利用生物信息學(xué)設(shè)計(jì)基于抗原表位的非洲豬瘟疫苗的總效果

何娜 譯自，2020，9

范美紅 校 李 紅 審 張 濤 制圖

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)病毒是引發(fā)ASF 的病原體，是全球家豬和野豬最致命的病原體之一。20 世紀(jì)20 年代，在肯尼亞引進(jìn)歐洲家豬后，該病首次被發(fā)現(xiàn)。在20 世紀(jì)上半葉，該病的暴發(fā)主要局限在撒哈拉以南的非洲東部和南部的豬群中。之后，ASF 病毒蔓延到全球各地，不僅在其他非洲國(guó)家，而且在歐洲、南美洲、大洋洲和亞洲的豬群中流行。最近一次從非洲傳入歐洲的ASF 病毒引發(fā)了有史以來(lái)最大規(guī)模的ASF 疫情，成為當(dāng)今全球養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)威脅。由于其潛在的破壞性影響，ASF 被列為必須向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織強(qiáng)制通報(bào)的疾病。

在非洲，ASF 病毒的主要宿主是非洲野豬，如感染后無(wú)臨床癥的疣豬(Phacochoerus africanus)和布什豬(Potamochoerus larvatus)。在這些地區(qū)，ASF 病毒感染離不開(kāi)鈍緣蜱(Ornithodoros)屬的蜱蟲這類蟲媒載體，它們負(fù)責(zé)向家豬傳播ASF 病毒。如今，直接接觸受感染的材料已經(jīng)成為ASF 病毒在歐洲和亞洲的豬群中傳播的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，如病死豬的尸體或豬肉制品，以及接觸感染豬的人。歐亞大陸的野豬也容易感染ASF 病毒，感染后表現(xiàn)出與家豬相似的臨床癥狀和死亡率，影響了歐亞大陸防控ASF 的效果。ASF 病毒可引起感染豬出現(xiàn)急性出血熱，這種病毒的毒力很強(qiáng)，死亡率幾乎100%。目前，對(duì)ASF 的防控還沒(méi)有疫苗或治療藥物，控制病毒傳播的唯一有效方法是撲殺受影響地區(qū)的所有豬，即受感染的豬和可能與之接觸過(guò)的豬。需要安全地處理病死豬的尸體和其他被污染的材料，這包括實(shí)施最大限度的控制措施和生物安全措施，以及限制豬及其衍生產(chǎn)品的流動(dòng)。

ASF病毒是非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae) 的唯一成員，是屬于核質(zhì)大型DNA 病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs)組的一種巨型病毒(約200 nm)。該病毒有一個(gè)復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，由多個(gè)脂質(zhì)和蛋白層組成(圖1)，基因組被第一層蛋白層包裹著，該蛋白層由核心殼內(nèi)衣殼組成，而核心殼內(nèi)衣殼又被內(nèi)脂雙層膜覆蓋，該膜包含在一個(gè)二十面體蛋白質(zhì)衣殼中。細(xì)胞外顆粒通過(guò)質(zhì)膜排出時(shí)獲得脂質(zhì)外膜。ASF 病毒的主要靶細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，也感染樹突狀細(xì)胞和其他單核細(xì)胞。病毒基因組由一個(gè)長(zhǎng)度為170～193 kb 的雙鏈DNA 分子組成，可編碼150 多個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frames，ORFs)，包括其自身的復(fù)制機(jī)制、基因調(diào)控、宿主防御逃避因子以及其整套結(jié)構(gòu)蛋白。病毒在基因組長(zhǎng)度和ORFs 數(shù)量上的差異主要?dú)w因于位于基因組兩端可變區(qū)域的多基因家族(multigene family，MGF) 基因數(shù)量的不同，而在中央保守區(qū)域的基因中可以發(fā)現(xiàn)更細(xì)微的差異。值得注意的是，許多病毒蛋白的功能仍未知。

來(lái)自不同國(guó)家、不同發(fā)病地、具有不同毒力水平的多種ASF 病毒分離株已得到了確認(rèn)。ASF 病毒的第一個(gè)完整的基因組序列來(lái)自20 世紀(jì)70 年代初在巴達(dá)霍斯(西班牙)獲得的分離株，該分離株適合在Vero 細(xì)胞(Ba71V)中生長(zhǎng)。此后，許多其他基因組也已完成，截至2020 年8 月，在通用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(universal protein resource，UniProt)中獲得了來(lái)自不同病毒突變體或分離株的46個(gè)蛋白質(zhì)組。根據(jù)主要的衣殼蛋白p72 基因(B646L)3’端序列的分析，可將其分為22 種不同的基因型。從地理位置上看，在非洲，ASF 病毒的基因型變異最大，而在歐洲、美洲和亞洲，僅發(fā)現(xiàn)了基因Ⅰ型和基因Ⅱ型的分離株。到目前為止，還沒(méi)有證據(jù)表明ASF 病毒的基因型與其毒力有關(guān)。

