三七藥渣中主要多糖成分的分離純化及其抗氧化活性研究

曹玉標(biāo)，孫亮亮，楊 野，崔秀明，邱 斌，王承瀟*

三七藥渣中主要多糖成分的分離純化及其抗氧化活性研究

曹玉標(biāo)1, 2，孫亮亮1, 2，楊 野1, 2，崔秀明1, 2，邱 斌3*，王承瀟1, 2*

1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500 2. 云南省三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500 3. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

分離純化三七藥渣中主要多糖組分，分析其單糖組成，并對(duì)比研究各組分多糖的抗氧化活性。采用水提醇沉法提取三七藥渣粗多糖；經(jīng)DEAE Fast Flow陰離子交換柱、Sephadex G-50柱色譜法進(jìn)行分離純化。采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）法測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量及純度，通過掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier Transform Infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、HPLC-衍生化等方法對(duì)各組分多糖的單糖組成和初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。分析其抗氧化能力以及對(duì)RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。分離得到3個(gè)多糖組分（PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3），3者的單糖組成和比例存在差異：PNPS-0主要由-葡萄糖（52.28%）和-半乳糖（34.14%）組成；PNPS-0.2主要由-半乳糖（40.89%）、-阿拉伯糖（19.38%）和-葡萄糖（12.25%）組成；PNPS-0.3主要由-葡萄糖醛酸（40.43%）、-半乳糖（22.61%）和-葡萄糖（18.32%）組成?？寡趸Y(jié)果表明，PNPS-0.3的總還原能力最強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基、OH?自由基、ABTS自由基以及超氧陰離子自由基的清除活性最高，對(duì)RAW 264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用最好，并呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。從三七藥渣中得到了3種具有抗氧化活性的多糖片段，抗氧化活性與多糖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。為三七資源的二次開發(fā)利用提供了新的研究思路。

三七；多糖；構(gòu)效關(guān)系；單糖組成；抗氧化；藥渣；高效凝膠滲透色譜；-葡萄糖；-半乳糖；-阿拉伯糖；-葡萄糖醛酸

中藥藥渣是指從中藥材中提取目標(biāo)活性成分后所產(chǎn)生的廢料、廢渣。高濕中藥渣較易滋生微生物菌而發(fā)霉變質(zhì)，發(fā)出惡臭氣味，堆放占用大量空間，掩埋會(huì)造成地下水的二次污染，曬干焚燒又會(huì)帶來環(huán)境污染，均不利于生態(tài)環(huán)保，嚴(yán)重制約中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展目標(biāo)的提出以及綠色環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展理念日益深入人心，越來越多的研究趨向于中藥材資源最大化利用[2]。

三七是五加科人參屬植物三七(Burk.) F. H. Chen的干燥根及根莖，多數(shù)以三七入藥的產(chǎn)品（諸如血塞通、復(fù)方丹參滴丸等）以皂苷成分入藥[3-4]，醇提皂苷成分后殘留的藥渣被丟棄。藥渣殘留的大量生物活性物質(zhì)，如多糖、氨基酸類（主要為三七素）、蛋白質(zhì)類、揮發(fā)油等[5]尚未得到有效利用。因此，深入挖掘、利用三七藥渣中的活性成分，變廢為寶，不僅能增加企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，而且對(duì)三七的二次開發(fā)利用和資源的可持續(xù)發(fā)展具有重要研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

三七多糖（polysaccharides）是三七藥渣中大量存在的活性物質(zhì)。本課題組前期研究表明，三七多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性[6]。本研究擬以三七藥渣廢棄物為研究對(duì)象，從中獲取具有生理活性的多糖片段，系統(tǒng)分析其結(jié)構(gòu)組成，并從離體-細(xì)胞水平對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上，探索并闡明三七多糖結(jié)構(gòu)-活性之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。本研究可為中藥藥渣資源開發(fā)利用提供新的研究視角，同時(shí)為三七資源的可持續(xù)利用提供新的研究思路和技術(shù)儲(chǔ)備。

