基于真實世界與靶點網(wǎng)絡聚類的茵梔黃顆粒治療黃疸的聯(lián)合用藥方案及分子機制分析

崔 鑫，張 成，席俊羽，謝瑀婷，劉 毅*，謝雁鳴*

基于真實世界與靶點網(wǎng)絡聚類的茵梔黃顆粒治療黃疸的聯(lián)合用藥方案及分子機制分析

崔 鑫1，張 成1，席俊羽1，謝瑀婷2，劉 毅1*，謝雁鳴1*

1. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700 2. 中國人民大學統(tǒng)計學院，北京 100872

挖掘茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用藥物方案的臨床應用規(guī)律，為探索臨床不同診療思路、用藥經(jīng)驗和提高中醫(yī)藥臨床證據(jù)的循證等級提供參考?；谌珖?9家醫(yī)院信息管理系統(tǒng)（hospital information system，HIS）黃疸患者的用藥數(shù)據(jù)，運用Tabu搜索算法，對真實世界茵梔黃顆粒治療黃疸的聯(lián)合用藥情況進行回顧性分析。同時，采用靶點網(wǎng)絡分析核心聯(lián)合用藥方案的分子網(wǎng)絡機制，并通過分子對接技術對其作用機制進行驗證。根據(jù)Tabu搜索算法聚類分析的結果，結合肝病相關指南和文獻，識別出3種茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用藥物方案：（1）針對藥物性肝損傷導致的黃疸，可以聯(lián)用谷胱甘肽；（2）針對膽汁淤積導致的黃疸，可以聯(lián)用亮菌甲素；（3）針對病毒性肝炎導致的黃疸，可以聯(lián)用雙環(huán)醇。3種方案的分子網(wǎng)絡機制均具有多成分、多靶點、多通路的特點，茵梔黃聯(lián)用谷胱甘肽治療黃疸的分子網(wǎng)絡機制主要與機體的炎癥免疫、Toll樣受體信號通路傳導、谷胱甘肽代謝通路和細胞死亡負調(diào)控的生物過程有關；茵梔黃聯(lián)用亮菌甲素治療黃疸的分子網(wǎng)絡機制主要與動脈粥樣硬化、膽汁分泌等關鍵通路有關；茵梔黃聯(lián)用雙環(huán)醇治療黃疸的分子網(wǎng)絡機制主要與上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路和癌癥相關的信號通路有關。數(shù)據(jù)挖掘得出的茵梔黃顆粒核心聯(lián)合用藥方案，基本符合相關指南及診療規(guī)范，并對其作用機制進行了探索，為優(yōu)化臨床聯(lián)合用藥、合理用藥提供了一定的指導和參考。建議臨床實際應用過程中，根據(jù)黃疸的疾病進展情況，合理評估臨床聯(lián)合用藥方案的療效及安全性，注意用藥配伍禁忌。

茵梔黃顆粒；黃疸；真實世界研究；聯(lián)合用藥；谷胱甘肽；亮菌甲素；雙環(huán)醇；黃芩苷；梔子苷；羥基乙酮；綠原酸

黃疸是由于人體內(nèi)膽紅素過量聚積所致，臨床以鞏膜、黏膜、皮膚黃染為主要表現(xiàn)[1]。黃疸多見于新生兒患者，嚴重的新生兒黃疸發(fā)病率和死亡率均較高[2]，印度新生兒黃疸的死亡率高達30.8%[3]。嚴重的新生兒黃疸是導致患兒長期神經(jīng)認知功能障礙、腦癱、耳聾、學習困難等后遺癥的主要原因，給全球帶來了沉重的健康和經(jīng)濟負擔[4]。黃疸可由肝炎、肝硬化、肝癌、溶血性貧血等多種肝臟疾病引起[5]。目前成人黃疸的治療尚無廣泛認可的臨床指南，一般以保肝降酶退黃為基本治則，同時針對不同病因進行對癥治療[6]。對于新生兒黃疸的治療，英國國家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化研究所于2014年6月發(fā)布了相關臨床指南，明確指出藍光照射是治療新生兒黃疸的安全有效療法；同時該指南還提出，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中推薦使用中藥茵陳治療新生兒黃疸[7]。

茵梔黃顆粒來源于《傷寒論》的茵陳蒿湯，是中醫(yī)藥治療黃疸的代表性方劑，由茵陳、梔子、黃芩、金銀花四味中藥的提取物組成，具有利濕退黃、清熱解毒的功效[8]。臨床上主要用于治療黃疸和急、慢性肝炎[9]。研究表明茵梔黃顆粒能夠降低血清膽紅素水平[10]，并保護肝細胞，且目前未見不良事件/ 反應報道[11]，臨床有效性、安全性較好。盡管茵梔黃顆粒在治療黃疸方面有著獨特的優(yōu)勢，但其優(yōu)效的臨床聯(lián)合用藥方案尚不明確。本研究運用Tabu搜索算法對茵梔黃顆粒治療黃疸的優(yōu)效聯(lián)合用藥方案進行數(shù)據(jù)挖掘，分析總結治療黃疸的核心藥物聯(lián)合茵梔黃顆粒的臨床應用規(guī)律。同時，本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法探索優(yōu)效聯(lián)合用藥方案的分子網(wǎng)絡機制，并通過分子對接對其作用機制進行初步驗證。以期為探索臨床不同診療思路、用藥經(jīng)驗，提高中醫(yī)藥臨床證據(jù)的循證等級提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究臨床聯(lián)合用藥數(shù)據(jù)由中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所建立的多維數(shù)據(jù)倉庫提供[12]，共提取了全國39家醫(yī)院信息管理系統(tǒng)（hospital information system，HIS）的1840例黃疸用藥患者的數(shù)據(jù)信息。