感染后存活的豬會(huì)產(chǎn)生免疫力，接種減毒病毒會(huì)誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和變異株特異性保護(hù)作用。因此，盡管安全問(wèn)題限制了減毒活疫苗的田間應(yīng)用，但仍可以推行疫苗接種策略來(lái)進(jìn)行一定程度的預(yù)防。其他免疫方法，如蛋白質(zhì)亞單位或DNA 構(gòu)建體，雖然其中一些能誘發(fā)特異性免疫反應(yīng)，但無(wú)法達(dá)到減毒活病毒所能達(dá)到的保護(hù)水平。盡管使用減毒活疫苗和亞單位疫苗獲得的體內(nèi)保護(hù)數(shù)據(jù)很少，但可以確定分子和免疫學(xué)機(jī)制參與了這種保護(hù)。一方面，盡管引發(fā)保護(hù)性反應(yīng)的特異性T 細(xì)胞決定因素在很大程度上仍然未知，但已廣泛證實(shí)特異性T 細(xì)胞起著關(guān)鍵作用。另一方面，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾種ASF 病毒血清學(xué)決定因素，但它們的保護(hù)作用尚不清楚。然而，據(jù)報(bào)道，ASF 病毒特異性抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移可提供免疫保護(hù)，證明其在控制感染上能發(fā)揮一定的作用。此外，新的證據(jù)表明，微生物群可能在防御病毒方面起著重要的作用，因?yàn)閷嘭i的糞便移植到家豬身上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)ASF 病毒的部分免疫保護(hù)。

另一種針對(duì)多種抗原的疫苗設(shè)計(jì)策略，能夠在不影響安全性的情況下誘發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，這可能是解決病毒生物學(xué)復(fù)雜性的一種方法。在這方面，反向疫苗學(xué)(reverse vaccinology，RV) 的應(yīng)用，對(duì)篩選越來(lái)越多的ASF 病毒序列以尋找最佳靶抗原表位非常有幫助。為開(kāi)發(fā)難以分離和培養(yǎng)的病原體的疫苗，反向疫苗學(xué)是基于對(duì)病原體基因組和/或蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的計(jì)算分析，以確定對(duì)假設(shè)的疫苗最感興趣的蛋白質(zhì)。使用計(jì)算機(jī)模擬方法(in-silico approach)還可以考慮病毒的變異性，特別是確定不變區(qū)域，有助于設(shè)計(jì)出具有廣泛保護(hù)性疫苗(pan-protecting vaccines)。同樣，它可以避免誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)所不需要的序列或可能會(huì)導(dǎo)致疾病惡化的序列。令人鼓舞的是，已經(jīng)有一種利用反向疫苗學(xué)生產(chǎn)的針對(duì)腦膜炎奈瑟菌血清B 群的疫苗于2013 年獲得許可。

1 結(jié)果

1.1 ASF 病毒蛋白空間分析

從UniProt 中46 個(gè)可用的病毒蛋白質(zhì)組中下載了7 088 條ASF 病毒蛋白質(zhì)序列?？偟膩?lái)說(shuō)，由于蛋白質(zhì)數(shù)量異常，有7 個(gè)蛋白質(zhì)組被去掉：Kyev 2016(UP000321214)、波蘭2016o23(UP000274966)、波蘭2016o9(UP000268777)、波蘭2017C220(UP000282187)、波蘭2016o10(UP000278405)、撒丁島 Sassari 2008(UP000266411)和南非1985/SPEC 57(UP000423628)。

