根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與裝配對煙草根系生長性狀的影響

侯建林，李宏光*，肖艷松，職齊琦 ，胡 琦，許淘莎，于法輝，靳志麗，周向平

（1.湖南省煙草公司郴州市公司，郴州 423000；2.中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長沙 410083；3.湖南省煙草公司永州市公司，永州 425000）

植物根際微生物具有高度多樣性［1］，在生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演了關(guān)鍵的生態(tài)角色［2］。根際微生物的群落組成和功能結(jié)構(gòu)與能量流動和碳氮元素循環(huán)密切相關(guān)，部分功能微生物還可分泌植物生長因子，促進(jìn)植物生長。例如，根際中存在多種可分泌植物生長素吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）的微生物，包括根瘤菌（Rhizobium）［3］、芽孢桿菌（Bacillus）和乳酸桿菌（Lactobacillus）［4］等。此外，還有大量微生物可溶解根際礦物質(zhì)并釋放營養(yǎng)元素，如鋅［5-6］、磷［7-9］、鉀［10-11］等。然而，目前大部分關(guān)于促進(jìn)植物生長的微生物研究主要聚焦于單菌的代謝功能上，而微生物間協(xié)同作用的研究較少。解析根際微生物功能團(tuán)及其協(xié)同作用機制，不但可深入剖析根際微生物在根際中扮演的生態(tài)角色，還可為開發(fā)微生物菌肥以促進(jìn)植物生長發(fā)育提供理論依據(jù)。

根際環(huán)境總體上塑造了微生物的群落組成［12］、多樣性［13］、相互作用和發(fā)育裝配模式［14］及功能結(jié)構(gòu)［15-16］，而微生物依其代謝活性營造了適宜生存的微環(huán)境［17-18］，從而改善了植物的根際環(huán)境，提高了根系性狀。一方面，土壤微生物可分泌胞外多聚物形成生物膜，以提高對環(huán)境擾動的抗性、群落多樣性和代謝活性［18］。土壤微生物也會分泌鐵載體，以促進(jìn)環(huán)境鐵離子的富集，提高微生物對重金屬的抗性［19］，強化植物對鐵離子的吸收效率［20］。這些結(jié)果表明，微生物可以依靠其代謝功能顯著影響土壤環(huán)境。另一方面，土壤微生物群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)會隨著植物生長逐漸變得復(fù)雜，模塊性及模塊數(shù)量升高［21］，這與構(gòu)建氮降解等微生物功能團(tuán)的形成密切相關(guān)［22］，暗示微生物可在短期內(nèi)快速參與根際土壤環(huán)境的形成。盡管大量研究表明了微生物群落結(jié)構(gòu)特征在植物根系性狀的改變中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，強調(diào)了作物生長過程中微生物種群組成與根系性狀差異的關(guān)聯(lián)性，但目前對根際微生物的組成、共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵功能物種和發(fā)育裝配及其對根系特征演變的作用仍知之甚少。

本文以發(fā)達(dá)根系（well-developed root system，WDR）與不發(fā)達(dá)根系（undeveloped root system，UDR）的根際系統(tǒng)為研究對象，利用16S rRNA高通量測序技術(shù)，研究農(nóng)田根際微生物的群落組成，探究根系性狀的差異與微生物群落組成的多樣性、結(jié)構(gòu)功能、分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)及發(fā)育裝配模式的關(guān)聯(lián)性，用于解決以下問題：1）根際細(xì)菌群落在WDR與UDR的條件下是否存在顯著不同？2）是否存在特別重要的微生物類群在裝配過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用？

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

樣本采集自湖南一塊長期定位的試驗煙田（經(jīng)度 ：112°06' N，緯度 ：27°59' E），分別采集成熟期根系WDR和UDR的煙草（Nicotiana tabacum）根際土壤，每類各10份。采集過程中將整株植物連根拔起，去除根系松散附著的土壤，用刷子刷取根部黏附的剩余土壤即為根際土壤，標(biāo)記保存后用于后續(xù)細(xì)菌群落分析和高通量測序分析。根際土壤的理化特性如表1所示，有效鉀含量的平均值為787.58 mg/kg，有效磷含量的平均值為81.68 mg/kg，總氮量的平均值為2 039.20 mg/kg，有機質(zhì)的含量百分比為4.19%，pH平均值為5.97。

