大氣CO2濃度和氣溫升高下硝化抑制劑后效對大豆土壤無機(jī)氮和N2O排放的影響

李 超，郝興宇，李 萍，宗毓錚，張東升，史鑫蕊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，太谷 030801）

大豆是我國重要的糧油兼用作物，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和廣泛的用途。充足的氮素供應(yīng)是保障大豆生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。尿素作為主要的氮肥類型，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有很大的比重，但我國尿素氮的利用效率較低，僅為30%～40%。過量的尿素施用使土壤中的氮素殘留量增加，增加了氮素向地下水淋失的風(fēng)險(xiǎn)，氨揮發(fā)、N2O等氣體損失的增加也對大氣環(huán)境造成了一定的危害［1］。

通過添加硝化抑制劑來調(diào)控土壤中的氮轉(zhuǎn)化過程，是提高尿素氮的使用效率并減少環(huán)境污染的有效途徑之一［2-3］。章淑艷等［4］的研究指出，氮肥基施配合硝化抑制劑可有效增加小豆的產(chǎn)量，并提高氮肥的利用效率。土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮是作物吸收的主要氮素形態(tài)。在硝化抑制劑的作用下，土壤中的氮轉(zhuǎn)化過程，特別是硝化作用發(fā)生變化，進(jìn)而對土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量產(chǎn)生影響［2，5］。N2O是土壤硝化和反硝化過程的中間產(chǎn)物，其排放強(qiáng)度與土壤無機(jī)氮含量以及硝化反硝化酶活性密切相關(guān)。大量研究結(jié)果表明，添加硝化抑制劑可提高水稻等作物的產(chǎn)量和氮素利用效率，增加土壤中的硝態(tài)氮含量，降低銨態(tài)氮含量，N2O排放量也顯著降低，但是不同的環(huán)境條件、硝化抑制劑類型等會(huì)使硝化抑制劑的作用效果產(chǎn)生一定的差異［6-7］。近年來，已有大量的學(xué)者對采用硝化抑制劑下不同作物生長及土壤氮轉(zhuǎn)化過程進(jìn)行了研究，但是大多數(shù)都僅關(guān)注了硝化抑制劑在當(dāng)季作物生長過程中的影響，關(guān)于硝化抑制劑后效對下茬作物土壤氮轉(zhuǎn)化影響的研究還相對較少。

氣候條件是影響土壤-作物系統(tǒng)氮循環(huán)過程的主要因素。隨著全球氣候變暖的加劇，其已對全球范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生了深刻的影響。國內(nèi)外已有大量研究報(bào)道了關(guān)于大氣CO2濃度或氣溫升高對氮循環(huán)的影響。研究指出，大氣CO2濃度升高和適當(dāng)?shù)脑鰷乜梢蕴岣咄寥烂富钚裕铀俚D(zhuǎn)化，增強(qiáng)土壤氮礦化、硝化和反硝化作用，從而使農(nóng)田N2O的排放量增加［8］。在氣候變化的背景下，如何在保證產(chǎn)量的同時(shí)提高氮利用效率，并降低溫室氣體的排放，是當(dāng)前亟待解決的問題。在氣溫和大氣CO2濃度升高的條件下，添加硝化抑制劑能否減輕N2O的排放尚不明確。對于小麥-大豆輪作模式，前茬小麥添加硝化抑制劑對于下茬大豆土壤中的N2O排放、無機(jī)氮含量和相關(guān)酶活性的影響有待深入研究。

