小麥籽粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）積累及其與容重的相關(guān)性分析

何賢芳，董 旭，趙 莉，都斌斌，盧茂昂，鄧 騁，汪建來

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所，安徽 合肥 230031；2.安徽省植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，安徽 合肥 230031；3.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；4.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，安徽 合肥 230036）

19世紀(jì)中后期，小麥赤霉病在長(zhǎng)江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)普遍發(fā)生，在我國(guó)冬小麥主要種植區(qū)黃淮海麥區(qū)和北方冬春麥區(qū)僅零星發(fā)生[1]。近年來，小麥赤霉病在黃淮海麥區(qū)也逐年加重，大流行年份不僅使小麥產(chǎn)量下降10%～50%，而且病菌產(chǎn)生的真菌毒素也會(huì)污染籽粒，造成大比例無效低端供給，影響種植效益與食品安全[2-3]。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），也稱嘔吐毒素，是由小麥赤霉病菌禾谷鐮刀菌復(fù)合群（Fusarium graminearum species complex）產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素[4]，研究表明，DON及其衍生物是小麥籽粒最容易感染的真菌毒素，具有很強(qiáng)的毒性[5-9]，能夠引起厭食、惡心、嘔吐、腹瀉、站立不穩(wěn)和反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)損壞造血系統(tǒng)[9]。

在我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)中，糧谷類占比遠(yuǎn)高于西方國(guó)家，因此嚴(yán)格控制谷物籽粒中的DON含量意義重大。我國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017[10]規(guī)定小麥等谷物及其制品中DON含量不得超過1 000 mg/kg，GB 13078—2017規(guī)定麥類飼料原料中的DON含量不得超過5 000 mg/kg[11]，以上標(biāo)準(zhǔn)是我國(guó)強(qiáng)制執(zhí)行的食品安全標(biāo)準(zhǔn)和飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。DON理化性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)高壓、高熱和弱酸環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性，谷物磨粉、日常食物烹調(diào)和加工等處理方式都很難將其破壞。目前，DON在小麥等谷物及其制品中的污染和防控是全球面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，研究高效、安全的降解技術(shù)，確保消費(fèi)者安全，已成為世界各國(guó)政府和公眾關(guān)注的熱點(diǎn)問題[12]。

如何有效地控制小麥等谷物中真菌毒素的產(chǎn)生，降低真菌毒素的含量，對(duì)于保障谷物食用安全具有重要意義[13]。研究表明，不同小麥品種對(duì)赤霉病的抗性水平和耐毒素積累能力有顯著差異，種植赤霉病抗性品種可以顯著降低籽粒中的DON含量[14]。因此，篩選具有穩(wěn)定抗赤霉病和耐毒素積累的品種是防控赤霉病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。鑒于此，本試驗(yàn)選用65份不同遺傳背景的小麥品種，在自然發(fā)病條件下調(diào)查不同品種籽粒的赤霉病病粒率（FDK），測(cè)定DON、3A-DON（3-acetyldeoxynivalenol）、15A-DON（15-acetyldeoxynivalenol）含量，分析其對(duì)籽粒容重的影響，以期篩選具有低毒素積累、高容重指標(biāo)的小麥品種，從而為可以大面積生產(chǎn)的品種選擇利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試小麥品種65個(gè)，其中，河南審定品種7個(gè)、安徽審定品種28個(gè)、江蘇審定品種21個(gè)、山東審定品種9個(gè)；白皮半冬性品種56個(gè)、紅皮春性品種9個(gè)，具體品種信息見表1。DON標(biāo)準(zhǔn)品（加拿大TRC標(biāo)準(zhǔn)品公司），3A-DON、15A-DON（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司），純度均在98%以上。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Waters公司（型號(hào)為XEVO TQ-Smicro），HGT-1000型容重器購(gòu)自上海東方衡器有限公司。

表1 65份小麥品種名稱及來源

1.2 方法

1.2.1 田間設(shè)置

2019年10月30日—2020年5月30日于安徽省普濟(jì)圩農(nóng)場(chǎng)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地種植。每個(gè)品種5行，行長(zhǎng)2.5 m，行距0.25 m，每行播種量為10 g，進(jìn)行常規(guī)的田間管理，不防治小麥赤霉病。