1 材料與儀器

1.1 儀器

HF-100 CO2型培養(yǎng)箱，上海力康生物有限公司；Scientz-10ND型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；CTK-32R型高速離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；CKX41型倒置顯微鏡，中國(guó)奧林巴斯有限公司；3100高效液相色譜儀，依利特分析儀器有限公司；Varioskan LUX型酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；MIRA LMSALPHAII型掃描電子顯微鏡（SEM），捷克泰思肯有限公司；EMXplus-6/1型順磁共振波譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)布魯克科技有限公司；Nikon Eclipse C1激光共聚焦顯微鏡，日本尼康公司。

1.2 材料

三七藥渣，皂苷提取工藝中產(chǎn)生的廢棄物，批號(hào)210813，來源于昆明華潤(rùn)圣火藥業(yè)有限公司；RAW264.7細(xì)胞，購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心；-無水葡萄糖（Glu），批號(hào)1122A0219，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，北京索萊寶科技有限公司；-鼠李糖（Rha，批號(hào)O12A10K95105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、-阿拉伯糖（Ara，批號(hào)J24M10R89091，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、-木糖（Xyl，批號(hào)D17N9S74410，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、-甘露糖（Man，批號(hào)C25D8H51117，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、-半乳糖（Gal，批號(hào)H16N10C102439，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）、-半乳糖醛酸（GalUA，批號(hào)M13N10C64281，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞97%）、-葡萄糖醛酸（GluUA，批號(hào)P28N10F37892，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞96%），均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；DEAE Sepharose Fast Flow填料，美國(guó)Cytiva公司；Sephadex G-50填料以及各規(guī)格單糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），批號(hào)FI190025，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；三氟乙酸（TFA），批號(hào)RH240475，廣州蘇維化工有限公司；抗壞血酸（維生素C，VC），批號(hào)20200520，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH），批號(hào)C12550543，上海麥克林公司；2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS，批號(hào)091021220530）、熒光紅染料（Ample Red，批號(hào)030722220414）、MTT（批號(hào)020328905117）、DAPI染色液（批號(hào)021119313462），均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司；色譜級(jí)乙腈，美國(guó)Sigma公司；胎牛血清（FBS，批號(hào)2148389）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)8122030），均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210619）、過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210801）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210716），均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗多糖的提取

工業(yè)生產(chǎn)中常用70%乙醇提取三七皂苷，用大孔樹脂純化皂苷，而多糖等其他大分子有效成分仍留在廢渣、廢液中，未得到有效利用。參照于少朋等[7]的方法，取三七藥渣200 g，粉碎后過80目篩，加入20倍體積的蒸餾水，浸泡4 h，75 ℃提取3次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮至總體積的1/5，4500 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min，棄沉淀，使用Sevage法[8]脫蛋白質(zhì)。然后加入3倍體積無水乙醇，4 ℃靜置24 h使其完全沉淀，4500 r/min（離心半徑為13.5 cm）離心10 min，將離心后的多糖加水復(fù)溶后在60 ℃水浴揮發(fā)至無明顯的乙醇?xì)馕叮肝觯劢亓粝鄬?duì)分子質(zhì)量（w）3500］后凍干得粗多糖。計(jì)算粗多糖提取率（提取率＝凍干粗多糖質(zhì)量/三七藥渣質(zhì)量），重復(fù)3次取平均值。粗多糖提取流程見圖1，得率為3.12%。

