神經(jīng)絲蛋白輕鏈與癲癇相關(guān)研究進(jìn)展*

王慧瑜 鹿樹(shù)軍 席婭琳 王美玲

癲癇是一種慢性嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常反復(fù)發(fā)作。癲癇影響著所有年齡段的人群，并已成為影響全世界7 000 多萬(wàn)患者的全球健康問(wèn)題，尤其是難治性癲癇，給患者及其家庭、社會(huì)均帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。該疾病的發(fā)生是由于大腦活動(dòng)異常導(dǎo)致，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)之間的異常連接可能導(dǎo)致病理上的同步放電和隨后的反復(fù)發(fā)作[1]。目前，尚無(wú)特定的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)。

生物標(biāo)志物是一種客觀的檢測(cè)方法，可以作為人體健康狀況及觀察疾病的進(jìn)展和預(yù)后的指標(biāo)。近年來(lái)，關(guān)于神經(jīng)絲蛋白（neurofilaments，NF）作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病生物標(biāo)志物的研究越來(lái)越多[2]。神經(jīng)絲蛋白輕鏈（neurofilament light chain，NfL）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損害的標(biāo)志物之一。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，腦脊液（CSF）和血液中的NfL 水平在多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中發(fā)生改變，并在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，是一種潛在的輔助鑒別診斷和評(píng)估預(yù)后的生物標(biāo)志物，但其與癲癇的關(guān)系還需要進(jìn)一步探究[3-4]。因此，針對(duì)癲癇的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物研究仍是一個(gè)重大的臨床挑戰(zhàn)。

1 癲癇

1.1 癲癇的發(fā)生機(jī)制 癲癇是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，它是由于神經(jīng)元異常過(guò)度或同步化放電導(dǎo)致反復(fù)癲癇發(fā)作[5]。已確定的病因包括急性腦損傷（如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良、中風(fēng)、腦腫瘤或癲癇持續(xù)狀態(tài)）、基因突變、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、代謝紊亂和自身免疫狀況[6]。癲癇發(fā)生是指將非癲癇性大腦轉(zhuǎn)變?yōu)槟墚a(chǎn)生自發(fā)、反復(fù)發(fā)作的大腦的過(guò)程。這一過(guò)程是由神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)內(nèi)興奮性和抑制性活動(dòng)之間的不平衡造成的[7-8]，因此它可能以過(guò)度、超同步、振蕩的方式發(fā)揮作用，一旦持續(xù)，就會(huì)干擾正常的神經(jīng)元和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[9-10]。