1.2.2 性狀調(diào)查

于小麥完熟期全區(qū)收獲，脫粒。從收獲籽粒中取樣，調(diào)查500粒籽粒中感染赤霉病的數(shù)量（FDK），3次重復(fù)[15]。

FDK/%=（赤霉病病粒數(shù)/500）×100

千粒重測(cè)定：將調(diào)查赤霉病病粒率的500粒籽粒樣品稱重，換算成千粒重，3次重復(fù)；容重測(cè)定：采用GB/T 5498—2013（糧油檢驗(yàn)容重測(cè)定）[16]方法，測(cè)定樣品籽粒容重。DON含量測(cè)定：采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18（]LC-MS/MS）檢測(cè)小麥籽粒中DON、3A-DON、15A-DON含量。

1.2.3 儀器檢測(cè)條件

液相色譜條件為：色譜柱ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm；流動(dòng)相A—水（0.1%甲酸）、B—乙腈（0.1%甲酸）；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫40℃；洗脫方式為梯度洗脫；B相初始濃度為5%；洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

表3 MRM檢測(cè)參數(shù)

前處理方法為：準(zhǔn)確稱取粉碎混勻的試樣20 g（精確至0.01 g）于150 mL三角瓶中，加入20 mL水、40 mL乙腈（1%甲酸）溶液，5 000 r/min勻漿1 min，振蕩提取10 min，加入4 g無水硫酸鎂和8 g氯化鈉，振搖2 min，取上清液至50 mL離心管，5 000 r/min離心3 min，靜置。取2 mL上層溶液，氮吹至近干，用甲醇/水（體積比為40/60）定容至2 mL，過0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜，待超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 65個(gè)小麥品種籽粒FDK與DON含量及容重

由表4可知，隨著FDK的增大，籽粒中3A-DON、15A-DON及DON-Total的積累量逐漸增加，平均容重下降。從品種的FDK分布看，F(xiàn)DK在0.01%～2.00%的品種有34個(gè)（占比52.31%），DON和DON-Total含量分別為1.68、1.83 mg/kg，毒素含量均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求的2 mg/kg；FDK在2.01%～4.00%的品種有18個(gè)（占比27.69%），DON和DON-Total含量分別為2.39、2.57 mg/kg；FDK在4.01%～6.00%的品種有9個(gè)（占比13.85%），DON和DON-Total含量分別為2.72、2.94 mg/kg；FDK≥6.01%的品種有4個(gè)（占比6.15%），DON和DON-Total含量分別為2.70、2.96 mg/kg。不同F(xiàn)DK級(jí)別的平均容重為L(zhǎng)1（754.12 g/L）＞L2（748.59 g/L）＞L3（744.61 g/L）＞L4（740.60 g/L），只有L1級(jí)別的籽粒平均容重達(dá)到三等小麥標(biāo)準(zhǔn)，其他級(jí)別的小麥籽粒平均容重均未達(dá)標(biāo)。65個(gè)小麥品種容重在750.00～770.00 g/L的品種有23個(gè)，770.00～790.00 g/L的品種有10個(gè)，在790.00 g/L以上的品種僅有2個(gè)。

表4 65個(gè)小麥品種籽粒FDK與DON含量及容重

2.2 不同抗性小麥品種籽粒中DON積累量與容重的相關(guān)性分析

由圖1可知，F(xiàn)DK與小麥籽粒中積累的DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.514、0.549、0.529、0.521；與容重呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.254。籽粒中積累的DON、3A-DON、15A-DON含量?jī)蓛芍g呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），且與DON-Total呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.999、0.911、0.899；與容重呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.502、-0.504、-0.481。綜上所述，F(xiàn)DK越高，籽粒中積累的DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total含量越高，容重越小，商品等級(jí)越低。

圖1 不同品種指標(biāo)間相關(guān)性分析

2.3 不同來源小麥品種籽粒中DON積累與容重表現(xiàn)