2.2 粗多糖的分離純化

將粗多糖溶解在蒸餾水中，配制成10 mg/mL溶液，使用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱（60 cm×4 cm，體積流量1 mL/min，0～1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫）、Sephadex G-50葡聚糖凝膠色譜柱（110 cm×2.4 cm，體積流量0.5 mL/min，0.1 mol/L NaCl洗脫）對(duì)粗多糖進(jìn)一步純化。以每管10 mL收集洗脫液，苯酚-硫酸法[9]檢測(cè)洗脫液490 nm處吸光度（）值并繪制洗脫曲線。根據(jù)洗脫曲線收集樣品，透析（截留w3500），真空冷凍干燥。將多糖組分制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，200～400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外掃描，檢測(cè)樣品中核酸、蛋白質(zhì)及肽類等雜質(zhì)的含量。經(jīng)過進(jìn)一步分離純化得到粗多糖中主要含有3個(gè)組分PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3，洗脫曲線見圖2，得率分別為10.26%、32.15%、23.27%。各組分多糖通過紫外吸收光譜全波長(zhǎng)掃描后，均在260、280 nm處均無明顯吸收峰，表明純化后的多糖組分不含核酸、蛋白質(zhì)及肽類等雜質(zhì)。

圖1 PNPS提取分離工藝流程和DEAE Sepharose Fast Flow瓊脂糖凝膠柱洗脫曲線

圖2 多糖組分Sephadex G-50凝膠柱的洗脫曲線

2.3 多糖組分的初級(jí)結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 多糖組分純度和w測(cè)定 精密稱定樣品和對(duì)照品5.0 mg，樣品配制成5.0 mg/mL溶液，12 000 r/min（離心半徑為 6.3 cm）離心10 min，取上清液過濾（0.22 μm），通過HPGPC測(cè)定多糖w和純度。色譜條件：色譜柱為BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（300 mm×8 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L NaCl溶液；體積流量0.6 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)器：RI-10A示差檢測(cè)器；lgw-R校正曲線方程為lgw＝12.27－0.193 7R，2＝0.992 9。結(jié)果（圖3）表明，3個(gè)多糖組分均為單峰，PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3均為純度較高的均一多糖，w分別為29 152、173 876、104 201。

圖3 多糖組分HPGPC色譜圖

2.3.2 多糖組分的SEM分析 取少量各組分多糖的凍干粉末均勻粘在導(dǎo)電膠上，真空噴金制樣，操作電壓為3.0 kV，觀察其微觀結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖4所示，各組分多糖的表面基本相似，PNPS-0.2和PNPS- 0.3表面光滑絲狀，PNPS-0相比于PNPS-0.2和PNPS-0.3表面稍粗糙，沒有明顯的微觀形態(tài)變化。

圖4 多糖組分SEM圖(比例尺1 μm)

2.3.3 多糖組分的FT-IR分析 將2 mg多糖樣品與200 mg干燥KBr一起研磨混勻，用壓片機(jī)壓成薄片后用FT-IR光譜儀在4000～500 cm?1進(jìn)行掃描，記錄掃描圖譜。結(jié)果如圖5所示，約在3415 cm?1為多糖的-OH伸縮振動(dòng)特征峰；在2929 cm?1附近為-C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰。約在1741 cm?1和1630 cm?1處由酯羰基（-COOR）和羧酸酯（-COO?）伸縮振動(dòng)造成的吸收峰在3組分多糖中區(qū)別尤為明顯，提示PNPS-0.2、PNPS-0.3中含有羧基官能團(tuán)[10]。約在906 cm?1處的吸收峰，表明存在-吡喃葡萄糖基[11]。在964～1147 cm?1的值表示含有吡喃糖單位[12]，約在1248 cm?1為糖醛酸單元的羧酸部分吸收峰，約在1020、1108 cm?1處相對(duì)強(qiáng)的吸收峰，代表糖醛酸含量[13]，得出PNPS-0.3中糖醛酸含量較高。

