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    著絲粒蛋白L表達與肝移植術(shù)后肝細胞癌復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)性研究

    2023-01-11 08:29:12陳豐穗張志強賴彥華吳志賢周麗麗
    中國臨床新醫(yī)學 2022年12期
    關(guān)鍵詞:著絲粒肝移植肝細胞

    方 堅, 阮 梅, 夏 磊, 黃 倩, 陳豐穗, 張志強, 張 霞, 賴彥華, 李 懿, 吳志賢, 周麗麗

    肝移植術(shù)是部分肝癌患者及終末期肝病患者最佳治療選擇之一,我國每年肝移植數(shù)量達5 000余例[1]。得益于免疫抑制治療藥物的進步等原因,患者肝移植術(shù)后的生存期顯著提升[2]。2015—2020年我國大陸公民逝世后器官捐獻肝移植受者術(shù)后1年、3年的累計生存率分別為83.6%、74.9%[3]。移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)是影響患者生存的主要原因之一[4]。我國大陸移植患者中,肝癌受者比例為36.8%[5],而20%~57%的患者在術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[5-6],中位生存期通常不足1年[2,7]。因此,尋找可靠的指標評估肝癌患者移植術(shù)后復(fù)發(fā)的風險因素具有重要的價值。著絲粒蛋白L(centromere protein L,CENPL)是著絲粒蛋白家族的成員。著絲粒蛋白可結(jié)合紡錘體微管,細胞分裂時調(diào)控染色體分離[8]。CENPL的突變會影響著絲粒相關(guān)網(wǎng)絡(luò)蛋白的相互作用,從而阻礙著絲粒組裝和染色體排列[9]。本研究團隊的前期研究發(fā)現(xiàn),CENPL可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。然而,目前鮮有文獻報道CENPL在移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)中的作用。鑒此,本研究旨在探討肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL表達情況及其與臨床病理參數(shù)和復(fù)發(fā)的關(guān)聯(lián)性。

    1 對象與方法

    1.1研究對象 選擇2014年1月至2020年6月在福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院、聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院和廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院行肝移植術(shù)并在術(shù)后發(fā)生肝細胞癌復(fù)發(fā)的患者93例(復(fù)發(fā)組)。經(jīng)性別與年齡匹配,選擇同期行肝移植手術(shù)但術(shù)后未復(fù)發(fā)的肝細胞癌患者46例(未復(fù)發(fā)組)。

    1.2納入與排除標準 納入標準:(1)肝移植術(shù)前經(jīng)病理檢查明確診斷為肝細胞癌;(2)年齡>18歲;(3)病歷資料及隨訪資料完整。排除標準:(1)有其他器官移植史者;(2)合并膽管細胞癌,或其他惡性腫瘤者;(3)隨訪依從性不佳者。

    1.3肝移植方法 供體符合我國腦死亡捐贈規(guī)范[11],手術(shù)方法均為原位肝移植。所有患者簽署知情同意書。肝癌肝移植的米蘭標準[12]:單個腫瘤直徑≤5 cm,或腫瘤數(shù)目≤3個,每個直徑≤3 cm,并且無大血管侵犯和遠處轉(zhuǎn)移。肝癌肝移植的杭州標準[11]:(1)無大血管侵犯和肝外轉(zhuǎn)移;(2)腫瘤直徑之和小于或等于8 cm,或腫瘤直徑之和大于8 cm,但滿足術(shù)前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)≤400 μg/L,且組織學分級為高、中分化。

    1.4資料收集 通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者肝移植前的臨床資料,包括年齡、性別、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染、肝硬化、Child-Pugh分級、白細胞(white blood cell,WBC)、血小板(platelet,PLT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽紅素(total bilirubin,TBil)、血細胞計數(shù)、腫瘤大小、腫瘤包膜、中國肝癌分期(China Liver Cancer Staging,CNLC)、AFP、免疫抑制劑方案、腫瘤復(fù)發(fā)時間、隨訪時間等。

    1.5隨訪方法 隨訪間隔為1~3個月:對于術(shù)后早期指標不穩(wěn)定的患者隨訪間隔為1個月;對于半年后狀態(tài)穩(wěn)定患者,隨訪間隔可延長至3個月。隨訪內(nèi)容包括生化檢查和影像學檢查?;灆z查內(nèi)容包括肝腎功能、電解質(zhì)、血脂、AFP水平及常見腫瘤指標、血細胞分析、凝血功能、乙肝病毒DNA和乙肝五項,以及他克莫司、西羅莫司血藥濃度。影像學檢查包括腹部彩超、腹部或胸部CT或腹部MR。觀察患者肝癌復(fù)發(fā)情況,原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)診斷主要依據(jù)增強腹部和胸部CT或MR,并結(jié)合AFP水平,影像學報告均由有經(jīng)驗的高年資影像學??漆t(yī)師出具。