本研究于山西省晉中市太谷區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地控制氣室內(nèi)進(jìn)行，研究不同的環(huán)境條件（大氣溫度和CO2濃度）下，小麥季添加硝化抑制劑對大豆生長季土壤的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量、土壤硝化-反硝化相關(guān)酶活性以及N2O排放量的影響，探討氣候變化背景下添加硝化抑制劑的作用效果。該研究可為未來氣候變化背景下大豆生產(chǎn)中溫室氣體減排及硝化抑制劑的合理利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和供試材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于山西省晉中市太谷區(qū)（37.42°N，112.58°E）山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地控制氣室內(nèi)。該地區(qū)屬溫帶大陸性氣候，海拔767～900 m，年平均氣溫7～9℃，平均日照時(shí)數(shù)2 500～2 600 h。年平均積溫在3 250～3 500℃之間，無霜期130～160 d，年平均地溫13℃，年降水量450～500 mm。試驗(yàn)所用土壤類型為黏壤土，土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為24.50 g/kg、1.40 g/kg、45.28 mg/kg、25.65 mg/kg、280.50 mg/kg，土壤pH值為8.2。供試大豆［Glycinemax(L.) Merr.］品種為中黃35，由中國農(nóng)科院作物科學(xué)研究所培育。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在4個(gè)獨(dú)立的控制氣室內(nèi)進(jìn)行。氣室為鋁合金框架玻璃結(jié)構(gòu)（長×寬×高：8.0 m×3.0 m×3.2 m），采用自然光，玻璃透光率為80%～90%。4個(gè)氣室分別為CK（環(huán)境CO2濃度+環(huán)境溫度）、EC（CO2濃度升高200 μmol/mol+環(huán)境溫度）、ET（氣溫升高2℃ +環(huán)境CO2濃度）與ECT（CO2濃度升高200 μmol/mol+氣溫升高2℃）。氣室溫度和CO2濃度由自動(dòng)控制系統(tǒng)控制。

試驗(yàn)在控制氣室條件下采取盆栽設(shè)計(jì)，在塑料整理箱（長×寬×高：60 cm×40 cm×30 cm）中進(jìn)行，取農(nóng)田耕層土壤過篩混勻，每箱裝土30 kg，深約28 cm。盆栽試驗(yàn)為小麥-大豆輪作，小麥（TriticumaestivumL.）播種前施底肥（105.32 kg/hm2N、65.49 kg/hm2P和74.00 kg/hm2K），拔節(jié)期進(jìn)行追肥，追肥與底肥的質(zhì)量比為1∶1。小麥生長季在每個(gè)氣室均設(shè)置了普通尿素與硝化抑制劑氮肥2個(gè)肥料處理，硝化抑制劑氮肥為普通尿素加0.1%吡啶混施。人工收獲小麥后，用秸稈粉粹機(jī)將各氣室小麥粉碎，分別均勻地還田到各氣室盆中，大豆生長季不再施肥。2018年6月20日播種大豆，在每個(gè)整理箱中縱向開兩排小溝播種大豆種子，出苗后每排留苗10株，10月2日收獲大豆。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，在氣室中完全隨機(jī)排列。期間視土壤含水量狀況進(jìn)行灌水，保證無干旱脅迫。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

分別于大豆鼓粒期（2018年8月26日）、成熟期（2018年10月2日）用土鉆從每個(gè)盆中隨機(jī)取0～10 cm耕層的土壤，每盆3鉆，手動(dòng)除去肉眼可見的植物殘?jiān)?、石塊和其他雜質(zhì)。將土壤樣品充分混合，研磨過篩風(fēng)干后保存在室溫下，用于測定各個(gè)生育時(shí)期的酶活性和礦質(zhì)氮含量。

土壤銨態(tài)氮含量采用氯化鉀（KCl）浸提-靛酚藍(lán)比色法測定，土壤硝態(tài)氮采用雙波長紫外分光光度計(jì)法測定［9］。

土壤硝酸還原酶和土壤亞硝酸還原酶活性采用北京Solarbio公司的活性檢測試劑盒進(jìn)行測定，土壤氨單加氧酶和氧化亞氮還原酶采用上海撫生實(shí)業(yè)的酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Sigmaplot 12.5進(jìn)行圖表繪制，使用SPSS22單因素ANOVA對顯著性進(jìn)行分析，采用Turkey法對P值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大氣CO2濃度和氣溫升高下硝化抑制劑對大豆土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響