圖5 多糖組分FT-IR圖譜

2.3.4 多糖組分的單糖組成分析 采用PMP柱前衍生化的方法[14]分析單糖組成。單糖對(duì)照品的制備：精密稱定甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖各標(biāo)準(zhǔn)單糖5.0 mg，溶于8 mL濃氨水中，取800 μL加入等體積PMP（0.5 mol/L），70 ℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，加入3 mL的水，置于55 ℃真空干燥箱揮干，加水重復(fù)2次。加入1 mL去離子水和1 mL氯仿，渦旋萃取3～5次除去多余的PMP，收集上層水相，濾過（0.22 μm），待用。多糖組分樣品制備：參考Qiao等方法[15]，精密稱定5.0 mg多糖，加入2 mL TFA（4 mol/L），120 ℃油浴攪拌6 h至溶液澄清透明，冷卻至室溫。揮干TFA。隨后將水解產(chǎn)物溶于300 μL濃氨水，渦旋混勻。按上述單糖衍生化方法處理，待用。

色譜條件：依利特E3121805色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動(dòng)相配比為磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.7）-乙腈（83∶17），體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。結(jié)果如圖6所示，3種多糖具有不同的單糖組成和比例。如表1所示，其中PNPS-0主要由-葡萄糖和-半乳糖組成，物質(zhì)的量占比分別為52.58%和34.14%；PNPS-0.2主要由-半乳糖、-阿拉伯糖和-葡萄糖組成，物質(zhì)的量占比分別為40.89%、19.38%和12.25%；PNPS-0.3主要由-葡萄糖醛酸、-半乳糖和-葡萄糖組成，物質(zhì)的量占比分別為40.43%、22.61%、18.32%。就糖醛酸含量而言，PNPS-0.3中含量最高為42.26%（物質(zhì)的量占比），明顯高于前兩者，與FT-IR結(jié)果一致。

A-混合對(duì)照品 B-PNPS-0 C-PNPS-0.2 D-PNPS-0.3 1-PMP 2-Man 3-Rham 4-GalUA 5-GlcUA 6-Glc 7-Gal 8-Xyl 9-Ara

表1 單糖組成

2.4 多糖組分體外抗氧化活性研究

以VC為陽(yáng)性對(duì)照，去離子水為空白對(duì)照進(jìn)行下列抗氧化活性評(píng)價(jià)。

2.4.1 DPPH自由基清除活性測(cè)定 分別準(zhǔn)確配制0～5 mg/mL濃度梯度的多糖樣品，參考Fan等[16]的方法，取500 μL樣品加入500 μL的DPPH溶液，避光渦旋混勻，放置30 min，5000 r/min（離心半徑為6.3cm）離心10 min。取上清液于517 nm下測(cè)值，按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率＝1－(1－2)/3

結(jié)果如表2所示，陽(yáng)性對(duì)照VC在5 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率為90.07%。PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3在1～5 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除率能力，且呈明顯濃度相關(guān)性。相同劑量下，活性為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0。PNPS-0.3表現(xiàn)出最強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，IC50值為2.94 mg/mL。PNPS-0.3（5 mg/mL）對(duì)DPPH自由的清除能力比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高8.49%、28.55%（＜0.01）。

2.4.2 OH?自由基清除能力測(cè)定 分別準(zhǔn)確配制0～5 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的多糖樣品，參考Xie等[17]方法，取500 μL樣品，依次加入等體積6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液、8 mmol/L H2O2溶液（啟動(dòng)反應(yīng)），37 ℃水浴加熱60 min，于510 nm測(cè)定值。按“2.4.1”項(xiàng)公式計(jì)算羥基自由基的清除率。

表2 多糖組分對(duì)DPPH自由基的清除能力(, n = 3)

與PNPS-0組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001；與PNPS-0.2組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001，下表同

*< 0.05**< 0.01***< 0.001PNPS-0 group;#< 0.05##< 0.01###< 0.001PNPS-0.2 group, same as below tables

結(jié)果如表3所示，陽(yáng)性對(duì)照VC在5 mg/mL時(shí)，對(duì)OH?自由基的清除率為96.09%。PNPS-0、PNPS- 0.2、PNPS-0.3在1～5 mg/mL時(shí)對(duì)OH?自由基均具有一定的清除率能力，且呈明顯濃度相關(guān)性。相同劑量下，活性為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0。PNPS-0.3表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化活性，IC50為0.97 mg/mL。PNPS-0.3（5 mg/mL）對(duì)OH?自由基的清除能力比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高22.23%、53.59%（＜0.01）。