    1.6免疫組織化學染色 標本來源于患者移植術(shù)前自身的病肝組織。常規(guī)二甲苯、酒精脫水??乖迯?fù):煮沸(95 ℃,15~20 min),自然冷卻20 min以上,再用冷水沖洗罐子,加快冷卻至室溫,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)(pH 7.2)沖洗5 min,重復(fù)沖洗3次。阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶:3% H2O2室溫下孵育10 min,PBS(pH 7.2)沖洗5 min,重復(fù)沖洗3次。稀釋一抗,滴加50 μl稀釋好的一抗(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照),37 ℃孵育60 min,PBS沖洗5 min,重復(fù)沖洗3次。擦干后滴加30 μl聚合物增強劑(二抗試劑A)室溫25 ℃孵育20 min,PBS沖洗5 min,重復(fù)沖洗3次。加生物素化抗兔二抗室溫下孵育30 min,PBS沖洗5 min,重復(fù)沖洗3次。滴加100 μl新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色液,顯微鏡下觀察5~20 min。自來水沖洗后,蘇木素復(fù)染,PBS液返藍。常規(guī)95%酒精脫水,干燥,封片。對染色程度進行半定量評分。評分標準[13]:切片在400倍顯微鏡下,隨機選取5個視野,每個視野計數(shù)200個細胞,根據(jù)染色細胞所占百分率評分。無明顯細胞著色為0分,1%~10%著色為1分,10%<著色≤30%為2分,>30%著色為3分。再根據(jù)染色強度評分:未顯色或顯色不清為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,深褐色為3分。每張切片最終得分為染色百分率和染色強度平均分數(shù)的乘積,得分≥3分者為高表達,得分<3分者為低表達[13]。免疫組化的一抗購自福州中杉金橋,二抗購自Abcam公司。

    2 結(jié)果

    2.1肝癌組織和癌旁組織免疫組織化學染色結(jié)果 光鏡下可見癌組織CENPL染色呈陽性,主要表達在細胞核部位,少量在細胞質(zhì)表達。癌旁組織未見CENPL染色。見圖1。

    ?肝癌組織CENPL高表達;?癌旁組織CENPL表達不明顯圖1 肝癌組織和癌旁組織免疫組織化學染色所見(×200)

    2.2兩組臨床資料比較 復(fù)發(fā)組CNLC為Ⅱ期、CENPL高表達的人數(shù)比例大于未復(fù)發(fā)組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其余指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

    表1 兩組臨床資料比較

    2.3肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的影響因素分析結(jié)果 以復(fù)發(fā)情況為因變量,將表1中有統(tǒng)計學意義的指標(CNLC、CENPL表達情況)作為自變量納入多因素Cox回歸模型。結(jié)果顯示,以CNLC Ⅱ期為參照,CNLC Ⅰ期是肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的抑制因素[HR(95%CI)=0.46(0.13~0.91),P=0.013];以CENPL低表達為參照,CENPL高表達是肝移植后肝癌復(fù)發(fā)的促進因素[HR(95%CI)=1.68(1.41~2.99),P=0.003]。

    2.4肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組的生存預(yù)后比較 CENPL高表達組的中位無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival,RFS)為5(3~22)個月,低表達組中位RFS為8(5~26)個月,兩組差異有統(tǒng)計學意義(log-rank檢驗:χ2=9.269,P=0.002)。CENPL高表達組中位總生存期(overall survival,OS)為14(8~40)個月,低表達組中位OS為22(9~37)個月,兩組差異有統(tǒng)計學意義(log-rank檢驗:χ2=4.406,P=0.031)。見圖2。

    ?兩組RFS比較;?兩組OS比較圖2 肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組生存預(yù)后情況的Kaplan-Meier生存曲線比較圖

    2.5肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組臨床資料比較 兩組年齡、性別、HBV感染、HCV感染、肝功能、肝硬化、腫瘤包膜、大血管侵犯、遠處轉(zhuǎn)移等情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

    表2 肝癌復(fù)發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組臨床資料比較

    3 討論

    3.1肝細胞癌復(fù)發(fā)導(dǎo)致患者在肝移植后的生存率下降。研究表明,肝移植后肝細胞癌復(fù)發(fā)的原因可能包括[14-17]:(1)移植前癌細胞已發(fā)生微轉(zhuǎn)移;(2)手術(shù)操作導(dǎo)致腫瘤破裂,從而引起腫瘤轉(zhuǎn)移;(3)免疫抑制劑的使用促進了腫瘤細胞的增殖和侵襲。也有研究表明,腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境表達的多種生物分子在腫瘤的復(fù)發(fā)中發(fā)揮了重要作用[18]。術(shù)前檢測這些分子標志物,術(shù)后定量檢測分泌性標志物的相應(yīng)抗體,可預(yù)測肝移植后腫瘤復(fù)發(fā)。但目前尚未有公認和廣泛應(yīng)用的標志物,因此進一步尋找具有應(yīng)用價值的標志物具有重要的臨床意義。