在大豆鼓粒期施用普通尿素時(shí)，EC、ET和ECT處理的土壤硝態(tài)氮含量分別比CK增加了30.85%、134.12%和48.28%，而在添加硝化抑制劑的條件下分別增加了28.96%、110.89%和81.92%。成熟期施用普通尿素和添加硝化抑制劑的條件下，EC、ET和ECT的土壤硝態(tài)氮含量分別較CK增加了111.39%、194.93%、87.52%和11.95%、43.39%、29.04%。整體上看，ET和ECT處理的硝態(tài)氮含量均顯著高于CK，但EC與CK處理差異不顯著。與施用尿素相比，添加硝化抑制劑對鼓粒期和成熟期的土壤的硝態(tài)氮含量影響較小，僅鼓粒期ECT處理、成熟期CK和ECT處理的硝態(tài)氮含量顯著高于普通尿素（圖1a、1b）。

升溫條件下，土壤銨態(tài)氮的含量顯著降低，鼓粒期施用普通尿素和硝化抑制劑分別比CK降低了46.66%和48.61%，成熟期分別降低了6.60%和25.07%。相較成熟期，鼓粒期的銨態(tài)氮降低幅度更大。EC和ECT處理的土壤銨態(tài)氮含量均有所增加，但與CK處理差異不顯著。與施用普通尿素相比，在不同的環(huán)境條件下，添加硝化抑制劑鼓粒期土壤的銨態(tài)氮含量均略有增加，僅CK處理差異顯著，其余條件下差異均不顯著。成熟期添加硝化抑制劑對土壤銨態(tài)氮含量的影響均不明顯（圖1c、1d）。

圖1 CO2濃度和氣溫升高對大豆土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effects of elevated CO2 concentration and increased temperature on soil nitrate and ammonium nitrogen content of soybean

由此可見，整體上氣溫升高使大豆土壤的銨態(tài)氮含量降低，硝態(tài)氮含量升高，且對鼓粒期的影響更為顯著。大氣CO2濃度增加（EC）或者同時(shí)升高氣溫和CO2濃度（ECT）對土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的影響較升溫（ET）小，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量均有所增加，但是差異不顯著。小麥季施用尿素中添加硝化抑制劑整體上使下茬作物大豆土壤中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量均有所增加，但是增加的效果不明顯。成熟期土壤的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量均低于鼓粒期。

2.2 大氣CO2濃度和氣溫升高下硝化抑制劑對大豆土壤硝化反硝化酶活性的影響

氨單加氧酶是土壤硝化作用的主要限速酶，可以將銨根離子氧化為羥胺，硝化抑制劑也主要在此過程中發(fā)生作用。從圖2可以看出，除成熟期ET處理外，添加硝化抑制劑后氨單加氧酶活性均降低。在鼓粒期，與CK相比，EC處理的氨單加氧酶活性變化不明顯，而ET和ECT處理的氨單加氧酶活性顯著降低，施用尿素和硝化抑制劑后氨單加氧酶活性分別降低了20.13%（ET）、22.26%（ET）和20.61%（ECT）、24.73%（ECT）（圖2a）。成熟期的氨單加氧酶活性整體低于鼓粒期，且不同環(huán)境條件下添加硝化抑制劑對氨單加氧酶活性影響均不顯著，ET和ECT處理的氨單加氧酶活性顯著高于CK處理，施用尿素和硝化抑制劑后分別增加了43.03%（ET）、34.43%（ET）和22.78%（ECT）、24.37%（ECT）。成熟期EC和CK處理的氨單加氧酶活性差異不顯著（圖2b）。