表1 根際土壤的理化特性分析Tab.1 Soil physicochemical properties

1.2 DNA提取和擴(kuò)增子測序

利用強力根際DNA提取試劑盒（MoBio，SanDiego，CA，USA）按說明書從1.0 g根際樣品中提取DNA。利用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系含有1.0 μL DNA模板（～25 ng DNA）、12.5 μL Taq Master Mix（Vazyme，Piscataway，NJ，USA）、0.5 μL引物，DNase-free去離子水調(diào)節(jié)體系體積至25.0 μL。PCR擴(kuò)增程序設(shè)置如下：98℃ 30 s；98℃ 10 s，54℃ 30 s，72℃ 45 s，32次循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。利用Gel Extraction Kit（OMEGA Bio-Tek Inc.，Doraville，GA，United States）純化PCR產(chǎn)物。利用Qubit 2.0 Fluorometer（Invitrogen，USA）對其定量，等摩爾濃度混庫后，在Illumina NovaSeq PE250平臺上進(jìn)行高通量測序（LC-Bio Technology Co.，Ltd，Hangzhou，Zhejiang Province，China），得到已去接頭FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用QIIME 2來處理原始數(shù)據(jù)，并且去除低質(zhì)量序列和嵌合體，再生成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）表，進(jìn)行物種注釋。使用R語言進(jìn)行所有的計算分析，得到微生物群落Shannon、Pielou等多樣性指數(shù)，采用主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）來比較總體微生物群落結(jié)構(gòu)。采用多重比較方差分析方法計算組間細(xì)菌群落的Alpha多樣性差異。利用線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）確定組間各分類水平上具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)識?；赟pearman相關(guān)性構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。利用零模型分析細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育裝配。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際細(xì)菌的群落組成和結(jié)構(gòu)

利用16S rRNA基因高通量測序技術(shù)分別對UDR和WDR的根際細(xì)菌群落進(jìn)行檢測注釋，結(jié)果如圖1所示。在門水平上，UDR和WDR根際細(xì)菌群落的優(yōu)勢菌均主要為Proteobacteria、Acido-bacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi和Patescibacteria，UDR根際細(xì)菌群落主要包含26.2%～46.3%的Proteobacteria、14.4%～26.6%的Acidobacteriota、2.6%～16.8%的Bacteroidota、2.1%～10.0%的Chloroflexi和2.1%～13.6%的Patescibacteria，而WDR根際細(xì)菌群落主要包含20.9%～32.5%的Proteobacteria、23.6%～34.4%的Acidobacteriota、3.0%～12.0%的Bacteroidota、5.9%～10.3%的Chloroflexi和2.6%～4.6%的Patescibacteria。

圖1 UDR和WDR根際細(xì)菌群落的組成Fig.1 Rhizosphere bacterial community composition of UDR and WDR

Alpha多樣性分析結(jié)果顯示，WDR根際細(xì)菌群落的Observed、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和InvSimpson指數(shù)均高于UDR，表明WDR根際細(xì)菌群落物種的豐度和多樣性均高于UDR（表2）。

表2 UDR和WDR根際細(xì)菌群落的Alpha多樣性分析Tab.2 Alpha diversity analysis of rhizosphere bacterial communities of UDR and WDR

PCoA結(jié)果顯示（圖2），WDR和UDR樣本間明顯分開，主坐標(biāo)軸PCoA1和PCoA2分別解釋了18.0%和14.2%細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，解釋度較低，表明根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是復(fù)雜的。

圖2 UDR和WDR根際細(xì)菌群落相似性分析Fig.2 Rhizosphere community similarity analysis of UDR and WDR

通過差異性檢驗確定了WDR和UDR之間豐度具有顯著差異的物種（P<0.05）。圖3展示了豐度最高的16個差異物種，其中WDR根際細(xì)菌群落的Edaphobaculum、PLTA13、Rhodobacter、Parablastomonas、Noviherbaspirillum、JG36-GS-52、Algoriphagus和Rhodoplanes等屬均顯著低于UDR，而Gallionella和Luteimona等屬則顯著高于UDR。

圖3 UDR和WDR根際細(xì)菌群落差異性分析Fig.3 Difference analysis of rhizosphere bacterial community between UDR and WDR

2.2 根際細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵微生物

為解析土壤菌群物種間的共存模式，本研究基于隨機矩陣?yán)碚摌?gòu)建了UDR和WDR的根際細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。如表3所示，相比WDR，UDR根際細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模（節(jié)點，vertex）、連通性（邊，edge）、平均度（average degree）、聚類系數(shù)（clustering coefficient）、密度（density）和內(nèi)聚性（centralization）均增加，表明UDR的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜；而平均路徑長度（average path length）和網(wǎng)絡(luò)直徑（network diameter）減短、網(wǎng)絡(luò)正相關(guān)連接（positive links）的百分比增加，表明UDR物種間的相互作用增強，特別是合作行為。