    3.2CENPL是著絲粒蛋白H-著絲粒蛋白I(centromere protein H-centromere protein I,CENPH-CENPI)相關(guān)的著絲粒復(fù)合體的一個亞基,是正常著絲粒功能和有絲分裂過程不可缺少的蛋白[19]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與CENPL相關(guān)的疾病包括染色體22Q11.2缺失綜合征、染色體17p13.3重復(fù)綜合征。目前關(guān)于CENPL在腫瘤中的研究報道較少。有文獻報道CENPL mRNA在肝細胞癌中過表達,其水平與患者的臨床病理參數(shù)密切相關(guān)[10]。CENPL mRNA高表達者的生存預(yù)后情況較差。在沒有肝炎病毒感染的白種人和黃種人男性肝癌患者中,更高水平的CENPL mRNA與較差的OS相關(guān)。通過整合多個數(shù)據(jù)庫,Zeng等[20]研究發(fā)現(xiàn),CENPL在多種癌癥類型中都呈高表達,且與不良臨床病理學特征顯著相關(guān);基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CENPL可能通過細胞周期、DNA復(fù)制、p53信號通路和卵母細胞減數(shù)分裂等途徑參與肝細胞癌的發(fā)生和進展。此外,有研究發(fā)現(xiàn)CENPL的表達與多種免疫細胞標志物呈正相關(guān),其中與M1巨噬細胞標志物干擾素調(diào)節(jié)因子5(interferon regulatory factors,IRF5)、Treg細胞標志物趨化因子受體8(chemokine receptor 8,CCR8)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5B(signal transduction and activator of transcription 5B,STAT5B)的相關(guān)性最高。CENPL與T細胞衰竭標志物也存在正相關(guān),包括程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)、細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA4)、淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG3)、胸腺細胞選擇相關(guān)高遷移率群盒蛋白(thymocyte selection-related high mobility group box protein,TOX)、T細胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein,TIGIT)、重組人顆粒酶-B(recombinant human granzyme-B,GZMB)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3,Tim-3),特別是與Tim-3的相關(guān)性最高[21]。本研究免疫組化結(jié)果也顯示CENPL在肝細胞癌組織中呈高表達,這與Feng等[22]的研究結(jié)果相似。也有研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌患者中,CENPL的表達水平與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫指標呈正相關(guān)[23-24]。這解釋了CENPL高表達預(yù)測不良預(yù)后的結(jié)果,也為新的免疫治療方法提供了參考。

    3.3目前關(guān)于CENPL在肝移植術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)中的機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)組的CENPL表達水平顯著高于未復(fù)發(fā)組。進一步分析發(fā)現(xiàn),在肝癌復(fù)發(fā)患者中,CENPL高表達組的RFS、OS較低表達組更差,提示CENPL與肝移植術(shù)后肝細胞癌復(fù)發(fā)有關(guān)聯(lián)。另外,高表達CENPL組發(fā)生血管侵犯和遠處轉(zhuǎn)移的人數(shù)比例較低表達組更高,但結(jié)果未顯示出統(tǒng)計學意義,這可能與本研究病例數(shù)不足有關(guān)。近年來有一些研究者嘗試研究肝移植術(shù)后肝細胞癌復(fù)發(fā)的預(yù)測標志物。王超[25]研究了供肝移植物單碳代謝基因多態(tài)性與肝移植后肝細胞癌復(fù)發(fā)風險之間的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)單碳代謝基因多態(tài)性在肝移植后肝細胞癌復(fù)發(fā)中具有重要作用,供體的rs1801394和rs1127717多態(tài)性可作為肝移植受者肝細胞癌復(fù)發(fā)的生物標志物。有學者認為腫瘤內(nèi)肥大細胞(mast cells within the tumor,iMC)可能參與肝癌的抗腫瘤免疫作用[26],其可預(yù)測移植后腫瘤復(fù)發(fā)。值得注意的是,對于超出了米蘭標準的患者,iMC可以識別低風險患者;而在低AFP患者中,iMC可以識別高?;颊?。

    綜上所述,CENPL表達與肝移植術(shù)后肝細胞癌復(fù)發(fā)具有關(guān)聯(lián)性,高水平CENPL與患者不良預(yù)后有關(guān)。但本研究為回顧性研究,且樣本量較小,所得結(jié)論有待進一步驗證。另外,CENPL為非分泌性蛋白,難以在血清中便捷檢測,故其在臨床中的應(yīng)用價值也有待開發(fā),相關(guān)具體機制值得深入探索。

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