2.4.3 ABTS自由基清除活性測(cè)定 參考He等[18]方法，將0～5 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的多糖樣品10 μL加入200 μL ABTS工作液，室溫避光孵育6 min，于734 nm下測(cè)值。按“2.4.1”項(xiàng)計(jì)算ABTS自由基清除率。

結(jié)果如表4所示，陽(yáng)性對(duì)照VC在5 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率分別為98.73%。PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3在1～5 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基均具有一定的清除能力，且呈明顯濃度相關(guān)性。相同劑量下，活性為PNPS-0.3＞PNPS- 0.2＞PNPS-0。PNPS-0.3表現(xiàn)出最強(qiáng)的ABTS自由基清除能力，IC50值為2.15 mg/mL。PNPS-0.3（5 mg/mL）對(duì)ABTS自由基的清除能力比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高2.07%、34.48%（＜0.01）。

2.4.4 總還原力測(cè)定 參考Huo等[19]的方法，分別吸取0～5 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的多糖樣品溶液250 μL，加入等體積的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃條件下孵育20 min，隨后加入250 μL 10%三氯乙酸，4000 r/min（離心半徑為6.3 cm）離心10 min，取上清液500 μL，加入等體積0.1%三氯化鐵，在700 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)值。檢測(cè)獲得的值即為總還原力。

表3 多糖組分對(duì)OH?自由基的清除能力(, n = 3)

表4 多糖組分對(duì)ABTS自由基的清除能力(, n = 3)

結(jié)果如表5所示，相同劑量下，各組分多糖的總還原能力為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0，與體外自由基清除趨勢(shì)一致。

2.4.5 順磁共振波譜檢測(cè)多糖組分對(duì)DPPH、OH?、超氧陰離子自由基的清除能力 將各組分多糖配置成5 mg/mL溶液，參考Romanet等[20]的方法，取等量的分散液和捕獲劑混合，再用毛細(xì)管吸取適量混合液，加入石英管后插入樣品腔。以自由基捕獲劑5,5-二甲基-1-吡咯啉--氧化物（5,5-dimethyl- 1-pyrroline-oxide，DMPO）為對(duì)照，對(duì)樣品進(jìn)行掃譜，通過EPR譜圖分析各組分多糖對(duì)DPPH自由基、OH?自由基、超氧陰離子自由基的清除能力。

EPR結(jié)果顯示（圖7），各組分多糖對(duì)DPPH自由基、OH?自由基、超氧陰離子自由基存在一定的清除能力，其中PNPS-0.3的清除能力最強(qiáng)，與體外自由基清除趨勢(shì)一致。

表5 多糖組分的總還原能力(, n = 3)

圖7 各組分多糖EPR抗氧化分析

2.5 多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的研究

2.5.1 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.5.2 多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 參考Wang等[21]的方法，將指數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種在96孔板中。12 h后給藥（多糖終質(zhì)量濃度為0～200 μg/mL），培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL H2O2溶液（終濃度800 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)2 h，參照Yuzbasioglu等[22]的方法進(jìn)行MTT檢測(cè)，結(jié)果見圖8。結(jié)果H2O2處理組細(xì)胞存活率為50.27%，如表6所示，各組分多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷均具有一定的保護(hù)作用，而且呈現(xiàn)出濃度相關(guān)性。其中PNPS-0.3對(duì)氧化損傷的保護(hù)效果最好，在給藥質(zhì)量濃度200 μg/mL時(shí)，其細(xì)胞存活率比PNPS-0.2、PNPS-0分別提高了9.98%、32.29%（＜0.05）。

