《傷寒論》治疫方用藥規(guī)律分析及核心藥對治療COVID-19的作用機制研究

湯少梁，貢 悅，馮雨莉，楊彤玲，張 蒙，申俊龍，成 彥

《傷寒論》治疫方用藥規(guī)律分析及核心藥對治療COVID-19的作用機制研究

湯少梁1，貢 悅2，馮雨莉2，楊彤玲2，張 蒙1，申俊龍2，成 彥3

1. 南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥文獻研究所，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學衛(wèi)生經(jīng)濟管理學院，江蘇 南京 210023 3. 南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院藥學部，江蘇 南京 210023

基于數(shù)據(jù)挖掘分析《傷寒論》疫病治療相關方劑的用藥規(guī)律，并利用網(wǎng)絡藥理學分析核心藥對“柴胡-黃芩”治療新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的作用機制。以期探討經(jīng)方治療疫病的當代價值。篩選《傷寒論》中治療疫病的經(jīng)方，利用R語言等軟件對頻次、性味歸經(jīng)、相關性、關聯(lián)規(guī)則等用藥規(guī)律進行分析，并運用網(wǎng)絡藥理學方法對用藥規(guī)律中核心藥對治療COVID-19的機制進行探究。用Cytoscape對篩選出的成分及靶點構建“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，將關鍵靶點導入String數(shù)據(jù)庫進行蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析，并在R語言中進行基因本體論（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。納入《傷寒論》中與疫病相關的方劑61首，共52味中藥。前20味高頻用藥中以溫性藥、辛味藥為主，多歸脾、肺經(jīng)，功效以補氣藥居多。“柴胡-黃芩”藥對相關性最強，5個類聚方為小柴胡湯加減、四逆湯、麻杏石甘湯加減、茯苓白術湯及大承氣湯。利用TCMSP和Genecards等網(wǎng)站獲取了“柴胡-黃芩”藥對的45個活性成分、189個作用靶點以及COVID-19的543個靶點，產(chǎn)生交集靶點64個，網(wǎng)絡分析結果顯示核心藥對防治COVID-19的主要成分可能為槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素、刺槐素等，核心靶點可能為VEGFA、TNF、IL-6、TP53、AKT1、CASP3、CXCL8、PTGS2等，通過GO和KEGG富集分析分別獲得1871個相關條目及164條通路?！秱摗分兄委熞卟《噙x用辛溫、歸脾、補氣之品，善用小柴胡湯加減、四逆湯、大承氣湯等。研究發(fā)現(xiàn)核心藥對“柴胡-黃芩”通過PTGS2、IL-6、TNF等多靶點在抗炎、免疫調(diào)節(jié)等方面防治COVID-19，《傷寒論》中疫病治療的古方對于當今疫病的防治可能有重要的借鑒價值。

疫病；傷寒論；數(shù)據(jù)挖掘；新型冠狀病毒肺炎；柴胡；黃芩；小柴胡湯；四逆湯；麻杏石甘湯；茯苓白術湯；大承氣湯

疫病是外感疫癘邪氣引起的一類急性烈性傳染性疾病的總稱[1]。中醫(yī)學認為瘟疫的病因是疫毒，與“非時暴寒”“非節(jié)之氣”密切相關，多認為是受到“時行乖戾之氣”，也就是帶有致病因素不正常的邪氣傷害所致。疫病流行時期，歷朝醫(yī)家積極探尋治療之法，逐步形成了理論相對完整、技術手段豐富的疫病防治體系[2]。東漢著名醫(yī)家醫(yī)圣——張仲景，是辨證論治方法的始祖與其臨床應用的奠基人，善治因寒而發(fā)熱的外感病，理法方藥齊備，后世研究者代不乏人。他編著的《傷寒雜病論》不僅為外感疾病治療提供方法，而且在中醫(yī)辨證論治方面提供了范例，是理論與臨床實踐結合的典范?！秱s病論》由王叔和收集整理，其中《傷寒論》是張仲景在辨證論治的基礎上總結前世醫(yī)家學術觀點及自身臨床經(jīng)驗的結合，對外感傷寒的發(fā)生、發(fā)展及傳變規(guī)律進行了全面分析[3]，后世譽之為“方書之祖”[4]?！秱摗窞橹嗅t(yī)藥治療疫病水平的提升做出了很大貢獻，也是研究早期發(fā)熱性傳染病的經(jīng)典文獻。回顧我國古代抗擊疫情的歷史，中醫(yī)藥抗疫歷史經(jīng)驗彌足珍貴[2]。縱觀現(xiàn)代醫(yī)學，中醫(yī)藥抗疫仍在發(fā)揮其獨特的作用。

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）是一種以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)的急性呼吸道傳染病，部分患者還有鼻塞、流涕、咽痛、嗅覺味覺減退或喪失等表現(xiàn)[5]。國家衛(wèi)健委等多級主管部門陸續(xù)出臺多版診療及預防方案[6-7]。其中明確指出了疑似病例與確診病例的診斷標準，主要是根據(jù)流行病學史來判斷，其臨床表現(xiàn)包括①發(fā)熱和（或）呼吸道癥狀等COVID-19相關臨床表現(xiàn)；②具有COVID-19影像學特征；③發(fā)病早期白細胞總數(shù)正?；蚪档?，淋巴細胞計數(shù)正?；驕p少。確診病例為在疑似病例中具備以下病原學或血清學證據(jù)之一者：①新型冠狀病毒核酸檢測陽性；②未接種新型冠狀病毒疫苗者新型冠狀病毒特異性免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）抗體和IgG抗體均為陽性[6-7]。隨著對COVID-19的認識深入和臨床經(jīng)驗的積累，中醫(yī)從抗疫的參與者逐漸成為主力軍[8]。中醫(yī)藥抗擊COVID-19疫情的典型代表“三藥三方”中的清肺排毒湯正是由小柴胡湯與麻杏石甘湯、射干麻黃湯、五苓散合方而成[9]，其中小柴胡湯也作為基本方被各地多部門推薦使用[8-9]，可見《傷寒論》中古方在當今新病治療中正發(fā)揮重要作用。

本研究篩選疫病相關篇幅收錄的方劑，運用R語言（4.1.2）、IBM SPSS statistics 22、IBM SPSS Modeler 18.0、Neo4j Desktop與Cytoscape 3.6.0等軟件進行數(shù)據(jù)挖掘，探索其用藥組方規(guī)律，以期為COVID-19預防與治療、新方發(fā)現(xiàn)與古方新用提供參考。