用CD-HIT*CD-HIT是一個(gè)用于聚類和比較大量蛋白質(zhì)或核苷酸序列集的快速程序，以減少序列冗余并提高其他序列分析的性能。進(jìn)行蛋白質(zhì)聚類產(chǎn)生了459 個(gè)聚類。為了考慮每個(gè)聚類中ASF 病毒的變異性，我們?nèi)サ袅诵蛄性醋陨儆?4 個(gè)不同蛋白質(zhì)組的聚類。選擇該閾值是因?yàn)檫@是來(lái)自ASF病毒基因Ⅱ型(格魯吉Georgia 2007/1 分離株)的可用ASF 病毒蛋白質(zhì)組的數(shù)量，目的是保留所有可能的ORFs 屬于該基因型。因此，我們考慮進(jìn)一步分析173 個(gè)包含14 個(gè)或更多不同ASF 病毒蛋白質(zhì)組的蛋白質(zhì)簇。值得注意的是，為量化位置的變異性而計(jì)算香農(nóng)熵(Shannon entropy) 值顯示，在集群的多序列排列(multiple sequence alignments，MSAs)中，82.5%的氨基酸位置是完全不變的，即熵值H=0。因此，為了盡可能的嚴(yán)格，所有后續(xù)分析都是用指定香農(nóng)熵閾值為H=0 的不變的共識(shí)蛋白質(zhì)組(consensus proteome)來(lái)完成的。

1.2 鑒定ASF 病毒假定暴露的蛋白質(zhì)(putative-exposed proteins)

到目前為止，在ASF 病毒的表面只確定了一種蛋白質(zhì)：CD2 同系物(ORF：E402R)。為了鑒定病毒蛋白，我們付出了更多的努力，這些蛋白可能存在于受感染細(xì)胞膜的外表面和/或細(xì)胞外病毒粒子，因此容易被抗體中和。為了確定假定的暴露蛋白質(zhì)，我們用亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)ASF 病毒格魯吉2007/1 分離株蛋白質(zhì)組(UP000141072)，根據(jù)注釋規(guī)范(criteria of annotation)和預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列和/或至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，共選擇了49 個(gè)假定的暴露蛋白質(zhì)。假定暴露的蛋白質(zhì)包括那些被預(yù)測(cè)為暴露的蛋白質(zhì)，以及那些以前被描述為形成一部分外衣殼的蛋白質(zhì)，在無(wú)包膜的感染性顆粒的情況下是抗體的潛在靶位點(diǎn)。所有這些都被標(biāo)記為“暴露”，并與ASF病毒蛋白質(zhì)組的其他部分聚類，以找到所有ASF 病毒“暴露”蛋白質(zhì)的同系物。在包括14個(gè)或更多ASF 病毒蛋白質(zhì)組的173 個(gè)聚類中，只有43 個(gè)具有“暴露”蛋白質(zhì)，并選中用于進(jìn)一步探索B 細(xì)胞抗原表位的存在。

1.3 B 細(xì)胞抗原表位的選擇

我們?cè)诿庖呖乖砦粩?shù)據(jù)庫(kù)(immune epitope database，IEDB) 中發(fā)現(xiàn)了該病毒102 個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的、獨(dú)特的抗原表位，其中76 個(gè)是B 細(xì)胞抗原表位。我們保留了那些來(lái)源于假定的暴露蛋白的序列，然后對(duì)照ASF 病毒不變的“暴露”蛋白質(zhì)組解析了它們的全序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了9 個(gè)保守的B 細(xì)胞抗原表位。為了進(jìn)一步組織和管理這一選擇，我們使用BLASTP 將這些序列與野豬蛋白質(zhì)組和其微生物群的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比對(duì)。我們放棄了那些與野豬的蛋白質(zhì)或其微生物群的蛋白質(zhì)同源性大于70%的序列，將名單減少到來(lái)自3 個(gè)不同蛋白的4 個(gè)保守的B 細(xì)胞抗原表位：兩個(gè)來(lái)自主要的衣殼蛋白p72(B646L)，兩個(gè)來(lái)自內(nèi)衣殼蛋白p22(KP177R) 和p54(E183L)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗原表位VCKVDKDCGSGEHCV(p22 蛋白)和FPENSHNIQTAGKQD(p72 蛋白) 與基于序列預(yù)測(cè)的抗原表位具有相同的殘基；后者也與結(jié)構(gòu)化預(yù)測(cè)抗原表位共享殘基。