硝酸還原酶、亞硝酸還原酶和氧化亞氮還原酶均是反硝化過程的關(guān)鍵酶，其活性可以反應(yīng)土壤反硝化能力的強(qiáng)弱。從圖2c和2d來看，與CK相比，鼓粒期ET處理的硝酸還原酶活性顯著提高，EC和ECT處理的硝酸還原酶活性與CK沒有顯著差異。成熟期不同環(huán)境條件下的硝酸還原酶活性沒有鼓粒期差異大，CK、EC和ECT處理的硝酸還原酶活性較鼓粒期均有所提高，ET處理變化不明顯。

圖2 CO2濃度和氣溫升高對大豆土壤硝化反硝化酶活性的影響Fig.2 Effects of elevated CO2 concentration and increased temperature on soil nitrifying and denitrifying enzyme of soybean

鼓粒期不同環(huán)境條件下，亞硝酸還原酶活性差異不明顯（圖2e）。成熟期施用普通尿素時(shí)，EC和ET處理的亞硝酸還原酶活性較CK處理分別顯著降低了26.35%和24.43%，ECT比CK降低了7.11%，但與CK差異不顯著（圖2f）。

鼓粒期未添加硝化抑制劑時(shí)，ET處理的氧化亞氮還原酶活性最高，但不同環(huán)境條件下的氧化亞氮還原酶活性差異均不顯著；添加硝化抑制劑時(shí)，ET處理顯著高于CK和EC處理，ET與ECT處理差異不明顯（圖2g）。成熟期時(shí)，各處理氧化亞氮還原酶活性較鼓粒期均顯著提升，ET和ECT條件下，添加硝化抑制劑時(shí)氧化亞氮還原酶活性較普通尿素處理顯著降低；ECT處理在未添加硝化抑制劑時(shí)的氧化亞氮還原酶活性最高，顯著高于其余處理（圖2h）。

2.3 大氣CO2濃度和氣溫升高下硝化抑制劑對大豆土壤N2O排放的影響

在大豆整個(gè)生長季中N2O排放有2個(gè)峰值，分別為7月初和9月—10月（圖3）。第一個(gè)排放峰值在7月5日左右，主要是ECT和ET 2個(gè)處理在施用普通尿素時(shí)有明顯的排放峰值，明顯高于其余處理。大部分的N2O排放發(fā)生在生育后期（9月4日—10月10日），該時(shí)期不同處理的N2O排放量占到整個(gè)生育期排放量的34.16%～90.68%，其中ET、ECT處理最高。該階段在ET條件下施用普通尿素和硝化抑制劑時(shí)，N2O排放量占到整個(gè)生育期排放量的76.47%和90.68%，在ECT條件下的排放量分別占全生育期的59.97%（普通尿素）和75.63%（硝化抑制劑）。CK處理在添加硝化抑制劑時(shí)，生育后期的N2O排放量也比較高，占全生育期的68.98%。其余3個(gè)處理該階段N2O排放所占比例相對較低，為34.16%～39.65%。

圖3 不同處理大豆生長季土壤N2O排放通量Fig.3 Soil N2O emission flux during soybean growing season for different treatments

從大豆生長季N2O排放累積量來看（圖4），ET和ECT處理的N2O累積排放量顯著高于CK和EC處理，且都表現(xiàn)為添加硝化抑制劑相較普通尿素時(shí)N2O排放量更低。EC條件下，尿素和硝化抑制劑處理的N2O排放量均保持在較低水平。CK處理下，添加硝化抑制劑的N2O排放量明顯高于普通尿素。

圖4 大豆生長季N2O排放總量Fig.4 Total soil N2O emission during soybean growing season for different treatments