2.5.3 多糖對(duì)RW264.7細(xì)胞液抗氧化酶活性的影響 將RAW264.7細(xì)胞（2×104個(gè)/孔）接種到96孔板中。12 h后給藥（多糖終質(zhì)量濃度為0、50、100、200 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再用H2O2（400 μmol/L）培養(yǎng)2 h。然后收集培養(yǎng)基上清液，參考Zhou等[23]的方法，測(cè)定細(xì)胞液中SOD、CAT、GSH- Px含量。結(jié)果細(xì)胞液中SOD、CAT、GSH-Px 3種抗氧化酶水平分別為未處理組：（7.13±0.21）U/mL、（14.87±0.21）U/mL、（62.62±0.10）μmol/mL；H2O2處理組：（2.47±0.21）U/mL、（6.85±0.24）U/mL、（29.97±1.81）μmol/mL。

圖8 給藥24 h細(xì)胞狀態(tài)(比例尺40 μm)

表6 多糖對(duì)H2O2氧化損傷RAW264.7細(xì)胞保護(hù)作用(, n = 3)

如表7所示，多糖組分能顯著提升細(xì)胞液中SOD、CAT、GSH-Px 3種抗氧化酶水平，減輕H2O2對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷的程度[24]?？寡趸男Ч憩F(xiàn)為PNPS-0.3＞PNPS-0.2＞PNPS-0，并呈現(xiàn)明顯量效關(guān)系。質(zhì)量濃度200 μg/mL時(shí)，PNPS-0.3處理組細(xì)胞液中SOD、CAT、GSH-Px 3種抗氧化酶水平比PNPS-0.2組分別增加5.26%、7.42%、4.99%（＜0.05）；比PNPS-0組分別增加32.7%、15.76%、16.83%（＜0.05），說明其展現(xiàn)出良好的抗細(xì)胞氧化損傷能力。

表7 多糖組分對(duì)RAW264.7細(xì)胞液中SOD、CAT、GSH-Px含量的影響(, n = 3)

2.5.4 多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)的熒光定性及定量分析 參考Zhao等[25]的方法，采用“2.4.3”項(xiàng)方法處理細(xì)胞，隨后加入熒光紅染料，37 ℃孵育30 min，用PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定，并用DAPI染色10 min。然后使用激光共聚焦顯微鏡，在激發(fā)波長(zhǎng)570 nm下觀察不同處理?xiàng)l件下的紅色熒光強(qiáng)度，以未處理（空白）組，H2O2處理（對(duì)照）組為參照，做定性分析。按照上述方法，細(xì)胞培養(yǎng)在黑色96孔板中，使用多功能酶標(biāo)儀對(duì)不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞（激發(fā)波長(zhǎng)570 nm，發(fā)射波長(zhǎng)585 nm）進(jìn)行熒光定量分析。采用熒光探針（紅色）標(biāo)記H2O2[26]。結(jié)果顯示，經(jīng)不同多糖處理后，紅色熒光強(qiáng)度：對(duì)照＞PNPS-0＞PNPS-0.2＞PNPS- 0.3＞空白（圖9），進(jìn)一步證明多糖在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷中發(fā)揮著有效的保護(hù)作用。

進(jìn)一步，通過定量分析可知（表8），PNPS-0.3在給藥質(zhì)量濃度200 μg/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度僅為Con組的27.43%，與Blank組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其相對(duì)熒光定量指標(biāo)比PNPS-0.2、PNPS-0分別降低了17.84%、61.82%（＜0.05）。

圖9 各組分多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)的熒光定性分析(比例尺20 μm)

表8 各組分多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷保護(hù)的熒光定量分析(, n = 3)