1.2 癲癇致癇灶病理變化 顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人最常見(jiàn)的癲癇類(lèi)型，其中海馬硬化（hippocampal sclerosis，HS）是最常見(jiàn)的病理改變。海馬硬化的特點(diǎn)是海馬角（cornu ammonis，CA）中CA1、CA3 和CA4 亞區(qū)的錐體細(xì)胞選擇性死亡。齒狀回顆粒細(xì)胞（granule cell，GC）的死亡程度遠(yuǎn)低于錐體細(xì)胞，但顯示出兩種不同的病理變化：其細(xì)胞體的遷移，稱(chēng)為顆粒細(xì)胞分散（granule cell dispersion，GCD），以及其軸突的發(fā)芽，即苔蘚纖維發(fā)芽（mossy fiber sprouting，MFS）[11-13]。致癇性損傷后，會(huì)出現(xiàn)MFS 并形成新的突觸連接。出芽的苔蘚纖維（mossy fiber，MF）很可能與GC 的樹(shù)突棘形成突觸。GC 是齒狀回中的神經(jīng)元細(xì)胞，它們的棘狀樹(shù)突穿過(guò)顆粒細(xì)胞層投射到分子層，并在分子層中延伸和分出分支。苔蘚細(xì)胞的丟失和MF 的發(fā)芽并不是簡(jiǎn)單用一個(gè)周期性興奮網(wǎng)絡(luò)取代另一個(gè)，相反，它用一個(gè)局部單突觸的興奮性反饋電路取代了一個(gè)遠(yuǎn)端分布的突觸性興奮性反饋電路[14-15]。有研究證明，在TLE 患者中，廣泛的MFS 進(jìn)入顆粒細(xì)胞層和分子層與CA4 和CA3區(qū)域的MF 缺失相關(guān)。MFS 取決于海馬區(qū)選擇性神經(jīng)元丟失的程度。在輕度海馬硬化伴輕度神經(jīng)元死亡（Wyler 分級(jí)Ⅰ、Ⅱ級(jí)）的患者中，MF 通常沿其自然方式投射到CA4 和CA3 中，而很少有MF 發(fā)芽進(jìn)入顆粒細(xì)胞層和分子層。相反，在嚴(yán)重的海馬硬化癥（Wyler Ⅲ、Ⅳ級(jí)）中，CA4 和CA3 區(qū)域中有大量的MF 發(fā)芽，這很可能是高度硬化癥患者發(fā)芽的MF 和顆粒細(xì)胞丟失的代償作用，并且與較長(zhǎng)的癲癇病程有關(guān)。此外，MFS 與GCD 的程度也相關(guān)[12]。這些結(jié)果證實(shí)了MF 發(fā)芽的假設(shè)，即它們因海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡而失去了CA4 和CA3 區(qū)域的靶細(xì)胞。另外，相關(guān)研究顯示，MFS 并不局限于齒狀回，而且可能在沒(méi)有靶神經(jīng)元死亡的情況下發(fā)育。在大量TLE 患者中，HS 中的MFS 并不局限于顆粒細(xì)胞層和分子層，而是在CA2 區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，在CA1 區(qū)的程度較低。以往認(rèn)為，進(jìn)入顆粒細(xì)胞層的經(jīng)典的MFS 是由CA3和CA4 的靶神經(jīng)元喪失引發(fā)的[12，16-17]。進(jìn)入CA2 的MFS 可能被解釋為類(lèi)似的方式，因?yàn)镃A2 和顆粒細(xì)胞層的神經(jīng)元比CA4、CA3 和CA1 的神經(jīng)元顯示出更好的存活性。然而，除了發(fā)芽至CA2 的MF 外，CA1 區(qū)域也存在MFS，這是一個(gè)有明顯細(xì)胞死亡的區(qū)域。該研究也表示，根據(jù)HS 的新ILAE 類(lèi)型[18]，在ILAE 2 型中，盡管保留CA3 和CA4 的神經(jīng)元細(xì)胞，但仍有廣泛的MFS 進(jìn)入顆粒細(xì)胞層、CA2 和CA1 區(qū)域。過(guò)去，TLE 中的MFS 被認(rèn)為是由CA3和CA4 區(qū)域的靶神經(jīng)元死亡觸發(fā)的，并被定向到存活的顆粒細(xì)胞。而現(xiàn)有研究表明，MFS 到CA2 甚至CA1 區(qū)域，這與局部細(xì)胞損失無(wú)關(guān)[11]。

2 神經(jīng)絲蛋白

2.1 神經(jīng)絲蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 NF 是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要組成部分，主要分布于神經(jīng)元的有髓軸突中，呈直的平行排列，且長(zhǎng)度較長(zhǎng)（平均118 mm），而分布在神經(jīng)元樹(shù)突和細(xì)胞核周中的NF 相對(duì)稀疏且彎曲[19-20]。根據(jù)NF 直徑（約10 nm），將其歸類(lèi)為中間絲蛋白，介于肌動(dòng)蛋白絲（6 nm）和肌球蛋白絲（15 nm）間。一個(gè)成熟神經(jīng)系統(tǒng)中的NfL、神經(jīng)絲中鏈（neurofilament medium chain，NfM）、神經(jīng)絲重鏈（neurofilament heavy chain，NfH）、α-內(nèi)聯(lián)蛋白和外周蛋白組成。NF 由分子量不同的5 個(gè)亞基組成，它們?cè)诩?xì)胞骨架中具有結(jié)構(gòu)功能，與其他纖維建立交叉橋接[21-22]。其中一個(gè)分子量較小的亞基——NfL 可作為軸突損傷的生物學(xué)標(biāo)記物。神經(jīng)元軸突損傷后，CSF 及在各種急性和慢性神經(jīng)疾病的血液中NfL 均會(huì)隨之升高，包括炎癥、神經(jīng)退行性疾病及中風(fēng)。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，測(cè)量血液中NfL 水平已成為可能。因此，NfL 可能是未來(lái)臨床實(shí)踐和研究中最方便、最有希望的生物標(biāo)志物之一[23-24]。