1 資料與方法

1.1 方藥來源

從《傷寒論》中治疫方劑可看出，此時期治疫病多以“清、下”之法為主，承氣湯、白虎湯、茵陳蒿湯等為其治疫代表方劑；以溫中解表、和解少陽為輔，理中湯、四逆湯、大小柴胡湯為其代表方劑。而《溫病學》中將瘟疫劃分為溫、燥、寒、濕等不同性質(zhì)，首要特征為強烈的傳染性，根據(jù)其病性和階段來辨證治療[10]?！秱摗分械膫疄閺V義的傷寒，即一切感受外邪所發(fā)疾病，不論寒熱。在《溫病學》中，狹義的傷寒定義為感受寒邪而發(fā)病，治法當以散寒解表為主?！秱摗分兄位魜y以溫中之法為主，代表方劑有四逆湯、桂枝湯等；治瘧以清濕熱為主，代表方劑為茵陳蒿湯[11]。而在《溫病學》中，治霍亂祛濕為首要治法，同時兼顧恢復脾胃升降之功能，代表方劑為蠶矢湯、藿香正氣散等；治瘧以祛邪截瘧為基本治則，代表方劑為達原飲。

本研究根據(jù)納入與排除標準對《傷寒論》中治療疫病的方劑進行篩選，最終共摘錄相關方劑61首。其中卷第五辨陽明病脈證并治第八方劑19首，卷第五辨少陽病脈證并治第九方劑1首，卷第七辨霍亂病脈證并治第十三方劑6首，卷第七辨陰陽易差后勞復病脈證并治第十四方劑5首，卷第八辨發(fā)汗后病脈證并治第十七方劑22首，卷第九辨可下病脈證并治第二十一方劑8首。記錄各處方的名稱、組成、劑量等基本信息。

1.2 納入標準及排除標準

1.2.1 納入標準 以中醫(yī)疫病診斷標準為基礎，即發(fā)病特點有強烈的傳染性、易發(fā)生流行，“起病急驟初起可見憎寒壯熱繼則但熱不寒，苔白如積粉舌質(zhì)紅絳或身大熱頭痛如劈吐瀉腹痛或吐衄發(fā)斑舌絳苔焦脈浮大而數(shù)等”。傳變迅速、癥狀復雜、病情兇險，可在短時間內(nèi)出現(xiàn)熱陷心包、傷絡動血、厥脫、尿閉等危重證候[11]。COVID-19以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，少數(shù)患者伴有鼻塞流涕、咽痛和腹瀉等癥狀，具有流行性、傳染性。病位主要在肺，可波及五臟，病機以“寒、濕、熱、毒、瘀、虛”為主，初期多寒濕，可入里化熱，后期多氣陰兩虛[12]。針對病因病機，各期治療均以祛邪解毒為核心，根據(jù)病程發(fā)展的階段性，治療時應將病情輕重、病程分期與中醫(yī)證候相結合。結合現(xiàn)代辨證思路，以“傷寒”“霍亂”“瘧”等為搜索詞在《傷寒論》中進行檢索，確定了陽明病、少陽病、霍亂、勞復等與疫病相關疾病，納入①符合疫病中醫(yī)診斷標準的治療方，且為有效的方劑；②主治中有明確的與疫病相關的癥狀描述；③具有齊全的方劑名稱。

1.2.2 排除標準 ①不可獨立使用的處方；②單味中藥處方；③方藥缺失或組方不明確的方劑。

1.3 數(shù)據(jù)錄入與處理

由雙人將符合上述條件的方藥錄入Excel 2016軟件，異議處理由具有中醫(yī)背景的第3人進行判斷。數(shù)據(jù)規(guī)范方面，將姜、棗、蔥等藥引納入到藥物組成，按照《中國藥典》2020年版[13]和《中藥學》2016年版教材[14]，對61首方藥的處方組成進行標準化處理。例如，將茵陳蒿統(tǒng)一規(guī)范為茵陳，商陸根統(tǒng)一規(guī)范為商陸，生梓白皮統(tǒng)一規(guī)范為梓白皮等。藥物性味等屬性同樣參考《中藥學》2016年教材[14]。數(shù)據(jù)錄入與規(guī)范化完成后，由第3人再次進行審核，確保數(shù)據(jù)規(guī)范的準確性。本研究分別運用R語言（4.1.2）、IBM SPSS statistics 22、IBM SPSS Modeler 18.0、Neo4j Desktop與Cytoscape 3.6.0將規(guī)范后的數(shù)據(jù)進行處理與分析。

1.4 《傷寒論》疫病治療用藥規(guī)律分析

在R語言處理階段，將規(guī)范化后的數(shù)據(jù)庫保存為csv文件，導入R軟件進行高頻中藥分析、關聯(lián)規(guī)則分析與可視化處理。在SPSS處理階段，運用Excel中數(shù)據(jù)透視表功能將規(guī)范后的中藥進行二分類變量處理，以方藥編號為行名，中藥名稱為列名，建立事務型數(shù)據(jù)庫。接著導入IBM SPSS statistics 22，進行系統(tǒng)聚類分析。在SPSS Modeler處理階段，將事務型數(shù)據(jù)庫直接導入軟件，對張仲景《傷寒論》中疫病治療前20味高頻中藥聚類進行可視化分析，繪制高頻中藥網(wǎng)絡圖。高頻中藥的性味歸經(jīng)分析皆在Excel 2016中完成。在Neo4j處理階段，將高頻中藥與其性味歸經(jīng)的關系用表格分別建立一一對應關系，并保存為csv文件，導入到Neo4j中，使用create語句建立結點，match語句建立關系，將其進行可視化。

1.5 網(wǎng)絡藥理學機制研究

結合“1.4”項中用藥規(guī)律分析結果得到的核心藥物，通過TCMSP[15]平臺（http://tcmspw.com/tcmsp. php）搜集核心藥對的化學成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18篩選各成分靶點，同時篩去無對應靶點的成分，將靶點導入Uniprot[16]數(shù)據(jù)庫（http://www.unitprot.org/）剔除非人類的靶點蛋白，確定中藥的活性成分及其對應基因靶點。在Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、Drugbank（https://www. drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫中以“novel coronavirus pneumonia”為關鍵詞檢索與COVID-19相關的基因，整理并去重之后得到COVID-19相關靶點數(shù)據(jù)集。將藥物有效成分的靶點與疾病相關靶點利用R Studio取交集靶點，獲得藥物疾病直接關聯(lián)的關鍵靶點。在Cytoscape V3.6.0中以疾病、核心藥物、有效成分和交集靶點為節(jié)點，邊為相互之間關系，構建“疾病-藥物-成分-靶點”關系網(wǎng)絡。將關鍵基因靶點輸入String[17]數(shù)據(jù)庫中，選中物種為“人”，評分條件＞0.90，獲取蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，并將得到的數(shù)據(jù)導入Cytoscape進行可視化。利用R Studio 4.1.2中的“clusterProfiler”包對疾病-藥物交集靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2 結果