聯(lián)合用藥方案的分子網(wǎng)絡機制分析中的藥物成分及其靶點來源于《中國藥典》2020年版、TCMSP數(shù)據(jù)庫、Drug Bank數(shù)據(jù)庫、SEA和Swiss Target Prediction平臺；黃疸相關的疾病靶點來源于OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡數(shù)據(jù)來源STRING數(shù)據(jù)庫。富集分析的生物過程和關鍵通路來源于g:Profiler和Matescape平臺。分子對接驗證的三維分子結構來源于ZINC及PubChem數(shù)據(jù)庫。

1.2 納入和排除標準

將符合以下標準的患者定義為茵梔黃顆粒治療黃疸的有效人群：（1）符合《診斷學》第9版[13]中關于黃疸的診斷標準：患者血清總膽紅素（total bilirubin，TBil）＞17.1 μmol/L（1.0 mg/dL）；（2）患者在住院期間使用了茵梔黃顆粒；（3）患者的治療結局為治愈或好轉(zhuǎn)。

以下藥物不納入分析：（1）各類溶媒，如葡萄糖、氯化鈉等；（2）各類維生素（如有研究證據(jù)表明某種維生素對黃疸治療有效，也可納入分析）；（3）未在茵梔黃顆粒用藥期間聯(lián)合使用的藥物。

1.3 數(shù)據(jù)標準化

由于各臨床醫(yī)院信息系統(tǒng)的設置及編碼規(guī)則存在差異，因此本研究運用數(shù)據(jù)倉庫技術（extract-transform-load，ETL）將多元異構數(shù)據(jù)進行整合，對提取的患者個人信息數(shù)據(jù)進行離散化處理，進而構建統(tǒng)一的標準化數(shù)據(jù)倉庫[14]。

數(shù)據(jù)標準化根據(jù)統(tǒng)一制定的規(guī)則進行，疾病的中醫(yī)診斷、證候根據(jù)《中華人民共和國國家標準·中醫(yī)臨床診療術語》來統(tǒng)一[15]；疾病的西醫(yī)診斷按照《內(nèi)科學》第8版教材[16]和WHO制定的ICD-10編碼標準[17]進行規(guī)范?；瘜W藥按照WHO制定的解剖-治療-化學的藥物分類系統(tǒng)（Anatomical Therapeutic Chemical，ATC）來統(tǒng)一編碼標化[18]，中藥名稱的標準化主要參考《國家基本藥物目錄》[19]、《國家醫(yī)保目錄》[20]和《中國藥典》2020年版[21]。

1.4 篩選聯(lián)合用藥的復雜網(wǎng)絡構建方法

本研究選用Tabu搜索算法對標準化數(shù)據(jù)倉庫構建的復雜信息網(wǎng)絡進行結構關系的劃分，將最終形成的指標群數(shù)提前設定，通過最終形成的指標群體的數(shù)集大小來判斷指標群劃分，因此能夠真實反映各指標之間客觀存在的網(wǎng)絡結構關系[12]。通過Tabu搜索算法分析真實世界臨床聯(lián)合用藥的多層次結構關系，進而探索挖掘黃疸臨床優(yōu)效干預方案的藥物組成規(guī)律[22]。

1.5 分子網(wǎng)絡機制分析及驗證方法

本研究首先從《中國藥典》2020年版分別收集核心聯(lián)合用藥方案中藥物的有效成分，并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得中藥有效成分對應的靶點，通過Drug Bank數(shù)據(jù)庫獲得化學藥對應的靶點；通過OMIM數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得黃疸相關的靶點數(shù)據(jù)。然后，分別將核心聯(lián)合用藥方案干預黃疸的靶點映射至STRING數(shù)據(jù)庫獲得PPI網(wǎng)絡，并導入Cytoscape軟件進行拓撲屬性分析。最后，通過g:Profiler平臺和Matescape平臺分析3種聯(lián)合用藥方案作用于黃疸的生物過程和關鍵信號通路。分子對接驗證通過檢索ZINC及PubChem數(shù)據(jù)庫，分別獲取核心聯(lián)用藥物方案的有效成分和其關鍵靶點的三維分子結構，利用軟件對其兩兩進行分子對接驗證，并將其中對接較好的組合進行可視化展示。

