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果一致。基因序列比對和系統(tǒng)進化的結(jié)果均表明本試驗3個目標基因?qū)儆贑OL5同源基因（圖3）。

實時熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PaCOL5呈組成型表達模式，其中次年萌芽期的表達量最高，同時3個基因分別對單一低溫、單一短日照和低溫短日照產(chǎn)生響應表達。根據(jù)周期表達模式分析，PaCOL5-1基因9—10月幾乎不表達，10月底到11月表達量開始迅速上升，1月左右達到最高峰，而后開始下降，這與PaCOL5-2基因的周期表達模式剛好相反，所以PaCOL5-2可能是FT基因上游的負調(diào)因子。PaCOL5-1和PaCOL5-3基因的表達前期與PaCOL5-2的趨勢相似，但是基因表達中后期有所不同，這可能是PaCOL5-1和PaCOL5-3基因與PaCOL5-2基因早期一致，但中后期出現(xiàn)功能分化。PaCOL5-1、PaCOL5-2和PaCOL5-3均可能參與了二球懸鈴木休眠調(diào)控，但是究竟是否屬于FT的直接或間接上游調(diào)控因子還需要后期通過蛋白/啟動子互作來進一步驗證。

本試驗中PaCOL5-1和PaCOL5-3均對低溫短日照條件有所響應，在處理7 d后會出現(xiàn)1個峰值，因此，可以推測這兩個基因可能與休眠環(huán)境因子的響應相關(guān)。PaCOL5-2對低溫短日照條件的響應不明顯，分析認為一方面可能是由于處理時間過短，該基因還未產(chǎn)生響應表達；另一方面，也可能是該基因與休眠環(huán)境因子響應不相關(guān)。從單一低溫和單一短日照條件處理中分析得出，單一低溫會抑制PaCOL5-1的表達，而單一短日照沒有表現(xiàn)出明顯的表達規(guī)律。綜上，PaCOL5-1、PaCOL5-2和PaCOL5-3基因?qū)我画h(huán)境因子的響應表達程度不同，可能在二球懸鈴木不同的休眠階段具有協(xié)同調(diào)控的作用。