2.1 《傷寒論》疫病防治用藥頻次統(tǒng)計

運用R語言對《傷寒論》中疫病防治61首相關方藥進行中藥頻次分析。共包含52味中藥，總使用頻次275次。如表1所示，使用頻次≥15的有4味，使用頻次介于10～15的有3味，使用頻次介于5～10的有15味，其余中藥的使用頻次均在5次以下，占全部中藥的57.69%。

表1 《傷寒論》中防治疫病中藥使用頻次

另外，使用頻次最高的前20味中藥（單味中藥在61首方劑中出現(xiàn)的頻率）分別是甘草（37次）、生姜（18次）、大棗（16次）、桂枝（16次）、大黃（14次）、人參（14次）、白芍（13次）、半夏（9次）、干姜（9次）、枳實（9次）、附子（8次）、茯苓（7次）、厚樸（7次）、黃芩（7次）、白術（6次）、柴胡（6次）、苦杏仁（6次）、芒硝（6次）、麻黃（5次）、石膏（5次），見圖1。

圖1 《傷寒論》中防治疫病前20味高頻中藥

2.2 《傷寒論》疫病防治高頻用藥的性味歸經(jīng)及功效知識圖譜

2.2.1 《傷寒論》疫病防治高頻用藥藥性知識圖譜 《傷寒論》中高頻中藥藥性包含平、溫、寒等7種，其中占比最高的為溫性藥物，為35%，其次為寒性藥物和微寒性藥物，占比均為15%。高頻中藥藥性頻次和占比如表2所示。

《傷寒論》高頻中藥藥性知識圖譜見圖2，其中綠色節(jié)點表示醫(yī)家即張仲景，灰色節(jié)點表示中藥實體即《傷寒論》疫病相關藥方中前20味高頻中藥，褐色節(jié)點表示藥性實體。連接中藥實體與藥性實體之間的邊表示這些藥相應的性。通過該圖譜，可以得知，高頻中藥中，藥性占比最高的溫性藥物有大棗、桂枝、白術、半夏、麻黃、生姜、厚樸。

2.2.2 《傷寒論》疫病防治高頻用藥藥味知識圖譜 《傷寒論》中高頻中藥藥味包含甘、辛、苦、微苦、酸、淡、咸7種，其中占比最高的為辛味藥物，為30.30%；其次為苦味藥物，占比27.27%；排名第3的為甘味藥物，占比24.24%。高頻中藥藥味頻次和占比如表2所示。

《傷寒論》高頻中藥藥味知識圖譜見圖3。其中綠色節(jié)點表示醫(yī)家即張仲景，灰色節(jié)點表示中藥實體即《傷寒論》疫病相關藥方中前20味高頻中藥，粉色節(jié)點表示藥味實體。連接中藥實體與藥味實體之間的邊表示這些藥相應的味。通過該圖譜，可以直觀地看到，高頻中藥中，藥味占比較高的有辛、苦、甘，占比最高的辛味中藥為生姜、桂枝、半夏、柴胡、麻黃等。

表2 高頻用藥性味歸經(jīng)占比情況

圖2 前20味高頻中藥藥性的知識圖譜

2.2.3 《傷寒論》疫病防治高頻用藥歸經(jīng)知識圖譜 《傷寒論》中高頻中藥歸經(jīng)包含心經(jīng)、肺經(jīng)、胃經(jīng)、脾經(jīng)等11種，其中脾經(jīng)占比最高，為21.88%，肺經(jīng)和胃經(jīng)占比也較高，小腸經(jīng)和心包經(jīng)占比最低。高頻中藥歸經(jīng)頻次和占比如表2所示。

《傷寒論》高頻中藥歸經(jīng)知識圖譜見圖4。其中綠色節(jié)點表示醫(yī)家即張仲景，灰色節(jié)點表示中藥實體即《傷寒論》疫病相關藥方中前20味高頻中藥，紫色節(jié)點表示歸經(jīng)實體。連接中藥實體與歸經(jīng)實體之間的邊表示這些藥相應的歸經(jīng)?？梢灾庇^地看到，高頻中藥中，歸經(jīng)為脾、肺、胃、心經(jīng)的中藥較多，歸經(jīng)為心包、小腸、膀胱、膽、肝、腎、大腸經(jīng)的中藥較少。

圖3 前20味高頻中藥藥味的知識圖譜

圖4 前20味高頻中藥歸經(jīng)的知識圖譜

2.2.4 《傷寒論》疫病防治高頻用藥功效知識圖譜 如表3所示，《傷寒論》高頻中藥功效占比最高的是補氣藥，占比為20%，其次為發(fā)散風寒，占比為15%，攻下和溫里占比均為10%。其余功效占比均為5%。

《傷寒論》高頻中藥功效知識圖譜見圖5。其中綠色節(jié)點表示醫(yī)家即張仲景，灰色節(jié)點表示中藥實體即《傷寒論》疫病相關藥方中前20味高頻中藥，紅色節(jié)點表示功效實體。連接中藥實體與功效實體之間的邊表示這些藥相應的功效?？梢灾庇^地看出，《傷寒論》中，功效占比最多的補氣藥有甘草、人參等；功效占比其次的發(fā)散風寒藥有麻黃、桂枝等；攻下藥為芒硝和大黃，溫里藥為附子和干姜。

表3 高頻中藥功效頻次

圖5 前20味高頻中藥功效的知識圖譜

2.3 《傷寒論》疫病防治用藥相關性分析

對《傷寒論》中使用前20的高頻用藥進行Pearson相關性分析，并使用R Studio中Corrplot函數(shù)將高頻中藥相關性分析進行可視化，見圖6。

根據(jù)Pearson相關系數(shù)大小對藥對組合進行排列，相關系數(shù)較高的前10組藥對見表4。由表4可知，黃芩-柴胡相關性最強，相關系數(shù)為0.92，接近于1.00。

2.4 《傷寒論》疫病防治用藥關聯(lián)規(guī)則分析

使用R Studio對《傷寒論》疫病防治用藥進行關聯(lián)規(guī)則分析，根據(jù)方劑數(shù)量為61首，同時結合經(jīng)驗判斷和不同參數(shù)提取出數(shù)據(jù)的預讀，設置最小支持度為7%，最小置信度為60%，共得到《傷寒論》疫病防治用藥的271條關聯(lián)規(guī)則，包含40條二階關聯(lián)規(guī)則，94條三階關聯(lián)規(guī)則，91條四階關聯(lián)規(guī)則，40條五階關聯(lián)規(guī)則，皆是提升度＞1的有效規(guī)則。按置信度及提升度降序排序，前20條關聯(lián)規(guī)則如表5所示。