1.6 統(tǒng)計分析

本研究應用SAS軟件（版本9.4，SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）對納入患者的一般特征進行描述性分析。通過UCINET6軟件運行Tabu算法。運用Cytoscape軟件（V3.7.2）進行分子網(wǎng)絡機制分析；PPI分析物種設置為人，PPI網(wǎng)絡置信度設置為0.4，度（degree）值設置為大于中位數(shù)，進行關鍵靶點篩選；基因本體論（gene ontology，GO）生物過程和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析按照≤0.01進行關鍵通路篩選。運用Autodock Vina軟件進行分子對接驗證，并使用Pymol進行可視化。

2 結果

2.1 納入人群和藥物統(tǒng)計

在數(shù)據(jù)集成倉庫中，共提取出黃疸的用藥人群1840例，其中治療結局為好轉(zhuǎn)或治愈人群共1557例。符合納排標準的聯(lián)用藥物共90種，包含中藥58種，化學藥32種。

2.2 藥物使用頻次統(tǒng)計

本研究篩選納入了使用頻次在10次及以上的藥物，共計53種。藥物使用頻次見表1，可見化學藥谷胱甘肽、甘草酸、抗壞血酸和中藥苦黃注射液、柴胡注射液、茵梔黃注射液使用頻次較高，是治療黃疸的常用藥物。

2.3 核心有效方案識別

2.3.1 藥物子群劃分 經(jīng)過測度分析，由53種中西藥構成的復雜網(wǎng)絡共劃分為12個子群，具體劃分結果見表2，其中方案組成中的藥物編號對應藥物使用頻次統(tǒng)計表中的編號。

根據(jù)整體網(wǎng)絡密度、子網(wǎng)絡密度矩陣及關系矩陣，可以得出2、5、7、8、11、12的子群結構之間有較緊密的結構聯(lián)系，其中子群5、7與其他群的連邊數(shù)最多，表明它們與其他藥物子群聯(lián)系更為緊密，詳見圖1。

2.3.2 藥物子網(wǎng)絡構建 藥物子群展開網(wǎng)絡圖見圖2，其中藥物1-化學藥.谷胱甘肽、6-化學藥.亮菌甲素、15-化學藥.雙環(huán)醇與其他藥物的聯(lián)系較為緊密，是治療黃疸的核心藥物。

通過進一步結合肝炎等與黃疸密切相關的疾病診療指南、現(xiàn)有文獻報道[23-27]，以及這3種藥品的說明書，可以歸納得出茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用優(yōu)效方案：（1）針對藥物性肝損傷導致的黃疸，可以聯(lián)用谷胱甘肽；（2）針對膽汁淤積導致的黃疸，可以聯(lián)用亮菌甲素；（3）針對病毒性肝炎導致的黃疸，可以聯(lián)用雙環(huán)醇。

表1 茵梔黃顆粒治療黃疸聯(lián)合藥物使用頻次

表2 中西藥物子群

圖1 藥物子群劃分網(wǎng)絡圖

2.4 分子網(wǎng)絡機制分析

2.4.1 藥物靶點收集 通過《中國藥典》2020年版獲得了茵梔黃顆粒組方中茵陳提取物、梔子提取物、黃芩提取物、金銀花提取物的有效成分，分別為羥基苯乙酮、梔子苷、黃芩苷、綠原酸，并通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查找這4種有效成分對應的靶點。

圖2 藥物子網(wǎng)絡展開圖

經(jīng)查找共收集到梔子苷對應靶點8個，分別是碳酸酐酶II（carbonic anhydrase II，CA2）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白（neuromodulin，GAP43）、膜相關磷脂酶B1（membrane-associated phospholipase B1，PLB1）、胰高血糖素（glucagon，GCG）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu-1（glutathione S-transferase Mu 1，GSTM1）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶Mu-2（glutathione S-transferase Mu 2，GSTM2）；黃芩苷對應靶點2個，分別是凝血因子Xa（coagulation factor Xa，F(xiàn)10）和DNA拓撲異構酶II（DNA topoisomerase II，TOP2A）。

由于羥基苯乙酮和綠原酸在TCMSP中未查詢到對應的靶點，因此本研究分別運用SEA和Swiss Target Prediction網(wǎng)頁分析工具進行靶點預測，SEA平臺預測結果以＜0.05篩選具有統(tǒng)計學意義的靶點，Swiss Target Prediction平臺預測結果以概率值（probability）大于0為標準，篩選可能成為目標藥物成分靶點的結果，然后將2個平臺的預測結果合并后去重，最終得到羥基苯乙酮對應靶點101個，綠原酸對應靶點64個。

在DrugBank數(shù)據(jù)庫中分別檢索后得到谷胱甘肽藥物靶點41個，刪除1個來源不確定是否為人類的靶點（glutathione peroxidase），最終獲得40個靶點。由于亮菌甲素和雙環(huán)醇在數(shù)據(jù)庫中未檢索到藥物靶點，因此本研究分別運用SEA和Swiss Target Prediction平臺進行預測，最終獲得亮菌甲素藥物靶點40個，雙環(huán)醇藥物靶點42個。以本研究中的用藥方案、藥物、成分、疾病、靶點為節(jié)點，其相互關系為邊，構建“用藥方案-藥物-成分-疾病-靶點”圖，見圖3。