表3 UDR和WDR的根際細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)Tab.3 Topological properties of molecular ecological network of UDR and WDR rhizosphere bacterial communities

網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變可能會進(jìn)一步影響網(wǎng)絡(luò)成員角色發(fā)生改變?；谒鼈兊哪K內(nèi)連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi），檢測到UDR的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)具有1個模塊中心點［（moudule hubs；Zi>2.5且Pi<0.62），主要為Nitrospirota］、43個連接節(jié)點［（connectors；Zi<2.5且Pi>0.62），主要為Acidobacteriota和Proteobacteria］以及3個網(wǎng)絡(luò)中心點［（Network hubs；Zi>2.5且Pi>0.62），主要為Proteobacteria和Gemmatimonadota］；而WDR分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)有2個模塊中心點（主要為Acidobacteriota和Chloroflexi），52個連接節(jié)點（主要為Acidobacteriota和Proteobacteria）以及3個網(wǎng)絡(luò)中心點（主要為Acidobacteriota、Nitrospirota和Proteobacteria）。這些都是在塑造網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的節(jié)點。相比UDR，WDR的關(guān)鍵節(jié)點數(shù)較多，且連接節(jié)點均主要屬于Acidobacteriota和Proteobacteria。

網(wǎng)絡(luò)模塊與細(xì)菌群落功能的關(guān)聯(lián)性預(yù)測結(jié)果顯示，UDR和WDR的網(wǎng)絡(luò)模塊主要與能量流動功能相關(guān)。相比UDR，WDR的碳循環(huán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)模塊增加（圖4）。

圖4 UDR和WRD根際細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)模塊的生物地球化學(xué)作用Fig.4 Biogeochemical effects of rhizosphere bacterial community network modules in UDR and WRD

2.3 根際細(xì)菌群落的發(fā)育裝配

為了研究群落系統(tǒng)發(fā)育組裝過程中確定性和隨機性作用對根系發(fā)育情況的影響，本研究計算了凈譜系親緣關(guān)系指數(shù)（net related index，NRI）和最近種間親緣關(guān)系指數(shù)（nearest taxon index，NTI）。相比UDR，WDR的NRI和NTI指數(shù)較高，表明WDR根際微生物群落裝配更趨向于發(fā)育聚集（圖5）。

圖5 UDR和WDR根際細(xì)菌群落NRI和NTI指數(shù)Fig.5 NRI and NTI of rhizosphere community in UDR and WDR

圖6進(jìn)一步表明，WDR和UDR的betaNRI和betaNTI指數(shù)存在顯著差異（P<0.000 1），且WDR的betaNRI指數(shù)小于-2，顯著大于UDR，表明環(huán)境過濾在WDR的群落裝配中發(fā)揮了更重要的作用。WDR根際細(xì)菌群落裝配更趨向于發(fā)育聚集，且環(huán)境過濾在其中發(fā)揮了更重要的作用。

圖6 UDR和WDR根際細(xì)菌群落betaNRI和betaNTI指數(shù)Fig.6 Rhizosphere community betaNRI and betaNTI index of UDR and WDR

3 討論

根系微生物在煙草生長發(fā)育過程中有著重要的作用，其群落結(jié)構(gòu)和發(fā)育裝配與根系是否發(fā)達(dá)密切相關(guān)。Shi等［21］的研究結(jié)果表明，燕麥的根系發(fā)育過程與微生物群落密切相關(guān)，隨著根系的發(fā)育，根際微生物的相互作用網(wǎng)絡(luò)變得更加復(fù)雜和模塊化；同時，隨著根系的發(fā)育，根際微生物群落多樣性降低，出現(xiàn)發(fā)育聚集的現(xiàn)象。本研究結(jié)果指出，WDR與UDR煙草的根際細(xì)菌群落組成存在顯著差異。不同的是，WDR的根際細(xì)菌物種的豐富度和多樣性均高于UDR，表明微生物群落結(jié)構(gòu)對煙草根系發(fā)育產(chǎn)生了直接影響。與UDR相比，WDR的根際細(xì)菌群落中Gallionella和Luteimona等屬的豐度顯著較高，而Edaphobaculum、PLTA13和Rhodobacter等屬的豐度則顯著較低。Gallionella是一類鐵氧化菌，是植物根系環(huán)境中Fe（II）的關(guān)鍵參與者。有研究指出，Gallionella相關(guān)的FeOB能參與并影響植物培育土壤中Fe（II）的氧化過程，促進(jìn)根系鐵元素的吸收［22］。而Luteimona是一類常見的植物促生菌，能通過影響植物根系的羧酸和胺的含量提高植物的抗逆生長能力［23］。