NF 通過(guò)與細(xì)胞骨架的其他成分交叉橋接和互連形成細(xì)胞骨架的組裝和穩(wěn)定性[25]。NF 通過(guò)維持軸突的大小、形狀和口徑來(lái)提供結(jié)構(gòu)支持。此外，NF 構(gòu)成了一個(gè)參與神經(jīng)元分化、軸突生長(zhǎng)和再生的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)。在大的有髓軸突中，高密度的NF 促進(jìn)徑向軸突生長(zhǎng)。它們被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)元軸突的徑向生長(zhǎng)和穩(wěn)定性至關(guān)重要，從而實(shí)現(xiàn)有效的高速神經(jīng)傳導(dǎo)。在分子水平上，NF 有助于塑造細(xì)胞環(huán)境、定位細(xì)胞核并支持細(xì)胞器。一些報(bào)告表明，NF 可與其他蛋白質(zhì)和細(xì)胞器相互作用，包括線粒體和微管[19-21]。NfL 是神經(jīng)元軸突中肌球蛋白的主要配體之一[26]，NfL 與神經(jīng)元軸突中的肌球蛋白Va（myosin Va，Myo Va）的N 端運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這對(duì)維持正常的Myo Va 水平、分布和運(yùn)輸至關(guān)重要。同時(shí)，Myo Va 與NfL 的結(jié)合還調(diào)節(jié)軸突中囊泡細(xì)胞器的分布[27-28]。NfL 與線粒體結(jié)合，并可能調(diào)節(jié)其動(dòng)力學(xué)，如引起周?chē)窠?jīng)病變Charcot-Marie-Tooth 病的NfL 的基因突變會(huì)阻礙神經(jīng)元線粒體的運(yùn)動(dòng)[29]。在編碼NF 的基因中發(fā)現(xiàn)的幾種突變可導(dǎo)致異常的神經(jīng)絲聚集和積累，從而導(dǎo)致軸突功能障礙和神經(jīng)退行性變。NfL 還參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，最近的證據(jù)表明，NF 亞單位的獨(dú)特組裝體也是突觸的組成部分。NfL 是突觸棘的關(guān)鍵組成部分，對(duì)維持突觸結(jié)構(gòu)完整性和功能至關(guān)重要。NfL 對(duì)于維持N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）的穩(wěn)定性和免疫突觸的活性也至關(guān)重要[20，30]。

2.2 可溶性神經(jīng)絲蛋白的檢測(cè) 在NF 亞基中，NfL 是最豐富的，并且可溶于CSF 和血液。NfL 已成為許多神經(jīng)系統(tǒng)急慢性疾病的重要生物標(biāo)志物，如多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病、帕金森病和急性脊髓損傷[31]。在過(guò)去三十年中，靈敏免疫分析技術(shù)的發(fā)展取得了很大的進(jìn)展，NF 的檢測(cè)技術(shù)逐步得到了改進(jìn)，更具臨床應(yīng)用價(jià)值[21]。第一代免疫印跡法是半定量的檢測(cè)方法，對(duì)血液中NfL 水平的檢測(cè)靈敏度有限[32]。第二代酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）與第三代電化學(xué)發(fā)光免疫（electrochemiluminescence，ECL）兩項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)雖可檢測(cè)出不同疾病患者血液中的NF 水平，但尚不能監(jiān)測(cè)與疾病相關(guān)的微小變化[33-34]。第四代單分子免疫陣列檢測(cè)（single-molecule array，SiMoA），對(duì)于NfL 的定量，SiMoA 技術(shù)的靈敏度分別是ELISA 和ECL 檢測(cè)的126 倍和25 倍。該技術(shù)提高了分析敏感度，從而可以在疾病和生理?xiàng)l件下觀察到的濃度范圍內(nèi)可靠地量化血液中的NfL 水平。這種尖端方法基于單分子陣列和同時(shí)計(jì)數(shù)單個(gè)捕獲微珠（直徑2.7 μm），該微珠攜帶夾心抗體復(fù)合物（兩種抗體和一種抗原）。分析敏感度比使用為CSF測(cè)量設(shè)計(jì)的ELISA 格式中使用相同抗體獲得的敏感度高出許多倍，并且能可靠測(cè)量年輕健康個(gè)體血液樣本中存在的低NfL 濃度[35]。因此可以監(jiān)測(cè)正常老化或輕度損傷后發(fā)生的NfL 水平的變化。許多研究表明血清或血漿與中NfL 水平與CSF 中的水平呈正相關(guān)，證明了NfL 作為多種疾病的血液生物標(biāo)志物的有效性[34，36]。因此允許從血液水平得出關(guān)于正在進(jìn)行的神經(jīng)軸突損傷程度的結(jié)論，而無(wú)需通過(guò)腰椎穿刺獲得CSF[35，37-38]。在正常條件下，NfL 從軸突以恒定的低水平釋放；然而，這個(gè)比率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。在軸突損傷時(shí)，腦脊液中NfL 的濃度可以增加到其原始水平的40 倍[37，39]。因此，NfL水平增加可以作為軸突損傷程度和疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)[21]。