2.4.2 疾病相關靶點收集 在OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到黃疸相關靶點140個。GeneCards數(shù)據(jù)庫初步檢索得到黃疸相關靶點3400個，通過2次篩選相關性評分（relevance score）不小于中位數(shù)的靶點，篩選獲得黃疸相關靶點699個。將2個數(shù)據(jù)庫的靶點合并后去重，最終獲得652個黃疸的相關靶點。

2.4.3 藥物干預疾病的靶點 分別將3種聯(lián)合用藥方案的藥物靶點與黃疸的相關靶點取交集，獲得茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽（聯(lián)合用藥方案1）干預黃疸靶點25個，茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素（聯(lián)合用藥方案2）干預黃疸靶點22個，茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇（聯(lián)合用藥方案3）干預黃疸靶點25個，見表3～5。

2.4.4 PPI網(wǎng)絡構建與拓撲屬性分析 分別將上述3種聯(lián)合用藥方案干預黃疸的靶點映射至STRING數(shù)據(jù)庫（檢索時間：2022年6月12日），獲得PPI網(wǎng)絡，并導入Cytoscape軟件進行拓撲屬性分析。茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預黃疸的PPI網(wǎng)絡由24個節(jié)點和102條邊構成，其關鍵靶點為HMOX1、白蛋白（albumin，ALB）、半胱天冬酶-3（Caspase-3，CASP3）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2），見圖4-a；茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預黃疸的分子網(wǎng)絡由22個節(jié)點和69條邊構成，其關鍵靶點為TLR2、CASP3、ALB、HMOX1、中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，ELANE），見圖4-b；茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預黃疸的分子網(wǎng)絡由23個節(jié)點和109條邊構成，其關鍵靶點為TLR2、ALB、CASP3、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（proto-oncogene tyrosine-protein kinase，SRC）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），見圖4-c。

圖3 “用藥方案-藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖

表3 茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預黃疸的靶點

表4 茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預黃疸的靶點

表5 茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預黃疸的靶點

2.4.5 GO生物過程富集分析 運用g:Profiler平臺分別對3種聯(lián)合用藥方案干預黃疸的交集靶點進行GO生物過程富集分析，得到茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預黃疸的GO生物過程 25條，茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預黃疸的GO生物過程15條，茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預黃疸的GO生物過程30條，富集結果見圖5-a～c?？梢姡?種聯(lián)合用藥方案干預黃疸均主要參與機體的炎癥免疫、Toll樣受體信號通路傳導和細胞死亡負調(diào)控的生物過程。

2.4.6 KEGG信號通路富集分析 采用Matescape平臺對3種治療黃疸的聯(lián)合用藥方案的KEGG信號通路進行富集分析，設置value cutoff為0.01，并繪制氣泡圖，見圖6～8。如圖顯示，茵梔黃顆粒聯(lián)用谷胱甘肽方案參與的關鍵信號通路有6條，茵梔黃顆粒聯(lián)用亮菌甲素、雙環(huán)醇的關鍵信號通路均各有5條；同時，3種干預方案的共有關鍵信號通路均與動脈粥樣硬化、膽汁分泌有關。此外，聯(lián)用谷胱甘肽的用藥方案還包含谷胱甘肽代謝通路，聯(lián)用雙環(huán)醇的用藥方案還與上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路有關。

2.5 分子對接驗證

通過檢索ZINC及PubChem數(shù)據(jù)庫，分別獲取3種干預方案的有效成分黃芩苷、梔子苷、羥基苯乙酮、綠原酸及化學藥谷胱甘肽、亮甲菌素、雙環(huán)醇與關鍵靶點HMOX1、ALB、CASP3、MMP9、TLR2、ELANE、SRC、EGFR的三維分子結構，利用Autodock Vina軟件進行兩兩分子對接驗證（表6），并將其中對接較好的組合使用Pymol進行可視化展示（圖9、10）。由表6可知，除羥基苯乙酮和SRC組合之外，其他組合均可形成穩(wěn)定結構（結合能＜?5.0 kcal/mol，1 kcal＝4.186 kJ）。由圖9、10可知，分子對接結果最好的成分依次是黃芩苷＞綠原酸＞梔子苷＞雙環(huán)醇＞亮甲菌素＞谷胱甘肽＞羥基苯乙酮，對接最好的靶點依次是ALB＞MMP9＞CASP3＞HMOX1＝EGFR＞ELANE＞TLR2＞SRC，對接最好的組合是ALB與黃芩苷的組合，其主要通過氫鍵和疏水口袋結合。

a-茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽 b-茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素 c-茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇 紅色圓形節(jié)點表示度值（degree）排名前5位的節(jié)點，即PPI網(wǎng)絡中的核心靶點；灰色線條代表各靶點之間的相互作用關系，線條粗細表示互作關系的綜合得分（combined score）大小