1.4 重新(de novo)預(yù)測(cè)的B 細(xì)胞抗原表位

除了免疫抗原表位數(shù)據(jù)庫(kù)(IEDB) 中傳統(tǒng)的B 細(xì)胞抗原表位外，我們還采用了兩種方法來(lái)預(yù)測(cè)新的抗原表位：基于序列的方法和基于結(jié)構(gòu)的方法。按照基于序列的方法，我們檢索到42 個(gè)在ASF 病毒中保守的潛在B 細(xì)胞抗原表位。對(duì)于那些我們預(yù)測(cè)的跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白抗原表位，我們繪制了它們的圖譜，以評(píng)估它們?cè)凇巴獠俊钡亩ㄎ?。任何映射到跨膜蛋白?nèi)測(cè)或跨膜位置內(nèi)的表位都被丟棄。此外，我們用PyMOL 軟件*PyMOL 軟件一款功能強(qiáng)大的分子可視化軟件，適用于創(chuàng)作高品質(zhì)的小分子或生物大分子(特別是蛋白質(zhì))的三維結(jié)構(gòu)圖像；以Py+MOL 命名指，“Py”表示它是由一種計(jì)算機(jī)語(yǔ)言Python 所衍生出來(lái)的，“MOL”表示它是用于顯示分子(英文為molecule)結(jié)構(gòu)的軟件。對(duì)主要的衣殼蛋白p72(PDB ID：6L2T)的潛在抗原表位進(jìn)行了觀察，并丟棄了那些沒(méi)有暴露的抗原表位，即面向病毒粒子外衣殼抗原表位。通過(guò)這種方法，我們將列表中的抗原表位減少到29 個(gè)，并取消了另外兩個(gè)抗原表位，因?yàn)樗鼈兣c野豬或其糞便中微生物群的蛋白質(zhì)序列的同源性大于70%。所選擇的27 個(gè)預(yù)測(cè)的B 細(xì)胞抗原表位來(lái)自于13 種不同的蛋白。其中一些抗原表位與在IEDB 中驗(yàn)證的序列具有相同的殘基。這是由于IEDB 中的抗原表位是根據(jù)共識(shí)蛋白質(zhì)組進(jìn)行整體解析的，這導(dǎo)致放棄了具有可變位置的長(zhǎng)序列和/ 或與豬體內(nèi)蛋白質(zhì)的同源性大于70%的序列。

對(duì)于基于結(jié)構(gòu)的方法，我們對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein data bank，PDB)中提供的ASF病毒主要衣殼蛋白p72 兩種結(jié)構(gòu)上的殘基的靈活性和殘基相對(duì)可溶性(relative solvent accessibility，RSA) 施加了特定的限制：6KU9 和6L2T。我們確定了13 個(gè)潛在的抗原表位，這些抗原表位在“暴露”的不變蛋白質(zhì)組中也是保守的。在丟棄非獨(dú)特的肽后，由于p72 同源三聚體組裝成殼體，并融合了重疊的抗原表位，我們最終得到了8 個(gè)獨(dú)特結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的B 細(xì)胞抗原表位，其中僅有3 個(gè)與野豬及其微生物群的蛋白質(zhì)的同源性不超過(guò)70%，均來(lái)自PDB 結(jié)構(gòu)6L2T。在PyMOL 軟件觀察它們的易接近性時(shí)，我們?nèi)サ袅宋挥谠摰鞍踪|(zhì)底部的一個(gè)抗原表位，因此是非暴露的。其余兩個(gè)潛在的抗原表位顯示在圖2 中。這兩個(gè)抗原表位是基于序列的方法預(yù)測(cè)的。

1.5 CD4+T 細(xì)胞抗原表位的選擇

在免疫抗原表位數(shù)據(jù)庫(kù)的102 個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗原表位中，26 個(gè)是T 細(xì)胞抗原表位。這些抗原表位缺乏有關(guān)與主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)結(jié)合的信息，但考慮到它們的長(zhǎng)度(≥15個(gè)氨基酸)，我們認(rèn)為它們是CD4+T 細(xì)胞抗原表位。只有三個(gè)是保守的，都來(lái)自同一個(gè)蛋白質(zhì)CD2 同系物。然而，利用BLASTP 與豬及其微生物群的蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，這些蛋白質(zhì)的同源性都不超過(guò)70%，所以去掉了它們。