3 討論

溫度在土壤-作物系統(tǒng)氮素循環(huán)過程中起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。升溫條件下，土壤微生物活性增強(qiáng)，促進(jìn)了土壤養(yǎng)分的循環(huán)與周轉(zhuǎn)，增強(qiáng)了土壤的硝化作用、反硝化作用及氮礦化作用［10-11］。同時(shí)，土壤的酶活性提高，使更多的銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮［5］，并促進(jìn)了土壤N2O的排放［12］。Chen等［13］研究發(fā)現(xiàn)，溫度升高增加了0～5 cm土層的硝態(tài)氮含量，加快了氮礦化的速率，N2O排放量呈增加趨勢。本研究中，氣溫升高條件下（ET），大豆土壤硝態(tài)氮含量均顯著增加，而銨態(tài)氮含量降低，N2O排放量顯著增加，這與Chen等［13］的研究結(jié)果基本一致。胡正華等［14］研究表明，N2O與土壤溫度之間有著顯著的正相關(guān)性。在增溫條件下，大豆生長季的N2O排放通量顯著增加了17.3%，排放總量顯著增加了20.3%。而本研究中，升溫條件下在未添加硝化抑制劑時(shí)，N2O排放總量較CK顯著增加了173.6%，顯著高于胡正華等［14］的研究結(jié)果。這可能與土壤本身的氮儲量以及試驗(yàn)環(huán)境有關(guān)。從酶活性來看，本研究中升溫條件下，僅成熟期的氨單加氧酶和鼓粒期的硝酸還原酶的活性顯著增加，其余硝化反硝化酶活性變化不顯著或有降低的趨勢，這與前人的研究結(jié)果不太一致［5］，可能是因?yàn)橛^測期處于較為炎熱的8到9月，溫度過高反而抑制了酶活性。

大氣CO2濃度升高可以促進(jìn)植物的光合作用，使根系伸長，從而增強(qiáng)植物對土壤有效氮的吸收［15］，提高土壤微生物的數(shù)量和活性，增加土壤有機(jī)物的分解和氮礦化的速率［16］。同時(shí)，CO2濃度升高還可以提高土壤溫度，通過提高土壤溫度來影響土壤氮礦化速率［17］。張繼舟等［18］開頂氣室（opentop chamber，OTC）的研究結(jié)果表明，正常CO2濃度（370 μmol/mol）、中等 CO2濃度（550 μmol/mol）和高CO2濃度（700 μmol/mol）處理下，土壤全氮、硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量均出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，說明大氣CO2濃度升高到一定范圍內(nèi)可以提高土壤的氮素含量，但超過一定的濃度會(huì)使得土壤氮素含量有所減少。本研究中，與CK相比，大氣 CO2濃度升高（EC）條件下，土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量均有所增加，這與張繼舟等［18］正常和中等CO2濃度下的研究結(jié)果基本一致。如果繼續(xù)升高CO2濃度可能造成土壤無機(jī)氮含量的下降，該結(jié)果需進(jìn)一步驗(yàn)證。從酶活性來看，Baggse等［19］在開放式大氣CO2濃度增加（free-air CO2enrichment，F(xiàn)ACE）條件下的研究結(jié)果表明，歐洲四大草原的硝化反硝化酶活性的變化較小。Barnard等［20］分析了來自歐洲四個(gè)草地生態(tài)系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)土壤的硝化和反硝化酶對高CO2無明顯響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，四種硝化反硝化酶活性對CO2濃度升高的響應(yīng)不明顯，這與Baggse等［19］和Barnard等［20］的研究結(jié)果一致。大氣CO2濃度升高的條件下，反硝化作用的增強(qiáng)導(dǎo)致了更多N2O的產(chǎn)生與排放。Lam等［21］用FACE系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，CO2濃度升高下冬小麥田間N2O的排放的增幅達(dá)到60%。本研究中EC條件下N2O排放量較CK無顯著變化，這與前人的研究結(jié)果不太一致，可能是因?yàn)榇蠖拐麄€(gè)生長期沒有施肥，隨著對土壤中氮素吸收量的增加，土壤中無機(jī)氮含量逐漸減少，土壤的硝化和反硝化能力降低。