3 討論

目前國內(nèi)外尚無公認的成人黃疸治療指南，對于黃疸的診治多從病因角度著手，常與肝病緊密聯(lián)系，其臨床優(yōu)效用藥方案仍在不斷探索中。茵梔黃顆粒作為臨床常用治療黃疸的中成藥，常與化學藥聯(lián)合使用。因此，在多中心、大樣本的電子病歷數(shù)據(jù)基礎之上，通過挖掘臨床常用的茵梔黃顆粒優(yōu)效聯(lián)合用藥方案，可以為黃疸的治療提供臨床實證經(jīng)驗。本研究運用Tabu搜索算法進行聚類分析，并與現(xiàn)有肝病相關指南和文獻對比，識別出3種茵梔黃顆粒治療黃疸的核心聯(lián)用藥物方案：（1）針對藥物性肝損傷導致的黃疸，可以聯(lián)用谷胱甘肽；（2）針對膽汁淤積導致的黃疸，可以聯(lián)用亮菌甲素；（3）針對病毒性肝炎導致的黃疸，可以聯(lián)用雙環(huán)醇。

同時，本研究進一步運用網(wǎng)絡藥理學方法對上述3種核心聯(lián)用藥物方案的分子網(wǎng)絡機制進行了初步探索。藥物性肝損傷臨床可表現(xiàn)為無癥狀的肝生化指標升高、肝細胞性黃疸、肝功能衰竭、慢性肝炎等。當出現(xiàn)肝細胞性黃疸時，藥物性肝損傷的死亡率高達10%[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，茵梔黃顆粒聯(lián)用谷胱甘肽治療藥物性肝損傷可能通過干預核心靶點HMOX1、ALB、CASP3、MMP9、TLR2發(fā)揮作用，參與氧化應激、核受體元通路（nuclear receptors meta-pathway，NRM）、谷胱甘肽代謝等關鍵通路。因此，該方案對黃疸的干預作用主要與機體的炎癥免疫、Toll樣受體信號通路傳導、谷胱甘肽代謝通路和細胞死亡負調(diào)控的生物過程有關。其中，HMOX1具有抗氧化作用，通過與抗氧化劑反應元件（anti-oxidant response element，ARE）結合而誘導基因表達[28]；CASP3和MMP9是中成藥抗藥物性肝損傷的潛在核心靶點，可能與肝再生過程的正調(diào)控密切相關[29]。

膽汁淤積的標志性指標是堿性磷酸酶升高。在黃疸患者中，堿性磷酸酶升高可能代表彌漫性肝細胞功能障礙或嚴重的膽管阻塞，從而阻礙了足夠的膽汁流動[30]。本研究發(fā)現(xiàn)茵梔黃顆粒聯(lián)用亮菌甲素治療膽汁淤積性黃疸，可能通過干預核心靶點HMOX1、CASP3、ALB、TLR2調(diào)控流體切應力與動脈粥樣硬化、膽汁分泌等關鍵通路發(fā)揮作用，表明動脈粥樣硬化、膽汁分泌異?？赡芘c梗阻性黃疸的發(fā)病有一定關聯(lián)。有研究證明，患有嚴重動脈粥樣硬化的患者可能出現(xiàn)多個內(nèi)臟假性動脈瘤，包括肝動脈假性動脈瘤出血成大血腫，從而導致梗阻性黃疸和急性胰腺炎[31]。

a-茵梔黃顆粒聯(lián)合谷胱甘肽干預黃疸的GO分析氣泡圖 b-茵梔黃顆粒聯(lián)合亮菌甲素干預黃疸的GO分析氣泡圖 c-茵梔黃顆粒聯(lián)合雙環(huán)醇干預黃疸的GO分析氣泡圖；氣泡顏色由淺到深表示P值由大到小，顏色越深顯著富集的程度越大；氣泡大小表示富集的基因數(shù)量，氣泡越大，富集的基因數(shù)量越多

圖6 茵梔黃顆粒聯(lián)用谷胱甘肽用藥方案的關鍵信號通路

圖7 茵梔黃顆粒聯(lián)用亮菌甲素用藥方案的關鍵信號通路

圖8 茵梔黃顆粒聯(lián)用雙環(huán)醇用藥方案的關鍵信號通路

針對病毒性肝炎所致黃疸，茵梔黃顆粒聯(lián)用雙環(huán)醇可能主要通過干預SRC、EGFR等核心靶點調(diào)控上皮細胞信號轉(zhuǎn)導通路和癌癥相關的信號通路而發(fā)揮干預作用。從病毒性肝炎到肝硬化再到肝癌的不同階段，患者在臨床上均可見黃疸。EGFR編碼的酪氨酸蛋白激酶在肝細胞中充當丙型肝炎病毒的受體并促進其細胞進入[32]；SRC編碼原癌基因酪氨酸蛋白激酶是調(diào)節(jié)肝癌發(fā)病的重要基因，進而通過調(diào)控關鍵通路對黃疸的病理機制產(chǎn)生影響[33]。