1.6 預(yù)測(cè)新的CD4+T 細(xì)胞抗原表位

我們沒(méi)有在IEDB 中找到符合選擇標(biāo)準(zhǔn)的ASF 病毒CD4+T 細(xì)胞抗原表位，所以我們預(yù)測(cè)了新的CD4+T 細(xì)胞抗原表位，以確定它們是否可能會(huì)被納入疫苗集合(ensemble)中。在不變的蛋白質(zhì)組上應(yīng)用 IEDB MHC Ⅱ類結(jié)合預(yù)測(cè)工具，共產(chǎn)生了13 342 個(gè)潛在的15-mer 抗原表位，我們繼續(xù)研究前0.1%結(jié)合者中的273 個(gè)序列，其中大部分是較大肽的15-mer 片段。重疊序列的融合產(chǎn)生了74 個(gè)獨(dú)特的肽序列。我們?nèi)サ袅巳魏伪活A(yù)測(cè)為只與一個(gè)等位基因結(jié)合的抗原表位，因此，我們保留了16 個(gè)序列。利用BLASTP 對(duì)野豬及其微生物群的蛋白質(zhì)進(jìn)行對(duì)比后，我們從13 個(gè)不同的蛋白質(zhì)中選擇了14 個(gè)潛在的抗原表位，這些抗原表位與這些蛋白質(zhì)的同源性不超過(guò)70%。

1.7 CD8+T 細(xì)胞抗原表位的選擇

在免疫抗原表位數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的CD8+T 細(xì)胞抗原表位，而文獻(xiàn)檢索也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何存在于不變蛋白質(zhì)組中的抗原表位。因此，我們使用模仿這些抗原表位在細(xì)胞內(nèi)自然處理途徑的步驟序列來(lái)預(yù)測(cè)新的CD8+T 細(xì)胞抗原表位。

蛋白酶體加工不變的蛋白質(zhì)組產(chǎn)生了277個(gè)最小長(zhǎng)度為9 個(gè)氨基酸的保守肽，任何短于9 個(gè)氨基酸的片段都被去掉。我們從那些大于9 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白酶體反應(yīng)衍生的片段中創(chuàng)建了所有可能重疊9-mer 的多肽組合，產(chǎn)生了669 個(gè)潛在的抗原表位。我們采用log(IC50) 值為1 作為串聯(lián)親和純化法(tandem affinity purification，TAP) 的閾值，將潛在的抗原表位列表限制在40 個(gè)肽的序列。IEDB MHC Ⅰ類結(jié)合工具預(yù)測(cè)了其中33 個(gè)在前1%內(nèi)，其中22 個(gè)與野豬蛋白質(zhì)的同源性不超過(guò)70%。然而，考慮到與微生物群的蛋白質(zhì)的潛在交叉反應(yīng)性，我們提高到了≤80%的同源性閾值。選定的潛在CD8+T細(xì)胞抗原表位的最終清單僅包含來(lái)自6 個(gè)不同蛋白質(zhì)的6 條肽。

2 討論

自2018 年以來(lái)，非洲、歐洲、亞洲和大洋洲的幾十個(gè)國(guó)家都暴發(fā)了ASF，中國(guó)首次報(bào)道于2018 年，根據(jù)官方的消息，亞洲生豬總損失估計(jì)超過(guò)600 萬(wàn)頭。

由于目前尚無(wú)有效的治療方法，針對(duì)ASF病毒的防控顯然迫切需要有效的方法，但還沒(méi)有成功開(kāi)發(fā)出安全且有效的疫苗。目前，大多數(shù)后期的免疫力都是利用自然發(fā)生或在實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的減毒活病毒進(jìn)行的。例如，用低毒力的NHV/1968 變異體進(jìn)行免疫接種，可對(duì)密切相關(guān)但高毒力的ASF 病毒L60 分離株產(chǎn)生免疫力。因此，對(duì)異源性分離株的挑戰(zhàn)只能達(dá)到部分免疫，并且對(duì)接種豬產(chǎn)生了有害的副作用。另一個(gè)有希望的疫苗接種策略是使用缺失CD2 同源蛋白的ASF 病毒Ba71 分離株。這種毒力減弱的病毒可提供對(duì)母體病毒的免疫力，也可提供對(duì)異源變體ASF 病毒E75 分離株和ASF 病毒格魯吉2007/1 分離株的免疫，而不會(huì)產(chǎn)生明顯的副作用。令人震驚的是，同樣的原則在使用CD2 同源缺乏的Georgia 2007/1 分離株時(shí)未能產(chǎn)生免疫保護(hù)，突出了ASF 病毒的表型多樣性。一個(gè)合理的解釋可能是存在冗余的ORFs，可以覆蓋CD2 同系物的基本功能。事實(shí)上，ASF 病毒格魯吉2007/1 分離株與Ba71 分離株相比顯示出更大的復(fù)雜性，與后者相比前者有更多的ORFs。這進(jìn)一步加強(qiáng)了我們對(duì)ASF 病毒格魯吉2007/1 分離株的關(guān)注，因?yàn)槲覀兿氡M可能地解決這種復(fù)雜性。