與對(duì)照組比較：*＜0.05***＜0.001；與PNPS-0組比較：###＜0.001；與PNPS-0.2組比較：ΔΔΔ＜0.001

*< 0.05***< 0.001control group;###< 0.001PNPS-0 group;ΔΔΔ< 0.001PNPS-0.2 group

3 討論

隨著心腦血管疾病日益年輕化，三七藥材的用量也日益增加，但近年來，可供種植的道地產(chǎn)區(qū)日益缺少，加之其種植采收加工消耗大量人力物力，三七藥材的品質(zhì)保證以及綜合利用刻不容緩，三七藥渣資源的二次開發(fā)利用對(duì)三七產(chǎn)業(yè)的延續(xù)至關(guān)重要[27]。如果能在三七皂苷生產(chǎn)線的下游搭建三七多糖的生產(chǎn)線，則既能實(shí)現(xiàn)三七原藥材-三七藥渣-藥渣提取物之間的質(zhì)量傳遞[28-29]，使三七藥材的生物利用度達(dá)到最大化；又能對(duì)2種產(chǎn)品同時(shí)溯源藥 材[30-32]，同時(shí)保證三七皂苷、多糖兩者的品質(zhì)，提高三七藥材的藥用價(jià)值。

三七作為大宗藥材，其多糖成分已經(jīng)得到廣泛的研究。Feng等[33]的從三七根中提取分離得到2種新型多糖，均由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖4種單糖組成，研究表明這兩種多糖在體外表現(xiàn)出相對(duì)較低的抗氧化能力，但對(duì)秀麗隱桿線蟲的氧化應(yīng)激有很強(qiáng)的保護(hù)作用。本課題組在前期的研究工作中提取分離得到1種三七多糖[34]，由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和半乳糖5種單糖組成，研究表明該多糖能提升小鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px含量，防止過氧化物的積累。本研究得出，經(jīng)過醇溶劑和高溫提取皂苷后的藥渣，提取出的多糖仍具有抗氧化活性，說明醇提皂苷的過程不會(huì)影響三七藥材中三七多糖的活性。但提取得到的三七多糖單糖組成發(fā)生變化，這種藥材-藥渣之間的差異性值得深思。

本研究結(jié)果表明，三七藥渣中粗多糖的提取率約為3%。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，每年因皂苷提取所產(chǎn)生的三七藥渣約為1000 t，若處理不當(dāng)，約有30 t以上的活性多糖被廢棄[34]。因此，對(duì)三七藥渣中活性成分進(jìn)行資源回收和二次加工利用，對(duì)三七產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展無疑具有重要意義。

多糖作為天然高分子化合物，其生物活性與w大小、官能團(tuán)差異以及單糖的組成及連接方式有關(guān)[35-36]。尤其是多糖中的糖醛酸含量和w大小與其生理活性密切相關(guān)。Chen等[37]和He等[38]的研究均表明，有相似結(jié)構(gòu)特性的2種多糖，隨著糖醛酸含量的增加，對(duì)活性氧清除能力也會(huì)增強(qiáng)。其原因在于：一方面，糖醛酸含量較高的組分中大量存在的羧基更易于激活異頭氫原子與自由基反應(yīng)[39-40]；另一方面，糖醛酸可通過增加巨噬細(xì)胞血紅素加氧酶（HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基（GCLC）以及抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而激活核因子-紅細(xì)胞2 p45相關(guān)因子2（Nrf2），刺激巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出抗氧化特性[41-42]。You等[43]和Sun等[44]在對(duì)不同w多糖進(jìn)行抗氧化對(duì)比研究時(shí)，得出位于較大w和較小w之間的多糖具有最強(qiáng)的抗氧化活性。一般來說，w在3000～100 000時(shí)多糖抗氧化活性最佳[45]。其可能歸因于w太大會(huì)導(dǎo)致活性位點(diǎn)不易暴露，從而限制其抗氧化活性；然而若是w太小，則存在的活性官能團(tuán)太少，又會(huì)使抗氧化活性不佳[46-47]。