表6 茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案的有效成分和關鍵靶點的分子對接結合能

此外，本研究還通過分子對接對3種核心干預方案的分子網(wǎng)絡機制進行了初步驗證。結果顯示，3種干預方案的有效成分和關鍵靶點構成的三維分子結構中，對接最好的組合是ALB與黃芩苷的組合。研究顯示，ALB編碼人體白蛋白，有助于提升氧結合活性、膽紅素結合活性，還參與細胞對饑餓的反應，維持線粒體位置和凋亡過程的負調(diào)節(jié)[34]；同時，其與肝膽系統(tǒng)癌癥有關，為肝病的生物標志物。黃芩苷是黃芩的活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[35]，因此黃芩苷可以對（病毒性）肝炎和黃疸有直接的干預作用。綜上，通過3種茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案共有的活性成分黃芩苷調(diào)控分子對接結果最佳的ALB靶點，可有效將膽紅素從循環(huán)白蛋白中置換出來，使循環(huán)中的游離膽紅素水平升高，緩解黃疸的臨床癥狀。

圖9 茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案的有效成分與關鍵靶點的分子對接結合能聚類熱圖

綠色小分子為黃芩苷，藍色大分子為ALB靶點，黃色虛線為氫鍵

在方法學方面，本研究創(chuàng)新性地將真實世界HIS系統(tǒng)數(shù)據(jù)采用Tabu搜索算法進行聚類分析，測度子群結構關系，同時融合靶點網(wǎng)絡與分子對接對茵梔黃顆粒干預黃疸的3種干預方案的分子網(wǎng)絡機制進行了分析及初步驗證。一方面，與其他算法相比，Tabu搜索算法的優(yōu)勢在于可以通過迭代出的密度矩陣測度指標群之間的關系，并且能應用合理的參數(shù)設置，對指標節(jié)點進行若干次的劃分，完成指標集群和群間關系測度的數(shù)據(jù)整合，避免劃分過度或劃分不足導致的指標節(jié)點分配不均衡的問題。另一方面，鑒于中醫(yī)藥臨床數(shù)據(jù)的“混雜性”“整體性”和“相關關系性”，在數(shù)據(jù)挖掘的核心聯(lián)合用藥方案基礎上，使用靶點網(wǎng)絡和分子對接方法對3種聯(lián)合用藥方案的有效性作用機制進行分析和初步驗證，可以更好地支撐和佐證茵梔黃顆粒臨床診療黃疸的聯(lián)合用藥規(guī)律，進而探索新的研究方向并為臨床實際問題的解決提供指導和參考。

在診療用藥方面，本研究運用Tabu算法聚類得出的子群結構關系，結合現(xiàn)有相關指南、文獻報道將黃疸劃分為3類，并歸納出對應的精準茵梔黃顆粒聯(lián)合用藥方案，針對不同類型的黃疸進行傾向性、個體化治療，符合中醫(yī)“方對證，藥對癥”原創(chuàng)思維[36]和“態(tài)靶辨證”[37]，不僅能達到更好的治療效果，也為臨床精準用藥方案的制定提供參考，同時符合中醫(yī)發(fā)展的歷史需求。此外，臨床聯(lián)合用藥還應關注其安全性，重視聯(lián)用藥物的劑量和頻次。因此，臨床實際應用過程中，應根據(jù)患者的疾病進展情況，合理評估臨床聯(lián)合用藥方案的療效及安全性，注意用藥配伍禁忌。建議未來研究者基于本研究進一步開展高質(zhì)量的真實世界臨床研究，在科學合理的頂層設計下獲得更高級別的循證證據(jù)。

本研究是基于真實世界HIS數(shù)據(jù)庫的回顧性研究，運用數(shù)據(jù)挖掘技術獲得的核心聯(lián)用藥物方案的有效性僅供臨床用藥參考。受限于回顧性研究的設計類型及HIS系統(tǒng)的樣本量，結果仍需進一步前瞻性多中心、大樣本的臨床研究加以驗證。同時，本研究的分子機制結果可能由于靶點網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫的權重分配和混雜性存在一定的偏倚，因此結果的查全性和準確性尚需指紋圖譜研究、基礎實驗或生物樣本的高通量測序等方法進一步驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 牟春筍. 新生兒黃疸陰陽屬性影響因素及Bayes概率模型初步構建 [D]. 濟南: 山東中醫(yī)藥大學, 2014.

[2] Bhutani V K, Zipursky A, Blencowe H,. Neonatal hyperbilirubinemia and Rhesus disease of the newborn: Incidence and impairment estimates for 2010 at regional and global levels [J]., 2013, 74(Suppl 1): 86-100.

[3] Slusher T M, Zamora T G, Appiah D,. Burden of severe neonatal jaundice: A systematic review and meta-analysis [J]., 2017, 1(1): e000105.