也有人嘗試用轉(zhuǎn)基因病毒進(jìn)行免疫接種，但在誘發(fā)的免疫水平、獲得對(duì)異源分離株的保護(hù)或出現(xiàn)有害的副作用方面結(jié)果各異。人們也在追求用ASF 病毒亞單位的特定病毒蛋白進(jìn)行免疫。這類疫苗比上述方法更加安全，有各種基于亞單位免疫的許可產(chǎn)品的例子。然而，對(duì)于ASF 病毒來(lái)說(shuō)，這種策略只能提供部分保護(hù)或根本不提供保護(hù)。

在本研究中，我們使用計(jì)算機(jī)輔助方法來(lái)確定一組ASF 病毒抗原表位，這可能對(duì)設(shè)計(jì)基于抗原表位的ASF 疫苗很有意義(圖3)。為了激發(fā)廣泛而強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，以抵御異源性分離株的挑戰(zhàn)，我們優(yōu)先選擇了在不同ASF 病毒分離株中嚴(yán)格保守的潛在抗原表位序列。選擇保守的抗原表位也有一個(gè)好處，就是對(duì)ASF病毒而言這些高度保守區(qū)域在生物學(xué)上可能是必需的，因此可用于制作疫苗的理想靶區(qū)。然而，任何選擇的抗原表位必須能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生真正的保護(hù)性反應(yīng)，因?yàn)榧词勾嬖谥泻涂贵w，涉及非中和(non-neutralized)ASF 病毒的慢性感染已被大量地報(bào)道。

在選擇B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的抗原表位時(shí)，我們采取了多種策略，包括查詢免疫抗原表位數(shù)據(jù)庫(kù)的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法，以及通過(guò)成熟的免疫信息學(xué)工具對(duì)抗原表位進(jìn)行重新預(yù)測(cè)。對(duì)序列進(jìn)行優(yōu)先排序的依據(jù)是其與野豬及其微生物群的蛋白質(zhì)的同源性不超過(guò)70%這一閾值。這樣做的理由是：首先，任何具有與宿主中蛋白質(zhì)序列不同的序列在傳遞時(shí)將有更大的機(jī)會(huì)獲得免疫原性，這是未來(lái)疫苗的一個(gè)理想特征。其次，出于安全考慮，與宿主的蛋白質(zhì)序列不同的序列應(yīng)避免交叉反應(yīng)。此外，由于微生物群最近被證實(shí)在動(dòng)物抵抗ASF 上扮演一個(gè)有重大意義的角色，任何最佳的疫苗都應(yīng)能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全身性免疫和黏膜免疫，能夠阻斷病原體，同時(shí)避免針對(duì)不受宿主微生物群歡迎的疫苗誘導(dǎo)反應(yīng)。在對(duì)CD8+T 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行優(yōu)先排序時(shí)，利用BLASTP 比對(duì)微生物群的蛋白質(zhì)序列時(shí)使用了≤80%的閾值，這一事實(shí)與這些抗原表位固有的短長(zhǎng)度(9-mers)有關(guān)，否則在更嚴(yán)格的閾值下會(huì)被去掉。必須強(qiáng)調(diào)的是，由于在物種水平上缺乏豬的微生物群的數(shù)據(jù)，BLASTP是針對(duì)報(bào)告存在于豬體內(nèi)的每個(gè)微生物屬中所有微生物物種進(jìn)行的，這可能包括未真正存在于豬體內(nèi)的微生物物種。因此，我們決定將≤80%的閾值作為低分辨性和BLASTP 命中之間的良好權(quán)衡。

抗體在ASF 病毒免疫中具有重大的意義，因?yàn)閺拇婊畹呢i上轉(zhuǎn)移的抗ASF 病毒免疫球蛋白G(IgG)可以防止感染。我們遵循三種不同的方法來(lái)選擇可能感興趣的B 細(xì)胞抗原表位：一種是傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法，在IEDB 中搜索保守和經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗原表位，還有兩種重新預(yù)測(cè)的方法，一種是基于BepiPred-2.0 的序列方法，另一種是基于結(jié)構(gòu)的方法，使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB)的三維結(jié)構(gòu)，只適用于p72 的情況。