本研究從三七藥渣中分離純化得到3種單一組分多糖PNPS-0、PNPS-0.2、PNPS-0.3。分析單糖組成可知，各多糖組分均含有-甘露糖、-鼠李糖、-葡萄糖、-半乳糖、-阿拉伯糖。PNPS-0幾乎不含有糖醛酸，w為29 152；PNPS-0.2和PNPS-0.3為酸性多糖，含有-半乳糖醛酸和-葡萄糖醛酸，w分別為173 876和104 201。其中，PNPS-0.3的糖醛酸含量最高，其含量比PNPS-0.2提高27.58%。因此，適中的w和更高的糖醛酸含量導(dǎo)致PNPS-0.3表現(xiàn)出優(yōu)于PNPS-0.2和PNPS-0的抗氧化活性。本研究表明，在相同的質(zhì)量濃度下，PNPS-0.3對(duì)不同種類的自由基均具良好的清除活性，且清除能力優(yōu)于PNPS-0.2和PNPS-0。進(jìn)一步在細(xì)胞水平上，本實(shí)驗(yàn)也通過檢測(cè)細(xì)胞抗氧化酶指標(biāo)和進(jìn)行熒光分析，得到了相同的結(jié)果。

綜上所述，本研究以資源二次開發(fā)利用為切入點(diǎn)，對(duì)三七藥渣中的多糖資源進(jìn)行了深入挖掘，明確了其抗氧化能力，并初步闡明了結(jié)構(gòu)和活性之間內(nèi)在關(guān)聯(lián)，可為中藥材資源可持續(xù)開發(fā)利用提供新的研究思路和研究視角。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Separation and purification of polysaccharides fromresidues and its antioxidant activities

CAO Yu-biao1, 2, SUN Liang-liang1, 2, YANG Ye1, 2, CUI Xiu-ming1, 2, QIU Bin3, WANG Cheng-xiao1, 2

1. School of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory of Sustainable Development and Utilization ofResources, Kunming 650500, China 3. School of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

To separate and purify the main polysaccharide components fromresidues, analyze its monosaccharide composition and compare its antioxidant activities.The crude polysaccharides fromresidues (PNPS) were extracted by water extraction and alcohol precipitation, and separated and purified by DEAE Fast Flow anion exchange column and Sephadex G-50 column. The relative molecular mass was analyzed by HPGPC and the monosaccharide composition and primary structure were preliminarily identified by scanning electron microscope (SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), HPLC of derivatizing method. The antioxidant capacity and the protective effect of polysaccharide components on oxidative damage of RAW264.7 cells were explored.Three polysaccharide components (PNPS-0, PNPS-0.2, and PNPS-0.3) were isolated and purified. There were differences in monosaccharide composition and proportion among the three: PNPS-0 was mainly composed of-glucose (52.28%) and-galactose (34.14%), PNPS-0.2 was mainly composed of-galactose (40.89%),-arabinose (19.38%) and-glucose (12.25%) and PNPS-0.3 was mainly composed of-glucuronic acid (40.43%),-galactose (22.61%) and-glucose (18.32%). The antioxidant results showed that PNPS-0.3 had the strongest total reducing ability, the highest scavenging activity on DPPH free radical, OH?free radical, ABTS free radical and superoxide anion free radical, and the protective effect on oxidative damage of RAW 264.7 cells was the best in a concentration dependent manner.Three polysaccharide fragments with antioxidant activity were obtained fromresidues. The antioxidant activity was closely related to the structure and composition of polysaccharide. Therefore, this study provides a new research idea for the secondary development and utilization ofresources.

(Burk.) F. H. Chen; polysaccharide; structure-activity relationship; monosaccharide composition; antioxidant; Chinese medicine residue; high performance gel permeation chromatography;-glucose;-galactose;-arabinose;-glucuronic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)01 - 0100 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.01.013

2022-07-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81760642）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（82060645）；云南省科技重大專項(xiàng)（202002AA100004-2）；云南省科技重大專項(xiàng)（202102AA310045）；云南省科技重大專項(xiàng)（202002AA1000056）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目（202101AT070099）

曹玉標(biāo)（1993—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幧锘钚猿煞?。E-mail: 1500109072@qq.com

通信作者：邱 斌（1976—），男，碩士，正高級(jí)工程師，從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: yyqiubin@aliyun.com

王承瀟（1985—），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥資源的綜合開發(fā)和合理利用研究。E-mail: wcx1192002@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]