[4] Mwaniki M K, Atieno M, Lawn J E,. Long-term neurodevelopmental outcomes after intrauterine and neonatal insults: A systematic review [J]., 2012, 379(9814): 445-452.

[5] Amiri M S, Joharchi M R, Taghavizadehyazdi M E. Ethno-medicinal plants used to cure jaundice by traditional healers of Mashhad, Iran [J]., 2014, 13(1): 157-162.

[6] Zhang C, Zhang L D, Lyu J,. Effects of Yinzhihuang granules on serum liver enzymes in jaundice patients: A real-world study based on HIS data [J]., 2020, 2020: 3843752.

[7] Rennie J, Burman-Roy S, Murphy M S,. Neonatal jaundice: Summary of NICE guidance [J]., 2010, 340: c2409.

[8] 杜娟, 朱小琴. 茵梔黃顆粒治療新生兒病理性黃疸 [J]. 吉林中醫(yī)藥, 2018, 38(9): 1046-1049.

[9] 黃橫, 余宇龍, 李紹錦, 等. 不同劑量茵梔黃顆粒治療早期新生兒高膽紅素血癥的效果觀察 [J]. 現(xiàn)代實用醫(yī)學, 2018, 30(7): 908-910.

[10] Zhang C, Zhang L D, Lyu J,. Effects of Yinzhihuang granules on serum liver enzymes in jaundice patients: A real-world study based on HIS data [J]., 2020, 2020: 3843752.

[11] 趙丹丹, 高翔羽. 茵梔黃在新生兒高膽紅素血癥中的應用評價 [J]. 中華針灸電子雜志, 2016, 5(3): 124-129.

[12] 郜明月, 謝雁鳴, 張寅, 等. 基于電子醫(yī)療數(shù)據(jù)的復方苦參注射液治療適應癥(惡性腫瘤) 真實世界臨床應用特征研究[J]. 中草藥, 2018, 49(13): 3143-3147.

[13] 萬學紅, 盧雪峰. 診斷學 [M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013: 36-39.

[14] 盛蕾, 謝雁鳴, 王志飛, 等. 喜炎平注射液治療病毒性腦炎用藥方案的真實世界研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(10): 3125-3133.

[15] 國家中醫(yī)藥管理局, 國家衛(wèi)生健康委員會. 關于印發(fā)《中醫(yī)病證分類與代碼》和《中醫(yī)臨床診療術語》的通知[EB/OL]. (2022-08-20) [2020-11-16]. http://www.gov. cn/zhengce/zhengceku/2020-11/24/content_5563703.htm.

[16] 葛均波. 內(nèi)科學[M]. 第8版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2013: 422-424.

[17] 侯麗, 李丹亞, 李軍蓮, 等. ICD系列編碼規(guī)則及結構體系剖析 [J]. 醫(yī)學信息學雜志, 2012, 33(5): 38-43.

[18] 世界衛(wèi)生組織藥物統(tǒng)計中心. 《藥品的解剖學治療學化學分類索引及規(guī)定日劑量》[M]. 北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社, 2003: 122-123.

[19] 國家衛(wèi)生健康委員會. 《國家基本藥物目錄-2018年版》[EB/OL]. (2022-08-20) [2018-10-25]. http://www. nhc. gov.cn/wjw/jbywml/list.shtml.

[20] 國家醫(yī)保局, 人力資源社會保障部. 關于印發(fā)《國家基本醫(yī)療保險、工傷保險和生育保險藥品目錄(2020年)》的通知[EB/OL]. (2022-08-20) [2020-12-28]. http:// www.nhsa.gov.cn/art/2020/12/28/art_37_4220.html.

[21] 中國藥典 [S]. 一部. 2020.

[22] 程豪, 易丹輝, 牟宗毅. 基于社會網(wǎng)絡分析的指標群劃分及群間關系研究 [J]. 世界科學技術—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2018, 20(4): 505-513.

[23] 王宇明, 于樂成. 肝臟炎癥及其防治專家共識 [J]. 中國實用內(nèi)科雜志, 2014, 34(2): 152-162.

[24] 王錫欽. 亮菌甲素聯(lián)合茵梔黃治療膽汁瘀積型肝炎34例 [J]. 中國中西醫(yī)結合消化雜志, 2006, 14(4): 273-274.

[25] 謝雯, 于樂成. 雙環(huán)醇臨床應用專家共識: 2020版 [J]. 中華實驗和臨床感染病雜志: 電子版, 2020, 14(3): 177-185.

[26] 王英強, 申建軍, 孫玉梅. 口服雙環(huán)醇片及小柴胡湯加減治療急性乙型黃疸型肝炎50例分析 [J]. 山西醫(yī)藥雜志, 2008, 37(10): 944-945.

[27] 張振英. 雙環(huán)醇聯(lián)合腺苷蛋氨酸治療病毒性肝炎重度黃疸臨床觀察 [J]. 河南大學學報: 醫(yī)學版, 2008, 27(3): 55-56.