3 NfL與癲癇

在癲癇發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞變化包括神經(jīng)退行性變、軸突出芽、軸突和髓鞘損傷、樹(shù)突重塑、各種類(lèi)型的膠質(zhì)增生、炎性細(xì)胞侵襲、血腦屏障損傷、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)成分的變化、物質(zhì)（如鐵和鈣）的可能聚集[40]，這些病理變化形成了一個(gè)“細(xì)胞和分子生態(tài)系統(tǒng)”，在這個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中，興奮性增加，最終引發(fā)癲癇發(fā)作，并可通過(guò)治療進(jìn)行調(diào)節(jié)。致癇組織環(huán)境表達(dá)并分泌可作為不同癲癇適應(yīng)證的生物標(biāo)志物的分子，包括治療試驗(yàn)，使用多種檢測(cè)方法，如血液和CSF 分析、腦組織分析（如皮質(zhì)或海馬組織）、影像學(xué)或電生理學(xué)。重要的是，在每個(gè)階段，致癇過(guò)程和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)都可能受到遺傳組成、微生物群和暴露體的調(diào)節(jié)。在過(guò)去四年中，癲癇生物標(biāo)志物研究的數(shù)量迅速增加[41]。軸突損傷的兩個(gè)最成熟的腦脊液生物標(biāo)志物是磷酸化微管相關(guān)蛋白tau 蛋白和NfL[42]。有研究指出，當(dāng)神經(jīng)軸突損傷時(shí)，NfL 可能大量釋放到血液中[22]，因此代表了神經(jīng)損傷的一個(gè)有前景的微創(chuàng)生物標(biāo)志物。同時(shí)該研究也表明，癲癇持續(xù)狀態(tài)患者的血清NfL（serum NfL，sNfL）水平明顯高于耐藥性癲癇患者組（單次孤立癲癇發(fā)作后24 h 內(nèi)采集血樣）和健康對(duì)照組，而耐藥性癲癇患者組和健康對(duì)照組之間的sNfL 水平?jīng)]有差異；且發(fā)現(xiàn)sNfL 和CSF NfL 水平之間存在高度相關(guān)性[22]。當(dāng)分析sNfL 與治療結(jié)果的關(guān)系時(shí)，難治性癲癇持續(xù)狀態(tài)患者的sNfL 水平較高。以上結(jié)果支持只有重復(fù)癲癇發(fā)作活動(dòng)才會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的觀點(diǎn)，可通過(guò)sNfL 水平來(lái)衡量。在癲癇持續(xù)狀態(tài)中，血-腦屏障破壞可能導(dǎo)致腦脊液NfL 向血液的釋放增加，使得sNfL 在這種情況下成為有效的神經(jīng)軸索損傷的生物標(biāo)志物。

4 展望

癲癇是神經(jīng)病學(xué)面臨的另一個(gè)重大挑戰(zhàn)，需要對(duì)癲癇及其生物標(biāo)志物進(jìn)行積極探索。NfL 可能是未來(lái)關(guān)于癲癇，尤其是難治性癲癇，早期識(shí)別、診斷及治療結(jié)果研究中最方便、最有希望的生物標(biāo)志物之一。此外，作為神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病敏感的生物學(xué)指標(biāo)之一，NfL 的臨界值仍需進(jìn)一步明確，且神經(jīng)元受損后釋放NfL 的具體過(guò)程目前尚未完全闡明，同時(shí)關(guān)于釋放NfL 的具體始動(dòng)因素、關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)的相關(guān)研究也相對(duì)較少。因此，未來(lái)仍需進(jìn)一步明確NfL 在癲癇疾病中的具體作用及機(jī)制，為該疾病的早期診斷、治療及新藥物的研發(fā)提供依據(jù)。