圖6 《傷寒論》前20味高頻用藥相關性分析

表4 相關系數(shù)前10組藥對組合

2.5 《傷寒論》疫病防治用藥聚類分析

運用IBM SPSS statistics對《傷寒論》疫病治療用藥前20味高頻中藥進行了系統(tǒng)聚類分析，生成了系統(tǒng)距聚類樹，見圖7。由圖7可知，《傷寒論》疫病治療用藥前20味高頻中藥可以分為特征相近的5類。類聚方1：黃芩、柴胡、半夏、生姜、大棗、人參、桂枝、白芍；類聚方2：干姜、附子、甘草；類聚方3：苦杏仁、麻黃、石膏；類聚方4：茯苓、白術；類聚方5：枳實、厚樸、大黃、芒硝。其分別為小柴胡湯加減、四逆湯、麻杏石甘湯加減、茯苓白術湯、大承氣湯等方中主要藥物。

3 小柴胡湯“病-證-癥-方-藥”關系構建與網(wǎng)絡藥理學機制研究

3.1 小柴胡湯“病-證-癥-方-藥”關系

中醫(yī)藥有著幾千年與瘟疫做斗爭的歷史，在此次COVID-19疫情防控中作用重大。從國家及各省市診療方案和中醫(yī)臨床專家的見解中發(fā)現(xiàn)[18]，盡管方藥多有差異，但COVID-19屬于中醫(yī)“疫”的范疇，經(jīng)口鼻、接觸而傳染發(fā)病，其毒與寒濕燥之邪相合，首先上受犯肺，病位以肺為中心，病機以“濕邪”為主，其核心證型為“痰熱壅肺、閉肺”“風寒、風熱犯肺”等[19]。COVID-19患者最常見的癥狀是發(fā)熱和咳嗽，部分患者出現(xiàn)發(fā)熱持續(xù)反復波動的情況，《傷寒論》中記載：“往來寒熱，胸脅苦滿，默默不欲飲食，心煩喜嘔，或胸中煩而不嘔……小柴胡湯主之”，這與小柴胡湯適應證相符[9]。

類聚方中出自《傷寒論》中的方劑有小柴胡湯、麻杏石甘湯和大承氣湯等。大承氣湯主要用于瀉下，小柴胡湯和麻杏石甘湯與疫病的相關性較強，同時結合相關分析結果，“柴胡-黃芩”為相關系數(shù)最高的藥對，并且其在關聯(lián)規(guī)則分析中的支持度（9.84%）、置信度（100%）和提升度（8.71）均較高，該藥對是出自《傷寒論》的經(jīng)典名方小柴胡湯，因此本研究選擇小柴胡湯為例，構建其“病-證-癥-方-藥”關系，并對其核心藥對進行作用機制研究。

表5 《傷寒論》前20條中藥關聯(lián)規(guī)則

圖7 前20味高頻用藥系統(tǒng)聚類樹

從錄入的61條數(shù)據(jù)中，篩選出使用小柴胡湯治療的條目，共3條。其中癥狀按照《中醫(yī)癥狀鑒別診斷學》第2版進行人工分詞和規(guī)范化，規(guī)范化例如“往來寒熱”規(guī)范為“寒熱往來”；對于一些《傷寒論》中原始提出的癥狀，如“胸脅滿”一類的詞保留。運用Neo4j Desktop軟件分別建立疾病、證候、癥狀、方劑、中藥5個結點，并建立“病-證”“證-癥”“癥-方”“方-藥”4種關系，最終得到如圖8所示的“病-證-癥-方-藥”關系。

3.2 小柴胡湯核心藥對作用機制研究

在目前COVID-19的治療中，清肺排毒湯被廣泛運用，而其組成成分之一正是小柴胡湯。同時，小柴胡湯也被多地、多部門聯(lián)袂推薦使用[8-9]，可見仲景古方在治療新疫病中正發(fā)揮重要作用，但是對于其作用機制的研究仍有不足。小柴胡湯中柴胡為君，黃芩為臣，“柴胡-黃芩”為其核心藥對。同時，柴胡與黃芩的配伍首現(xiàn)于《傷寒論》，是仲景柴胡系列方劑中最具代性的基本配伍，也是本研究挖掘張仲景治療疫病方劑中相關程度最強的配伍藥對，且為臨床常用藥對。柴胡微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，主要有疏散退熱、化解肝郁作用；黃芩苦寒，歸肺、膽、脾經(jīng)等，主要功效為清熱燥濕、清肺止咳、瀉火解毒、止血等。該藥對廣泛運用于心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等疾病，并且療效顯著。故本研究選擇核心藥對“柴胡-黃芩”進行作用機制研究。

圖8 小柴胡湯“病-證-癥-方-藥”關系的可視化

3.2.1 “柴胡-黃芩”藥對活性成分篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索“柴胡-黃芩”有效成分及基因靶點，最終篩選出主要活性成分柴胡13個，黃芩32個，共同有效成分有1個，為豆甾醇（stigmasterol），去除重復靶點后共得到189個靶點。主要活性成分信息見表6。

3.2.2 COVID-19疾病靶點 GeneCards檢索得到1043個基因，通過相關度大于中位數(shù)規(guī)則篩選出522個疾病靶點；OMIM和Drugbank分別得到2、26個靶點。整理上述靶點共獲得COVID-19靶點543個。

3.2.3 藥物-疾病靶點交集 利用R Studio的ggvenn包取藥物及疾病靶點的交集，共得到64個交集靶點，如圖9所示。

3.2.4 “疾病-藥物-成分-靶點”關系和PPI網(wǎng)絡構建 為直觀展現(xiàn)64個“柴胡-黃芩”藥對治療COVID-19的相互作用關系，利用Cytoscape構建“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，見圖10。其中度（degree）＞10的化合物編號分別為CH10、HQ2、CH5、HQ4、HQ1、HQ28、HQ13、HQ15、HQ16；同時度＞17的核心靶點為前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、熱休克蛋白90α（90αHeat shock protein HSP 90-alpha，HSP90AA1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、誘導型一氧化氮合成酶2（nitric oxide synthase, inducible 2，NOS2）、蛋白激酶環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）激活催化亞基α（cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha，PRKACA）、二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）。將64個關鍵靶點輸入String平臺，并利用Cytoscape繪制PPI網(wǎng)絡，評分條件＞0.40，共有64個節(jié)點，1069條邊，平均節(jié)點評分為33.4，見圖11。其中得分排名前25的是血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤抑制蛋白（cellular tumor antigen p53，TP53）、蛋白激酶Bα（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、白細胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL1B）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、白細胞介素-8（interleukin-8，CXCL8）、PTGS2、缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor 1alpha，HIF1A）、IL-10、表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腦區(qū)原癌基因蛋白（proto-oncogene c-Fos，F(xiàn)OS）、趨化因子配體2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule 1，ICAM1）、G1/S-特異性周期蛋白-D1（G1/S-specific cyclin-D1，CCND1）、核因子-κB抑制因子α（NF-kappa-B inhibitor alpha，NFKBIA）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、HSP90AA1、II型干擾素（interferon gamma，IFNG）、CASP8、B-細胞淋巴瘤因子2樣蛋白1（Bcl-2-like protein 1，BCL2L1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、IL-2。