[28] Bereczki D Jr, Balla J, Bereczki D. Heme oxygenase-1: Clinical relevance in ischemic stroke [J]., 2018, 24(20): 2229-2235.

[29] Huang S J, Mu F, Li F,. Systematic elucidation of the potential mechanism of Erzhi Pill against drug-induced liver injury via network pharmacology approach [J]., 2020, 2020: 6219432.

[30] Gondal B, Aronsohn A. A systematic approach to patients with jaundice [J]., 2016, 33(4): 253-258.

[31] Saito A, Fayad N. An unusual cause of obstructive jaundice and acute pancreatitis: Visceral artery pseudoaneurysm [J]., 2021, 13(4): e14307.

[32] Lupberger J, Zeisel M B, Xiao F,. EGFR and EphA2 are host factors for hepatitis C virus entry and possible targets for antiviral therapy [J]., 2011, 17(5): 589-595.

[33] 王麗萍. CLDN6通過激活Src/STAT3信號通路促進肝癌細胞的遷移及侵襲 [D]. 長春: 吉林大學, 2022.

[34] National Center for Biotechnology Information. PubChem Gene Summary for Gene 213, ALB-albumin (human) [EB/OL]. [2022-08-19]. https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/gene/213.

[35] National Center for Biotechnology Information. PubChem Compound Summary for CID 64982, Baicalin [EB/OL]. [2022-08-19]. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ 64982.

[36] 王琦. 中醫(yī)原創(chuàng)思維模式研究 [J]. 世界中醫(yī)藥, 2013, 8(1): 1-4.

[37] 張莉莉, 仝小林, 趙林華, 等. 態(tài)靶結合辨治多囊卵巢綜合征高雄激素血癥 [J]. 世界中醫(yī)藥, 2021, 16(22): 3372-3375.

Combination medication regimen and molecular mechanism analysis of Yinzhihuang Granule in treatment of jaundice based on real world and target network clustering

CUI Xin1, ZHANG Cheng1, XI Jun-yu1, XIE Yu-ting2, LIU Yi1, XIE Yan-ming1

1. Institute of Clinical Basic Medicine of Traditional Chinese Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. School of Statistics, Renmin University of China, Beijing 100872, China

To mine the clinical application rules of Yinzhihuang Granule (茵梔黃顆粒) combined with drug regimen in the treatment of jaundice, so as to provide reference for exploring different clinical diagnosis and treatment ideas, medication experience and improving the evidence-based level of clinical evidence of traditional Chinese medicine.Based on the medication data of jaundice patients from 39 hospital information system (HIS) in China, the Tabu search algorithm was used to retrospectively analyze the combination medication of Yinzhihuang Granule in the treatment of jaundice in the real world. At the same time, the molecular network mechanism of the core drug combination regimen was analyzed by the target network, and the mechanism was verified by molecular docking technology.According to the results of Tabu search algorithm cluster analysis, combined with liver disease related guidelines and literature, three core combined drug schemes for Yinzhihuang Granule in the treatment of jaundice were identified: (1) For jaundice caused by drug-induced liver injury, glutathione could be combined; (2) For jaundice caused by cholestasis, armillarisin A could be combined; (3) For jaundice caused by viral hepatitis, bicyclol could be combined. The molecular network mechanism of the three regimentsall had the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway. The molecular network mechanism of Yinzhihuang Granule combined with glutathione in the treatment of jaundice was mainly related to the body’s inflammation and immunity, Toll-like receptor signaling pathway, glutathione metabolism pathway and the biological process of negative regulation of cell death. The molecular network mechanism of Yinzhihuang Granule combined with armillarisin A in the treatment of jaundice was mainly related to key pathways such as atherosclerosis and bile secretion. The molecular network mechanism of Yinzhihuang Granule combined with bicyclol in the treatment of jaundice was mainly related to epithelial cell signal transduction pathway and cancer related signal pathway.The core drug combination regimen of Yinzhihuang Granule in this study basically conforms to the relevant guidelines and diagnosis and treatment norms, and its mechanism was explored, which provides certain guidance and reference for optimizing clinical drug combination and rational drug use. It is suggested that the efficacy and safety of clinical combined drug regimen should be reasonably evaluated according to the disease progression of jaundice in clinical practice, and the contraindications of medication compatibility should be paid attention.

Yinzhihuang Granule; jaundice; real world study; combination of drugs; glutathione; armillarisin A;bicyclol; baicalin; gardenin; hydroxy-ethyl ketone; chlorogenic acid

R285.64

A

0253 - 2670(2023)01 - 0210 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.023

2022-08-21

國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFC1707400）

崔 鑫，博士研究生，研究方向為中醫(yī)藥臨床評價方法學研究。E-mail: Xinroberttcm@hotmail.com

通信作者：劉 毅，醫(yī)師，研究方向為中醫(yī)藥臨床評價方法學研究。E-mail: 709473245@qq.com

謝雁鳴，首席研究員，研究方向為中醫(yī)藥臨床評價方法學研究。E-mail: ktzu2018@163.com

[責任編輯 潘明佳]