不同來源小麥品種赤霉病抗性表現(xiàn)見圖2。65份小麥品種來源于江蘇21份（占32.31%）、安徽28份（占43.08%）、山東9份（占13.85%）、河南7份（占10.77%）。從樣品籽粒FDK均值看，不同來源樣品表現(xiàn)為江蘇（1.73%）＜安徽（2.22%）＜山東（3.64%）＜河南（4.26%），說明江蘇小麥品種的赤霉病抗性整體最優(yōu)。從不同品種來源看，籽粒中DON積累量表現(xiàn)為江蘇（1.51 mg/kg）＜安徽（2.06 mg/kg）＜河南（2.75 mg/kg）＜山東（2.98 mg/kg）；3A-DON含量表現(xiàn)為江蘇（0.047 mg/kg）＜安徽（0.075 mg/kg）＜山東（0.111 mg/kg）＜河南（0.113 mg/kg）；15A-DON表現(xiàn)為江蘇（0.059 mg/kg）＜安徽（0.090 mg/kg）＜山東（0.132 mg/kg）＜河南（0.141 mg/kg）和DON-Total表現(xiàn)為江蘇（1.61 mg/kg）＜安徽（2.23 mg/kg）＜河南（3.00 mg/kg）＜山東（3.23 mg/kg）。不同來源小麥籽粒中DON≤2 mg/kg的品種數(shù)及占比表現(xiàn)為安徽（18個(gè)，64.29%）＞江蘇（13個(gè)，61.90%）＞山東（2個(gè)，22.22%）＞河南（1個(gè)，14.29%）。籽粒容重是衡量收獲小麥商品等級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)。由圖2可知，不同來源小麥品種的容重均值表現(xiàn)為江蘇（758.57 g/L）＞安徽（751.90 g/L）＞河南（739.71 g/L）＞山東（735.27 g/L），江蘇和安徽的小麥籽粒容重均值達(dá)到三等小麥水平，商品品質(zhì)好于河南、山東二省，這與江蘇和安徽小麥品種籽粒中較低的FDK和DON積累量相吻合。

圖2 不同來源小麥品種籽粒中DON積累量與容重

2.4 不同小麥品種籽粒中DON積累量、容重差異性分析

不同小麥品種籽粒中DON積累量與容重差異見表5。由表5可知，品種間赤霉病抗性存在差異，不同品種間FDK變幅為0.20%～7.80%，均值為2.48%，變異系數(shù)為0.73，F(xiàn)DK最小的品種為V57和V58，最大的品種為V45。從DON積累量來看，不同品種間DON含量為0.11～4.26 mg/kg，均值為2.08 mg/kg，變異系數(shù)為0.46，積累量最小的品種為V58，積累量最大的品種為V1。3A-DON和15A-DON積累量最小的品種相同，均為V57、V58、V59、V60，二者積累量最大的品種均為V1。從DON-Total含量看，積累量最小品種為V58，積累量最大的品種仍為V1，不同品種間差異較大，變幅為0.11～4.65 mg/kg。65個(gè)品種容重為703.00～791.70 g/L，容重最低的品種為V19，最高的品種為V7。篩選出自然發(fā)病條件下DON≤2 mg/kg且容重≥770.00 g/L品種8個(gè)，分別為V17（淮麥40）、V18（淮麥44）、V29（農(nóng)麥152）、V31（荃麥725）、V44（渦麥9號(hào)）、V47（徐農(nóng)029）、V54（淮麥45）和V59（國(guó)紅6號(hào)）。

表5 65份小麥品種籽粒DON含量、容重差異性分析

3 討論與結(jié)論

3.1 不同小麥品種籽粒DON含量存在差異

研究表明，DON在不同類型小麥籽粒中分布不同，主要集中在赤霉病病粒、發(fā)芽粒等不完善粒中[19]。小麥中DON含量與不完善粒之間存在正相關(guān)性，特別是與赤霉病病粒和發(fā)芽粒之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，而在色澤正常顆粒飽滿籽粒中分布較低[20-21]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，自然發(fā)病條件下65個(gè)品種間DON含量為0.11～4.26 mg/kg，DON-Total為0.11～4.65 mg/kg，說明不同品種毒素積累存在差異。隨著籽粒中FDK增加，樣品中DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total的積累量增加，并且均與FDK呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.514、0.549、0.529和0.521，由此可知，雖然不同品種赤霉病感染程度對(duì)DON積累響應(yīng)不同，但積累趨勢(shì)一致，表現(xiàn)為籽粒中FDK越高，DON含量越高。積累的DON、3A-DON、15A-DON及DON-Total含量與容重呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.502、-0.504、-0.481、-0505，說明樣品籽粒中積累的DON含量越高，樣品容重越小，籽粒商品等級(jí)越低。安徽省銅陵市赤霉病發(fā)生強(qiáng)度較安徽沿淮、淮北地區(qū)常年偏重，試驗(yàn)在自然發(fā)病條件下，篩選出8個(gè)DON≤2 mg/kg且容重≥770.00 g/L小麥品種，其中半冬性品種7個(gè)（分別為淮麥40、淮麥44、農(nóng)麥152、荃麥725、渦麥9號(hào)、徐農(nóng)029、淮麥45），春性品種1個(gè)（國(guó)紅6號(hào)）。試驗(yàn)結(jié)果可為小麥生產(chǎn)和品種選擇利用提供參考依據(jù)，同時(shí)建議將抗（耐）真菌毒素積累分析納入小麥育種及生產(chǎn)品種利用評(píng)價(jià)體系中。