表6 “柴胡-黃芩”的活性成分

CH-柴胡 HQ-黃芩 A-共有成分

CH-HQ-A-common component

圖9 交集靶點的Venn圖

圖10 “疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡

3.2.5 交集靶點的GO和KEGG富集分析 利用R語言對64個關鍵靶點進行GO和KEGG通路分析，限定＜0.05，繪制氣泡圖和條形圖，由圖12可知，GO生物過程主要包括對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、細菌源性分子的反應（response to molecule of bacterial origin）、細胞對生物刺激的反應（cellular response to biotic stimulu）、細胞對脂多糖的應答（cellular response to lipopolysaccharide）、細胞對細菌來源分子的反應（cellular response to molecule of bacterial origin）等；GO細胞過程主要包括膜筏（membrane raft）、膜微結構域（membrane microdomain）、質(zhì)膜筏（plasma membrane raft）、陷窩（caveola）、器官外膜（organelle outer membrane）；GO分子功能以細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity）、信號受體激活劑活性（signaling receptor activator activity）為主。

圓圈越大，顏色越深，則該蛋白越重要；邊越粗，蛋白的關聯(lián)性越高

KEGG富集通路分析得到165條結果，由圖13可知，靶點主要集中在脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、白細胞介素17信號通路（IL-17 signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥的物及其受體信號通路（AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications）、流體切應力和動脈粥樣硬化信號通路（fluid shear stress andatherosclerosis）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、人類巨細胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、Toll受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、coronavirus disease-COVID-19、Th17細胞分化（Th17 cell differentiation）等通路。

圖12 “柴胡-黃芩”活性成分治療COVID-19靶點的GO富集分析(前8)

圖13 “柴胡-黃芩”活性成分治療COVID-19靶點的KEGG富集分析(前20)

4 討論

COVID-19屬于中醫(yī)學中的“疫病”范疇，COVID-19患者所表現(xiàn)出的癥狀與肺系疫病相似，中醫(yī)藥在與“疫病”長期的斗爭過程中積累了較為清楚的認識和豐富的經(jīng)驗，有一套較為完整的理論與臨床治療的方法[20]?！秱摗分饕撌鰝?，傷于寒為主而致外感熱病的過程即為傷寒，張仲景對傷寒病運用“三陽三陰”為主的六經(jīng)辨證方法，實質(zhì)上指根據(jù)經(jīng)脈所屬五臟六腑的病理變化，結合相對應臨床證候的部位、性質(zhì)、病機、病勢進行分類，從而歸納為六經(jīng)病證?！秱摗贩絼┯盟幘_，加減靈活，臨床療效顯著。本研究選取《傷寒論》卷第五、卷第七、卷第八和卷第九中疫病相關方劑61首，進行藥物頻次、性味歸經(jīng)功效、相關分析、關聯(lián)規(guī)則和聚類分析，挖掘出了相關疫病治療配伍規(guī)律，并對小柴胡湯進行了“病-證-癥-方-藥”關系構建，以及核心藥對“柴胡-黃芩”進行了網(wǎng)絡藥理學作用機制分析，以期為COVID-19臨床治療提供參考。

4.1 用藥頻率分析

《傷寒論》中疫病治療使用頻數(shù)最高的4味藥甘草、生姜、大棗、桂枝即為桂枝湯組方成分，白芍也位列高頻用藥第7味。桂枝溫通營氣、解肌祛風，配伍甘草可辛甘化陽；生姜配伍桂枝散邪；大棗與芍藥配伍養(yǎng)陰，配生姜以鼓氣血營衛(wèi)御外邪。桂枝湯目前臨床上應用于循環(huán)、免疫等多個系統(tǒng)，可達到抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒等效果[21]。不僅如此，前20味高頻用藥中包含了甘草、生姜、桂枝、半夏、枳實、茯苓、黃芩、白術、柴胡、苦杏仁、麻黃、石膏（圖1），這與《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[6]中清肺排毒湯處方中主要成分基本吻合，適用于COVID-19輕型、普通型、重型患者。高頻中藥中甘草、生姜、大棗、桂枝、大黃、人參、白芍等結果與劉永瑞等[4]的研究結果相似。甘草屬于補虛藥，在方劑中應用廣泛，可以發(fā)揮補、緩、護、化、解等功效，這也反映了張仲景溫補脾胃的學術思想。

從中藥性味歸經(jīng)分析來看，《傷寒論》中用藥最偏好溫性藥（表2）。20味高頻中藥以溫熱藥為主，頻數(shù)為11，占比高達55%，寒涼藥頻數(shù)為7，占比為35%?？梢姀堉倬耙卟∮盟幧朴脺匦运幧⒑乩?、助陽，用于外寒、內(nèi)寒引起的疫病均療效顯著，符合其“重陽氣”的思想。此外，其中寒性藥也占到了35%，寒溫并用，寒以清熱，溫則驅(qū)寒調(diào)脾胃。《傷寒論》治療疫病的前20味高頻藥物五味中辛、苦、甘排前3位（表2），分別占比30.3%、27.27%、24.24%。辛可發(fā)散解表；苦可清熱瀉火、清熱燥濕；甘可補益和中、調(diào)和藥性。與藥性結合分析，仲景善用辛溫、苦溫、甘溫藥物，辛溫可發(fā)散風寒，苦溫可燥濕，甘溫可補中益氣[20]。高頻用藥中14味歸經(jīng)于脾（21.88%），其次歸于肺經(jīng)藥物13味（20.31%），主歸于脾、肺經(jīng)與COVID-19病位屬肺相符合[22]。脾主運化，乃氣血生化之源，健脾則能保護五臟，扶脾從而保肺。肺主氣，可以促進血行，抵抗外邪，其中衛(wèi)氣防御作用顯著；肺主宣散衛(wèi)氣，且肺為嬌臟，不耐風寒濕諸邪侵襲，為疫病的病理發(fā)展提供了基礎。張仲景治療疫病注重脾肺功能，配伍藥物內(nèi)外兼續(xù)，謹守病機，在外發(fā)散風寒調(diào)和營衛(wèi)以治肺，在內(nèi)溫補脾胃，燥濕行氣，標本兼顧[20]。