土壤微生物群落的相互作用是維持根際生態(tài)系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵［24］，這些相互作用廣泛且復(fù)雜。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)表明，相比WDR，UDR根際細(xì)菌群落的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模、連通性、平均度、聚類系數(shù)、密度和內(nèi)聚性增加，而平均路徑長度和網(wǎng)絡(luò)直徑減短，表明不發(fā)達(dá)根系分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)更加復(fù)雜，物種間相互作用更加強烈，且其網(wǎng)絡(luò)正相關(guān)連接增加，表明UDR的根際細(xì)菌物種間相互趨向合作而不是競爭，具有更多正相互作用的復(fù)雜的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，在環(huán)境變化中更有利于維持系統(tǒng)的穩(wěn)定［25］，但缺乏對有限資源的競爭以及獨特的環(huán)境生態(tài)位和空間隔離，可能不利于根際環(huán)境的改善和植物的生長。模塊特征基因分析對于揭示高階組織和識別關(guān)鍵種群具有重要意義［26］。通過計算節(jié)點模塊內(nèi)連通度（Zi）和模塊間連通度（Pi）檢測得到WDR分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點主要屬于Chloroflexi和Proteobacteria。大量研究表明，Proteobacteria在微生物氮、磷循環(huán)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［27］，Chloroflex的豐度對環(huán)境pH的變化較為敏感［28］。同時，相比UDR，WDR的碳循環(huán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)模塊增加。這些結(jié)果表明，網(wǎng)絡(luò)模塊化結(jié)構(gòu)與微生物的特異性功能團(tuán)形成有密切聯(lián)系，深入剖析模塊成員的組成及其相互作用將更有利于認(rèn)識微生物群落在土壤物質(zhì)循環(huán)的生態(tài)角色。

NRI可提供種群深度關(guān)聯(lián)程度的重要信息，而NTI則能進(jìn)行更精細(xì)的系統(tǒng)發(fā)育檢查。結(jié)果表明，UDR和WDR的NRI/NTI值均大于0，表明兩種情況下，微生物都呈現(xiàn)聚集。相比之下，后者的NRI/NTI指數(shù)大于前者，表明WDR的根際微生物發(fā)育更聚集。研究表明，植物與根系微生物的相互作用是其提高環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性力的重要因素，相反，環(huán)境因素也會影響微生物的群落組裝［29］?？梢猿醪脚袛?，微生物聚集差異是導(dǎo)致植物根系發(fā)育差異的重要原因。然而，根系的發(fā)育情況和微生物群落裝配的直接關(guān)系還有待進(jìn)一步驗證。

我們的研究結(jié)果表明了作物根系生長發(fā)育情況與微生物的群落組成、結(jié)構(gòu)功能、網(wǎng)絡(luò)變化和發(fā)育裝配存在顯著的關(guān)系。WDR根際系統(tǒng)的微生物群落的多樣性高于UDR根際系統(tǒng)；WDR的根際系統(tǒng)Gallionella和Luteimona的豐度高于UDR的根際系統(tǒng)，推測其可能參與了根系的鐵元素吸收和抗逆性的形成，從而促進(jìn)了植物根系的生長。同時，UDR系統(tǒng)的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜，物種間相互作用較強，特別是合作行為，而WDR系統(tǒng)的關(guān)鍵節(jié)點數(shù)和碳循環(huán)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)模塊與UDR相比增加，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化似乎與微生物群落的功能結(jié)構(gòu)和生態(tài)系統(tǒng)功能過程密切相關(guān)。此外，WDR的根際系統(tǒng)中，微生物群落系統(tǒng)發(fā)育更趨于發(fā)育聚集，表明微生物群落受環(huán)境選擇的影響較大，暗示了根系生長過程中，微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育是保守的。這些結(jié)果說明了微生物群落的關(guān)鍵物種可改善植物根系生長發(fā)育，為開發(fā)微生物菌肥調(diào)控根際微生物群落組裝，從而促進(jìn)植物根系生長提供了理論依據(jù)。