3.2 不同來源小麥品種赤霉病抗性水平存在差異

當(dāng)前小麥生產(chǎn)上存在品種多、亂、雜現(xiàn)象，不同小麥品種間存在赤霉病抗性差異較大的情況。由于赤霉菌是半腐生菌，不存在對(duì)其免疫的小麥品種。目前抗病品種可通過延緩病菌在穗部擴(kuò)展以降低毒素積累，而對(duì)感病品種而言，基本上是可防不可治[22]。因此持續(xù)開展不同小麥品種赤霉病抗性鑒定，培育和篩選抗（耐）赤霉病小麥品種尤為重要。本試驗(yàn)結(jié)果表明，65個(gè)不同來源的小麥品種中，江蘇省小麥品種的赤霉病抗性表現(xiàn)最優(yōu)，籽粒FDK和DON含量最低，籽粒商品性最好。從各省DON含量≤2 mg/kg品種數(shù)和占各自省份材料比例看，安徽（18個(gè)，64.29%）＞江蘇（13個(gè)，61.90%）＞山東（2個(gè)，22.22%）＞河南（1個(gè)，14.29%），說明近年來在安徽審定的品種赤霉病抗性有所提高，同時(shí)也說明在一定發(fā)病壓力下的持續(xù)定向選擇有助于品種整體抗性的提升。

3.3 小麥育種科研工作中籽粒DON含量的初步鑒定方法

DON是小麥中檢出率最高、危害最嚴(yán)重的真菌毒素，已成為關(guān)系糧食安全和食品安全的重要問題。實(shí)時(shí)了解DON的污染情況并有針對(duì)性地對(duì)其防控，對(duì)確保糧食和食品安全具有重要意義，因此，世界各國(guó)政府都十分重視對(duì)DON的污染分析和定期監(jiān)測(cè)[12]。目前，常用的DON檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)[23]、高效液相色譜法[24-25]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[26]等，這些方法都具有專一性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但不同方法還存在“需要高質(zhì)量的抗體”[23]以及“專業(yè)檢測(cè)設(shè)備”“樣品前處理繁瑣耗時(shí)長(zhǎng)”“檢測(cè)費(fèi)用高”等應(yīng)用問題[26]，應(yīng)用于日常、現(xiàn)場(chǎng)糧食收購(gòu)或大批量育種材料等普及型檢測(cè)中還較為困難。熊前程等[27]研究表明，收購(gòu)過程中小麥籽粒中DON含量隨著赤霉病粒的增加而逐漸增加，同時(shí)劣化品質(zhì)。樊平聲等[28]用DON含量對(duì)小麥赤霉病損失率進(jìn)行評(píng)估得出小麥乳熟期病情指數(shù)達(dá)到0.4%～3.2%，麥谷中DON毒素濃度達(dá)到1 mg/kg的籽粒將不能作為糧食進(jìn)行流通。不同小麥品種對(duì)赤霉病的抗性水平和耐毒素積累的能力有顯著性差異，種植赤霉病抗性品種可以顯著降低籽粒中的DON含量[14]，解決小麥赤霉病最有效的途徑是培育具有良好抗性的小麥品種[14]。因此，如何利用小麥籽粒容重指標(biāo)和赤霉病病粒率來初步估算籽粒中DON含量，并在小麥?zhǔn)袌?chǎng)收購(gòu)及抗（耐）赤霉病種質(zhì)資源創(chuàng)新與新品種選用中加以應(yīng)用值得進(jìn)一步探討。