通過向氮肥中添加硝化抑制劑可以有效調(diào)控土壤氮素的轉(zhuǎn)化過程，延緩?fù)寥冷@態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，從而有效降低土壤中硝態(tài)氮的淋溶損失及N2O排放等。傅麗等［22］的研究結(jié)果表明，脲酶抑制劑與不同類型的硝化抑制劑組合均能不同程度地減緩尿素水解，增加土壤的有效氮含量。孫志梅等［2］研究表明，施用純氮量1%的硝化抑制劑3，5-二甲基吡唑（3，5-dimethylpyrazole，DMP）可使土壤銨態(tài)氮含量提高30%以上，硝態(tài)氮含量降低20%左右。本研究中，與單純施用普通尿素相比，在不同環(huán)境條件下，小麥季添加硝化抑制劑處理，大豆季土壤中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量均有所增加。這與孫志梅等［2］的研究結(jié)果不一致，主要是因?yàn)楸狙芯恐写蠖股L季并未添加任何氮肥和硝化抑制劑，土壤中的氮素除了根瘤固氮外，主要來自于小麥秸稈還田后的氮素礦化以及上一季的土壤殘留氮。添加硝化抑制劑后，有效抑制了小麥季的氮素淋溶和氣體損失，增加了土壤中的有效氮含量。從土壤酶活性來看，前人研究表明，硝化抑制劑主要通過影響氨單加氧酶的活性來控制銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化［3，23］。本研究中硝化抑制劑處理鼓粒期氨單加氧酶活性較普通尿素均有所降低，但差異不顯著，其余硝化反硝化酶活性也基本對硝化抑制劑的響應(yīng)不明顯。這主要是因?yàn)橄趸种苿┦窃谛←溂咎砑拥模趸种苿┮话阍谑褂煤蟮?0～90 d內(nèi)起作用［24］，因此對后茬作物的影響較小。從N2O排放量來看，當(dāng)前環(huán)境條件下（CK），小麥季添加硝化抑制劑顯著提高了大豆生長季的N2O排放總量，較單施尿素處理提高了108.53%；大氣CO2升高條件下（EC），兩者差異不明顯；升溫（ET）以及同時(shí)升高溫度和CO2濃度（ECT）時(shí)，硝化抑制劑處理的N2O排放總量較普通尿素分別降低了5.70%和29.08%。這與前人硝化抑制劑抑制N2O排放的研究結(jié)果不太一致，可能與硝化抑制劑施用的環(huán)境條件有關(guān)。硝化抑制劑的作用效果受土壤類型、質(zhì)地、施肥種類、施肥方式及施氮量、硝化抑制劑施用量、土壤溫度及土壤水分等綜合因素的影響［23］，不同環(huán)境條件下硝化抑制劑作用效果有明顯差異，進(jìn)而對N2O的排放產(chǎn)生影響。

通過不同環(huán)境條件及硝化抑制劑處理對大豆土壤無機(jī)氮含量、硝化反硝化相關(guān)酶活性及N2O排放的影響的分析可得出如下結(jié)論：

1）小麥-大豆輪作，小麥季添加硝化抑制劑配合秸稈還田可使大豆季土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮均有所增加，但是對大豆季土壤硝化-反硝化酶的活性影響較小。

2）升溫使大豆土壤的硝態(tài)氮含量顯著增加，而銨態(tài)氮含量顯著降低；大氣CO2濃度增加或者同時(shí)升高氣溫和CO2濃度，土壤的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的含量均有所增加，但與CK差異不顯著。

3）不同環(huán)境條件下的土壤硝化-反硝化酶的活性沒有明顯規(guī)律。

4）ET和ECT條件下，大豆生長季N2O排放總量均顯著高于CK處理，且添加硝化抑制劑使N2O排放量降低，EC與CK條件下的N2O排放量差異較小，但在CK條件下硝化抑制劑處理的N2O排放量顯著高于普通尿素處理。

本研究僅為一年的試驗(yàn)結(jié)果，氣候變化背景下硝化抑制劑對大豆土壤無機(jī)氮含量及N2O排放的影響還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。