從中藥功效分類來看，《傷寒論》治療疫病常用補氣藥、發(fā)散風寒藥、攻下和溫里藥（表3）。補氣藥及發(fā)散風寒藥在仲景方中應用廣泛，合用既溫通經(jīng)脈，又解表散邪氣，在張仲景治療傷寒時注重護胃氣、扶正氣，而補虛和中之藥可為治療傷寒之首要輔助用藥。

4.2 相關性分析與關聯(lián)規(guī)則分析

相關性分析中相關系數(shù)較高的前10味藥對組合多為發(fā)散風寒藥和清熱燥濕藥，其中相關系數(shù)大于0.9的藥對為“柴胡-黃芩”“苦杏仁-麻黃”。柴胡與黃芩是中醫(yī)臨床常見的藥對，在小柴胡湯等經(jīng)典方劑中配伍應用，配伍可消減郁熱、清熱燥濕、調(diào)和表里、和解少陽[23]。“苦杏仁-麻黃”藥對，二者皆可入肺，配伍宣降相宜，可辛溫發(fā)散、宣肺降氣平喘，許多經(jīng)典名方均有此配伍，如三拗湯、麻黃湯、麻杏石甘湯等[24]。

在關聯(lián)規(guī)則分析中，《傷寒論》中治療疫病2種、3種、4種和5種藥物關聯(lián)規(guī)則中置信度與提升度最高的藥對組合為“甘草、苦杏仁→麻黃”，其為麻黃湯的主要組成部分，在《傷寒論》中麻黃湯可治風寒表實之證，主要用于發(fā)汗解表、平喘止咳。其次為以“柴胡-黃芩”為核心的藥對組合，與它們組合的大棗、生姜、半夏正是小柴胡湯的主要成分。小柴胡湯是和解劑，其具有和解少陽的功效。臨床主要用于治療身體出現(xiàn)的傷寒少陽病證。關聯(lián)規(guī)則中排名靠前的2階組合為“麻黃→苦杏仁”“柴胡→黃芩”，這與相關性分析的結果一致，2組藥對的相關系數(shù)最高且都大于0.9。

4.3 藥物聚類規(guī)則分析

根據(jù)中醫(yī)理論和統(tǒng)計學知識得到5個類聚方。

4.3.1 類聚方1 由黃芩、柴胡、半夏、生姜、大棗、人參、桂枝、白芍組成，此方為小柴胡湯加減，具有和解表里、疏利樞機的功效。COVID-19為濕毒所致，容易肺氣郁閉，出現(xiàn)胸悶喘促、氣機不利等癥狀[25]，因此，及時化濕理氣、調(diào)暢氣機、防止氣阻閉肺在新冠的救治過程中極為重要，柴胡化解濕氣、調(diào)和郁熱，黃芩清熱燥濕。COVID-19之寒濕疫毒郁于膜原，致少陽樞機不利。少陽乃是太陽、陽明升降的樞紐，可調(diào)節(jié)三陽經(jīng)氣升降。小柴胡湯中柴胡、黃芩、桂枝、半夏作為主藥，具有兩解少陽、太陽之邪的作用，為一類；人參、白芍等補益藥物為一類；生姜、大棗調(diào)和營衛(wèi)、護衛(wèi)脾胃，為一類。方中柴胡、黃芩配伍以清泄少陽郁火；半夏、生姜配伍以化痰止嘔逐邪，全方疏利少陽、調(diào)節(jié)樞機，為和解良方。桂枝作為君藥，散在表之邪；白芍與人參一樣，作為臣藥，具有補益之功，同時與桂枝相合，調(diào)和營衛(wèi)，以助疏散表邪[26]。

其中“黃芩-柴胡”藥對在相關性分析中得分最高為0.92，相關程度最強；“半夏-黃芩”“生姜-大棗”“半夏-柴胡”位列3～5位，得分均較高，相關程度較強；除此之外，“大棗-黃芩”“生姜-黃芩”也在相關分析排序中位列前10?？梢娦〔窈鷾幬锱湮橄嚓P程度高。在關聯(lián)規(guī)則分析中，“黃芩-半夏”“黃芩-生姜”“黃芩-大棗”“柴胡-黃芩”藥對置信度均為100%，且支持度較高；此外“生姜-大棗”藥對的支持度最高且置信度也大于90%，可見小柴胡湯藥物配伍相關程度高。

4.3.2 類聚方2 由干姜、附子、甘草組成，乃四逆湯，有溫陽散寒、回陽通脈、溫肺消痰的功效，為回陽救逆之要方[27]。其中附子干姜味辛，性溫熱，主風寒咳逆，主治外感、雜病、屬脾腎陽虛寒盛者。

4.3.3 類聚方3 由苦杏仁、麻黃、石膏組成，為麻杏石甘湯主要成分。仝小林院士等[25]認為此次COVID-19疫情，系有寒濕化熱，毒熱郁閉肺氣，肺氣失于宣降，或熱毒熾盛，為肺熱不清之證。麻杏石甘湯對外感發(fā)熱肺熱證療效顯著，可用于傾瀉肺經(jīng)實熱，辛涼宣泄、清肺平喘，可以緩解發(fā)熱、抗炎、抗病毒和舒緩喘咳。以麻杏石甘湯作為基礎方加減聯(lián)合基礎治療，對呼吸道感染發(fā)熱類疾病效果較好[28]。麻杏石甘湯治療疫病咳痰喘嗽、痰飲聚肺、氣滯血瘀等癥狀，具有清降肺氣、辛泄寒氣、瀉肺排毒的作用。

在相關性分析中，麻杏石甘湯中主要配伍藥對苦杏仁-麻黃排名第2，得分為0.9，相關性很強，關聯(lián)規(guī)則分析中“苦杏仁-麻黃”藥對的置信度為100%，提升度（10.17）最高，支持度較高，可見該藥對關聯(lián)性很強，為經(jīng)典配伍。此外，麻黃-甘草、石膏-甘草藥對的置信度也為100%，支持度也較高。

4.3.4 類聚方4 由茯苓、白術組成，為茯苓白術湯主要成分，茯苓甘淡性平，歸經(jīng)于心、肺、脾、腎，可泄?jié)窠∑?；白術苦甘性溫，可健脾益氣、固表止汗。茯苓、白術合用通陽利水、健脾而除濕。