ASF 病毒是一種包膜病毒，包膜隱藏在脂質(zhì)雙分子層之下(圖1)。迄今為止，已知嵌入脂質(zhì)外膜的唯一蛋白是CD2 同源蛋白(E402R)，我們根據(jù)序列方法預(yù)測(cè)了它的抗原表位。該蛋白是不同ASF 病毒中差異最大的蛋白之一，因此在不同ASF 病毒分離株之間發(fā)現(xiàn)一個(gè)保守的抗原表位是有意義的。雖然這是一種包膜病毒，但據(jù)報(bào)道，細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的“裸體”顆粒都具有感染性。ASF 病毒感染可導(dǎo)致細(xì)胞裂解，而釋放的細(xì)胞內(nèi)顆?？赡芤呀?jīng)具有感染性。這些“裸”病毒的抗原表面主要由重要的衣殼蛋白p72 蛋白(B646L)的拷貝組成，它構(gòu)成了外衣殼的大部分。此外，已經(jīng)報(bào)道存在針對(duì)這種蛋白的中和抗體，證明了從p72 蛋白中優(yōu)先選擇B 細(xì)胞抗原表位的理由。我們從IEDB 中搜索并找到了兩個(gè)保守的序列，此外還有2 個(gè)基于結(jié)構(gòu)的方法預(yù)測(cè)的抗原表位和7個(gè)基于序列的方法預(yù)測(cè)的抗原表位。值得注意的是，從p72 三維結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)抗原表位(圖2) 都含有與基于序列方法預(yù)測(cè)的序列和IEDB 的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證序列相匹配的殘基，其中一個(gè)還在保守序列FPENSHNIQTAGKQD 中發(fā)現(xiàn)。除了p72 蛋白，我們預(yù)測(cè)的另一個(gè)蛋白是M1249L 蛋白，Wang 等將其確定為帽狀體骨架的一個(gè)重要部分，因此在“裸”病毒粒子的情況下可能被抗體鎖定。

其他選定的潛在B 細(xì)胞抗原表位來(lái)自于該外衣殼下面的蛋白質(zhì)，嵌入到內(nèi)脂層中。p54 蛋 白(E183L) 和p22 蛋 白(KP177R) 的 抗原表位都是通過(guò)IEDB 傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)搜索(legacy experimentation search)和基于序列方法發(fā)現(xiàn)的，在p22 蛋白的特殊情況下，根據(jù)序列預(yù)測(cè)的抗原表位與經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗原表位共享一半以上的序列。此外，我們?cè)趐17 蛋白(D117L)中預(yù)測(cè)了一個(gè)抗原表位，在p49 蛋白(B438L)中預(yù)測(cè)了五個(gè)抗原表位，后者有一個(gè)抗原表位與在IEDB 驗(yàn)證的序列中發(fā)現(xiàn)的殘基相同。如上所述，所有這些蛋白都位于病毒粒子的內(nèi)層，有關(guān)它們的抗體的保護(hù)作用可能并不明確。盡管如此，有研究報(bào)道了由針對(duì)內(nèi)層粒子蛋白p22 蛋白、p54 蛋白和p30 蛋白(CP204L) 的抗體介導(dǎo)的中和作用，表明存在一種機(jī)制，這些蛋白通過(guò)這種機(jī)制可以與抗體相接觸?？梢约僭O(shè)，病毒粒子層是動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，而不是靜態(tài)結(jié)構(gòu)，因此，存在于其中的蛋白質(zhì)可能容易被中和。此外，還預(yù)測(cè)了來(lái)自B169L 蛋白、C257L蛋白、B475L 蛋白、E146L 蛋白、反式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶B318L 和MGF 110-9L 的抗原表位，但通過(guò)文獻(xiàn)無(wú)法證實(shí)它們?cè)诓《绢w粒中的位置。我們選擇這些蛋白質(zhì)是為了鑒定可能暴露的病毒蛋白質(zhì)。

綜上所述，必須強(qiáng)調(diào)的是，以前的疫苗接種研究已經(jīng)確定這些抗原中的一些會(huì)加重疾病，可能通過(guò)抗體依賴性增強(qiáng)感染，就像p30 蛋白、p54 蛋白、p17 蛋白、p72 蛋白甚至CD2 同系物的情況那樣，在對(duì)它們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證時(shí)應(yīng)格外謹(jǐn)慎。此外，預(yù)測(cè)方法的一個(gè)局限性是，用所遵循的方法我們無(wú)法預(yù)測(cè)B 細(xì)胞構(gòu)象性抗原表位(conformational B-cell epitopes)。非蛋白質(zhì)抗原表位如基于糖的抗原表位也沒(méi)有被檢索到。