4.3.5 類聚方5 由枳實、厚樸、大黃、芒硝組成，乃大承氣湯中主要配伍成分，枳實歸經(jīng)于脾、胃、大腸，可消積、化痰、除痞。大柴胡湯中仲景將枳實與大黃配伍應用，取其“消脹滿，心下急痞痛”的功效，可用枳實消積除滿。厚樸有燥濕消痰、平喘的功效。大黃為寒性藥物，有清熱瀉火、涼血解毒之功效，發(fā)揮泄熱通腑、活血化疲、安和五臟等作用。芒硝也為寒性藥物，軟堅潤燥、泄下通便。芒硝與大黃同屬于泄下藥，但芒硝攻積泄熱之力較弱而軟化燥屎的作用較強，因此廣泛用于正氣不足或壅滯較輕者。此類聚方配伍以增強瀉下攻積之力，用治陽明腑實證、胃腸燥熱證等。

4.4 網(wǎng)絡藥理學分析

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法[29]研究《傷寒論》治疫方中核心藥對“柴胡-黃芩”治療COVID-19的作用機制，構建“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，并分析其重要活性成分、靶點、蛋白作用、通路等，獲取了核心藥物45個活性成分和189個作用靶點，COVID-19的543個靶點，交集靶點64個，GO分析1871個相關條目，KEGG共獲得164條通路。

4.4.1 “柴胡-黃芩”藥對核心成分分析 利用網(wǎng)絡藥理學的方法構建“疾病-藥物-成分-靶點”，得到柴胡-黃芩藥對治療COVID-19可能的重要成分為槲皮素（quercetin）、漢黃芩素（wogonin）、山柰酚（kaempferol）、黃芩素（baicalein）、刺槐素（acacetin）、蘇薺黃酮（moslosooflavone）、千層紙素A（oroxylin A）、5,7,4-三羥基-8-甲氧基黃酮（5,7,4-trihydroxy-8-methoxyflavone）、紅花素（carthamidin）等。其中槲皮素、山柰酚、刺槐素是具有生物活性的黃酮類化合物，能夠抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗炎[30-31]。藥理實驗表明槲皮素、黃芩素、漢黃芩素均可降低流感病毒感染小鼠死亡率和肺指數(shù)，可抑制病毒復制、肺部炎癥，保護肺部功能[14]。實驗研究表明，槲皮素可以顯著增強環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能[32]，漢黃芩素可通過增加免疫細胞的浸潤、調(diào)節(jié)免疫細胞的表型來增強免疫功能[33]。刺槐素可通過抗炎、抗氧化等方面干預COVID-19病程進展，顯著減輕肺損傷[34]。張英睿等[35]研究表明刺槐素、丁香苷等可作用于CASP3、CASP8等靶點調(diào)節(jié)細胞凋亡通路及TNF通路，從而對抗COVID-19藥物潛在靶點產(chǎn)生作用。陳桂榮等[36]研究表明蘇薺黃酮能通過調(diào)控PTGS2、NOS2等減少炎癥，為防治COVID-19患者膿毒癥并發(fā)癥奠定基礎；千層紙素A生物活性強，在神經(jīng)保護、抗炎、保護血管內(nèi)皮細胞等方面發(fā)揮重大作用。

4.4.2 “疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡及PPI網(wǎng)絡主要作用靶點分析 結合“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡高頻靶點以及蛋白相互作用網(wǎng)絡評分得到可能的重要作用靶點是VEGFA、TNF、IL6、TP53、AKT1、CASP3、CXCL8、PTGS2、EGFR、PPARG、HSP90AA1、IL10、IL2、NOS2、NOS3、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3B）、促分裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）等。

其中PTGS2、HSP90AA1、NOS2、IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、NOS3等靶點可以發(fā)揮抗炎作用，從而達到治療肺炎的目的。研究表明PTGS2、PTGS1等靶點在炎癥的治療及RNA病毒的復制過程中發(fā)揮作用[37]。HSP90AA1免疫應答及抗炎作用較強[38]。目前IL-6被認為是COVID-19進展的預后生物標志物之一，可以指導新冠患者的病情進展、治療及預后的評估等過程[39]。實驗表明，IL-6作為炎癥因子參與炎癥的病理過程，VEGFA水平升高也可能與肺部炎癥消退有關[40]，CXCL8也是具有趨化作用的炎性細胞因子。

其中CASP3、PPARG、GSK3B、MAPK14、VEGFA、AKT1、EGFR等靶點發(fā)揮調(diào)節(jié)人體免疫功能的作用。在病毒（包括冠狀病毒）感染性疾病中病毒引發(fā)凋亡是十分常見的現(xiàn)象[41]。而CASP3、MAPK、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）在細胞凋亡方面起關鍵作用[42-43]。AKT1主要參與調(diào)控細胞生長、異常增殖及葡萄糖代謝。IL-2、IL-6、TNF、VEGFA、EGFR等也是參與免疫的細胞因子，并參與合成、代謝等方面。

基于網(wǎng)絡藥理學研究，結合中醫(yī)理論分析“柴胡-黃芩”藥對治療COVID-19的作用機制，在病毒感染后的肺炎治療中，PTGS2、HSP90AA1、NOS2、IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、NOS3等多靶點直接發(fā)揮治療肺炎的作用，CASP3、PPARG、GSK3B、MAPK14、VEGFA、AKTI、IL-2、IL-6、TNF等多靶點調(diào)節(jié)人體免疫功能以扶正祛邪。

4.4.3 交集靶點的GO和KEGG富集分析 “柴胡-黃芩”的靶標GO條目共1871個（＜0.01），其中生物過程1752個，細胞組成24個，分子功能95個，分別占93.64%、1.28%、5.08%。生物過程條目占比最大，最具有代表性，主要為對脂多糖的反應、細菌源性分子的反應、細胞對生物刺激的反應等。細胞組成主要包括膜筏、膜微結構域等。分子功能主要為細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性等。脂多糖可通過刺激免疫細胞和局部鄰近細胞增加炎癥因子的表達，進而誘導發(fā)生免疫反應。

KEGG結果顯示主要通路為脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、糖尿病并發(fā)癥晚期糖基化終末化產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for dvanced glycation end prod-ucts，RAGE）信號通路、流體切應力和動脈粥樣硬化信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染、Toll受體信號通路、coronavirus disease-COVID-19、Th17細胞分化等。

AGE-RAGE信號通路與糖尿病相關，通過大量促炎因子的釋放造成炎癥損傷。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2，SARS-Cov-2）可能通過與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的結合進入并破壞胰島P細胞從而導致血糖升高，繼而病情惡化，尤其是對于糖尿病的患者[44]。TNF可誘導多種細胞內(nèi)信號通路，包括細胞凋亡、炎癥、免疫等[45]，可引起促炎因子表達，從而參與全身炎癥反應。研究表明COVID-19重癥患者TNF-α水平比非重癥患者高[46-47]。IL-17為能誘導多種細胞釋放促炎因子，參與免疫調(diào)節(jié)。研究表明COVID-19患者的嚴重程度與IL-17等TH17細胞相關的促炎因子水平呈正相關[45]。因此，調(diào)控AGE-RAGE、TNF和IL-17信號通路可作為COVID-19的潛在治療方法[44,48]。

“柴胡-黃芩”可能通過槲皮素、漢黃芩素、山柰酚、黃芩素、刺槐素等主要活性成分作用于VEGFA、TNF、IL6、TP53、AKT1等多靶點，參與氧化應激反應、對脂多糖的反應等多種生物學過程，激活或抑制激活或抑制糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE、流體切應力和動脈粥樣硬化等主要信號通路，抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫，從而達到有效治療COVID-19的目的。

5 結語

本研究運用Excel、R語言、SPSS等軟件對醫(yī)圣張仲景的著作《傷寒論》中疫病相關方劑進行相關分析、關聯(lián)規(guī)則與聚類分析，挖掘疫病用藥組方規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其藥物使用以扶陽、顧護脾胃為主，獲得5個類聚方，促進了張仲景治療疾病經(jīng)驗的挖掘、傳承及古方今用，也可為COVID-19預防與治療、新方發(fā)現(xiàn)與新藥研發(fā)提供參考。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》指出COVID-19是疫戾之氣所犯，屬于中醫(yī)角度“疫病”范疇[5]，COVID-19是因為感受疫戾之氣，在辨證論治上，對輕型和普通型患者按寒濕、濕熱、濕毒辨證，重型則強調(diào)按疫毒論治。國家中醫(yī)藥管理局推薦抗擊COVID-19疫情的典型代表“三藥三方”為金花清感顆粒、連花清瘟顆粒/膠囊、血必凈注射液及清肺排毒湯、化濕敗毒方、宣肺敗毒方。清肺排毒湯由《傷寒論》中的小柴胡湯與麻杏石甘湯、五苓散等經(jīng)典方劑優(yōu)化配伍而成，是治療COVID-19的“三藥三方”之一，這反映了中醫(yī)防治疫病不為病毒所影響，可以根據(jù)病因病機靈活組方遣藥，體現(xiàn)了古方今用的新價值優(yōu)勢。本研究相關分析、關聯(lián)規(guī)則、聚類分析結果中，均顯示出這些方劑當中的主要配伍成分，其中聚類方中的小柴胡湯、麻杏石甘湯為清肺排毒湯配伍的主要方劑，麻杏石甘湯以及相關分析和關聯(lián)規(guī)則結果中排名靠前的“甘草、麻黃→苦杏仁”“麻黃-苦杏仁”等藥對為化濕敗毒方中主要配伍成分。但數(shù)據(jù)挖掘需要理論與實踐相結合，缺乏結合后世使用經(jīng)方經(jīng)驗，故本研究挖掘出的用藥規(guī)律還需進一步臨床驗證。最后，對挖掘出具有代表性的核心藥對“柴胡-黃芩”進行了網(wǎng)絡藥理學分析，闡釋了“柴胡-黃芩”治療COVID-19可能的作用機制，為后續(xù)研究提供了一定的理論基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of medication regularities of epidemic disease prescription inand mechanism of core drugs in treatment of COVID-19

TANG Shao-liang1, GONG Yue2, FENG Yu-li2, YANG Tong-ling2, ZHANG Meng1,SHEN Jun-long2,CHENG Yan3

1. Institute of Traditional Chinese Medicine Literature, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. School of Health Economics and Management, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. Department of Pharmacy, Nanjing Chinese Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To analyze the medication rules of related epidemic disease prescription inbased on data mining, and the mechanism of “Chaihu ()-Huangqin ()” as the core drugs in the treatment of coronavirus disease 2019 (COVID-19) by network pharmacology, in order to explore the contemporary value of classical prescriptions in the treatment of epidemic diseases.The prescriptions for treating epidemic diseases inwere screened, and the medication rules such as drug frequency, flavor and meridian tropism as well as correlation, apriori algorithm were analyzed by using software such as R language. The mechanism of the core drugs in the medication pattern in the treatment of COVID-19 was explored by the network pharmacology. A “disease-drug-ingredient-target” network was constructed on the selected components and targets with Cytoscape. The key targets were introduced into String database for network analysis of protein-protein interaction (PPI), and gene ontology (GO) functional analysis and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway analysis were conducted in R language.A total of 61 prescriptions for treating epidemic diseases inwere included, including 52 traditional Chinese medicines (TCMs). In the top 20 high-frequency drugs, warm drugs, spicy drugs and-tonifying drugs were mainly used, mostly in the spleen and lung meridian. Chaihu () and Huangqin () herb pair had the strongest correlation. A total of five clusters were excavated: supplemented formula of Xiaochaihu Decoction (小柴胡湯), Sini Decoction (四逆湯), supplemented formule of Maxing Shigan Decoction (麻杏石甘湯), Fuling Baizhu Decoction (茯苓白術湯) and Dachengqi Decoction (大承氣湯). A total of 45 active ingredients, 189 action targets of-herb pair, and 543 targets of COVID-19 were obtained from TCMSP and Genecards, and 64 intersection targets were generated. The results of the network analysis showed that the main components of core drugs pair against COVID-19 may be quercetin, wogonin, kaempferol baicalein, acacetin etc., and the core targets may be VEGFA, TNF, IL-6, TP53, AKT1, CASP3, CXCL8, PTGS2, etc. A total of 1871 related entries and 164 pathways were obtained by GO and KEGG enrichment analysis, respectively.In, the treatment of epidemic diseases mainly chose pungent, warm, spleen-invigorating and-tonifying herbs, such as Xiaochaihu Decoction, Sini Decoction and Dachengqi Decoction, etc. It was found that-core herb pair prevent and treat COVID-19 through multi-target targets such as PTGS2, IL-6 and TNF. The ancient prescriptions for treating epidemic disease inmay have significant reference value for the prevention and treatment of new epidemic diseases today.

epidemic disease;; data mining; COVID-19;;; Xiaochaihu Decoction; Sini Decoction; Maxing Shigan Decoction; Fuling Baizhu Decoction; Dachengqi Decoction

R285

A

0253 - 2670(2023)01 - 0192 - 18

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.022

2022-08-11

國家社會科學基金重點項目（19AZD018）；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心重點項目（ZDXM-2022-09)

湯少梁（1969—），男，博士生導師，教授，研究方向為醫(yī)藥經(jīng)濟、中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘。Tel: 13952003436 E-mail: tangshaoliang@126.com

[責任編輯 潘明佳]