以前用減毒活疫苗和DNA 疫苗進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，CD8+T 細(xì)胞在產(chǎn)生對(duì)ASF 病毒的免疫力上發(fā)揮了主要作用，但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的CD8+T 細(xì)胞保守抗原表位。我們只能依靠計(jì)算方法來(lái)預(yù)測(cè)它們。最終選擇的6 個(gè)抗原表位經(jīng)預(yù)測(cè)可以與預(yù)測(cè)工具中45 個(gè)豬淋巴細(xì)胞抗原(swine lymphocyte antigens，SLA)I類等位基因中的38個(gè)結(jié)合。與該種類的SLA 等位基因的結(jié)合將確保能夠覆蓋廣泛的種群。事實(shí)上，僅用抗原表位MAMQKLFTY 和KRHENIWML 就可以達(dá)到最大的覆蓋率。值得注意的是，所有選定的CD8+T 細(xì)胞潛在抗原表位都來(lái)自于病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄機(jī)制。假定的DNA 定向RNA 聚合酶亞單位5 同源物(D205R)、非特征蛋白D339L(在別處稱為RNA 聚合酶亞單位)、DNA 定向RNA 聚合酶亞單位β(EP1242L)、核糖核苷-二磷酸還原酶(F334L)、DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶2(P1192R) 和非特征蛋白G1340L(在別處描述為可能的早期轉(zhuǎn)錄因子)。一系列的CD4+T 細(xì)胞抗原表位也被選中。初始T 輔助細(xì)胞(naive Th cells)通常由抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs) 激活，而這些細(xì)胞恰好是ASF病毒的主要靶點(diǎn)(巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞)。這種現(xiàn)象可能會(huì)妨礙APCs 呈遞抗原的能力，而這是形成有效的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。CD4+T 細(xì)胞在平衡和維持細(xì)胞毒性和體液反應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用，因此任何疫苗研究都應(yīng)考慮這些細(xì)胞的作用。在本研究中，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的CD4+T 細(xì)胞在IEDB 中的保守抗原表位，所以我們被迫對(duì)其進(jìn)行預(yù)測(cè)。我們的新方法發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)潛在的CD4+T 細(xì)胞抗原表位。值得注意的是，CD2 同系物和p72 蛋白，即B 細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)因子，各提供一個(gè)CD4+T 細(xì)胞的潛在抗原表位。必須指出的是，大多數(shù)免疫信息學(xué)工具都是根據(jù)人類免疫學(xué)背景下的數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)和校準(zhǔn)的，這可能會(huì)對(duì)ASF 病毒CD4+T 細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)產(chǎn)生影響。

最終，我們確定了6 個(gè)CD8+T 細(xì)胞抗原表位、14 個(gè)CD4+T 細(xì)胞抗原表位和29 個(gè)B細(xì)胞抗原表位的優(yōu)先順序，這些抗原表位是獨(dú)特且保守的?？紤]到迄今為止所介紹的所有ASF 病毒分離株之間的變異性，這一清單為根據(jù)ASF 病毒抗原表位設(shè)計(jì)疫苗提供了廣泛的可能性。下一步將包括通過(guò)預(yù)測(cè)方法對(duì)這些抗原表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，并全面評(píng)估它們的個(gè)體和/或群體誘發(fā)免疫反應(yīng)的能力，以抵抗病毒攻擊。在闡明這一點(diǎn)后，它們很可能有助于設(shè)計(jì)一個(gè)安全且有效的基于抗原表位的非洲豬瘟疫苗組合。

3 結(jié)論

我們確定了49 個(gè)抗原表位，包括B 細(xì)胞和T 細(xì)胞(CD4+和CD8+) 的抗原表位，它們有可能被用作基于抗原表位的非洲豬瘟疫苗的一部分。它們?cè)贏SF 病毒中都是嚴(yán)格保守的，并且與野豬及其微生物群的蛋白質(zhì)顯示出較低的一致性。然而，其中只有4 個(gè)抗原表位有實(shí)驗(yàn)性證據(jù)表明它們被豬的免疫系統(tǒng)合理地處理、遞呈和識(shí)別。因此，本研究的下一步將對(duì)這些重新預(yù)測(cè)的抗原表位進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。如果可能的話，還應(yīng)通過(guò)體外免疫學(xué)試驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行功能鑒定，包括免疫原性和保護(hù)性的替代物。只有到那時(shí)，才有可能構(gòu)思出一種包括這些抗原表位的疫苗，并將其應(yīng)用于體內(nèi)試驗(yàn)中。