不同品質(zhì)煙葉微生物群落與其揮發(fā)性成分的關(guān)聯(lián)研究

黃賀敏，吳麗香，鄧梅忠，王雨晴，張 雯，陳善義，張恩仁，詹仁鋒，方 璟，倪 莉，李菁菁*

（1.福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108；2.福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350108；3.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，福建 廈門 361021）

醇化是煙葉加工過程中的重要步驟，對(duì)煙葉的品質(zhì)影響尤為突出。微生物作為煙葉醇化過程中的主要生物驅(qū)動(dòng)力，可參與煙葉中蛋白質(zhì)、煙堿和香氣前體物質(zhì)等分解轉(zhuǎn)化[1]，促進(jìn)煙葉本身獨(dú)特風(fēng)味的形成，從而提升煙葉品質(zhì)。

近年來，學(xué)者們對(duì)煙葉醇化中的微生物群落結(jié)構(gòu)、微生物菌群及其功能特征進(jìn)行了相關(guān)研究。Huang等分別對(duì)未醇化和已醇化的K326 烤煙細(xì)菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌（Sphingomonassp.）等可促進(jìn)煙葉醇化進(jìn)程[2]；而醇化后的津巴布韋煙葉中微生物群落主要以假單胞菌屬 （Pseudomonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和丘氏菌屬（Buttiauxella izardii）為主導(dǎo)，具有改善煙葉品質(zhì)的潛力[3]。煙葉中化學(xué)成分含量的差異直接決定煙葉香吃味的形成，且與微生物作用相關(guān)。Zhang 等明確了云南和河南烤煙的差異成分為綠原酸、西柏烷類致香物質(zhì)（α-和β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇）[4]，而高通量測(cè)序表征河南和云南煙葉中優(yōu)勢(shì)菌群分別為棲熱菌屬（Thermus）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、經(jīng)黏液真桿菌屬（Blautia）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus），且兩產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌群在芳香化合物代謝方面存在差異[5]。此外，Zhang 等對(duì)烤煙香型風(fēng)格與微生物菌群進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)黃單胞菌屬（Xanthomonas）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、枝孢屬（Cladosporium）、洛德酵母屬（Lodderomyces）均與清香型風(fēng)格顯著正相關(guān)，而鐮刀菌（Fusarium）、叢赤殼菌屬（Cryphonectria）和青霉（Cyanodermella）與濃香型風(fēng)格呈顯著正相關(guān)[6]。

由此可見，煙葉中存在豐富多樣的微生物菌群，且其多樣性與煙葉的風(fēng)味和品質(zhì)可能存在著關(guān)聯(lián)。為此，以來自福建和云南兩個(gè)產(chǎn)地上等煙、中等煙和下等煙為研究對(duì)象，解析煙葉中細(xì)菌和真菌群落組成及多樣性，并通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法分析微生物群落與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性，旨在解析促進(jìn)煙葉香韻特征形成的關(guān)鍵微生物，為篩選和利用關(guān)鍵微生物改善煙葉品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙葉樣品：福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供，分別為福建和云南的上等煙、中等煙和下等煙各2份（具體信息見表1）。采集的樣品混合均勻轉(zhuǎn)移至無菌袋中置于-4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品信息Table 1 Sample information

50/30 μm DVB/CAR/PDMS 和Stableflex 固相微萃取頭：默克Supelco 公司產(chǎn)品；Agilent 5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）：美國安捷倫科技公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品DNA 提取和Illumina MiSeq 測(cè)序稱取10 g 煙葉于錐形瓶中，加入60 mL PBS（pH 7.4）溶液，200 r/min 振蕩40 min；取40 mL PBS 緩沖液少量多次沖洗煙葉，收集總洗滌液，經(jīng)超濾（0.22 μm）富集濾膜上的菌泥，用于基因組DNA 抽提。

經(jīng)1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA 質(zhì)量后，使用引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′） 對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3-V4 可變區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；使用引物ITS1F （5′-CTTGGTCATT TAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTT CATCGATGC-3′） 對(duì)真菌ITS 區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增。于QuantiFluorTM-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)確定樣本測(cè)序量，進(jìn)行Miseq 文庫構(gòu)建和Illumina MiSeq 測(cè)序。Illumina MiSeq 高通量測(cè)序與序列處理由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.2.2 生物信息學(xué)分析于Illumina Miseq 平臺(tái)獲得片段經(jīng)拼接、質(zhì)控和過濾，選取OTU 序列相似度為97%以上并進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析。基于分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫SILVA/16S rRNA，使用Uparse 和RDP Classifier 軟件在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。在上述分析的基礎(chǔ)上，通過R 語言進(jìn)一步對(duì)樣本進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal co-ordinatesanalysis，PCoA）差異計(jì)算及顯著性檢驗(yàn)等一系列可視化分析。

1.2.3 煙葉揮發(fā)性成分測(cè)定1）樣品萃取條件稱取0.400 g 煙葉粉末于頂空進(jìn)樣瓶中，加入3 μL 混標(biāo)。將頂空瓶放置在CTC 自動(dòng)進(jìn)樣盤中。萃取參數(shù)設(shè)定為：100 ℃恒溫10 min，頂空吸附萃取40 min后，于GC-MS 進(jìn)樣口處250 ℃解吸4 min。

2）色譜柱 HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm），氦氣流量為1 mL/min。升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持2 min，以8 ℃/min 升至280 ℃，保持25 min；后運(yùn)行溫度280 ℃，后運(yùn)行時(shí)間5 min。不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時(shí)間4 min。

3）MS 條件采用全掃描模式（m/z30～550）進(jìn)行采集，離子源溫度和四級(jí)桿溫度分別為230 ℃和150 ℃。

將檢測(cè)到揮發(fā)性成分的質(zhì)譜信息結(jié)合NIST 14標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性確定，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各組分定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 計(jì)算數(shù)據(jù)的平均值和誤差。通過SIMCA 對(duì)煙葉中揮發(fā)性成分進(jìn)行PLS-DA 分析。使用STAMP （ver2.1.3） 對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 及P＜0.01 均為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聚類熱圖于https：//www.omicstudio.cn 網(wǎng)站上使用OmicStudio 工具繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品質(zhì)煙葉表面細(xì)菌菌群的特征

通過Illumina MiSeq 測(cè)序分析不同品質(zhì)煙葉表面的細(xì)菌群落，共獲得690 929 條有效序列?；谙嗨贫却笥?7%，將整個(gè)樣本序列進(jìn)行優(yōu)化和歸類后，注釋到33 個(gè)門，839 個(gè)屬，1 984 個(gè)OTU。由圖1可知，在相對(duì)豐度大于5%水平上，主要為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteriota）；其中貪噬菌屬（Variovorax，11.02%）、鞘氨醇單胞菌屬（Spingomonas，8.01%）、假單胞菌屬 （Pseudomonas，7.78% ）、腸桿菌屬（Enterobacter，6.60% ）、芽孢桿菌屬（Bacillus，6.34%）為相對(duì)豐度占比前5 的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬。

圖1 不同品質(zhì)煙葉表面細(xì)菌群落的相對(duì)豐度柱形圖Fig.1 Column diagram of relative abundance of bacterial communities on the surface of different quality tobacco

相對(duì)豐度最高的貪噬菌屬在上等煙和中等煙中的占比高于下等煙。在煙葉醇化的相關(guān)研究中鮮有關(guān)于貪噬菌屬的報(bào)道，貪噬菌作為一種附生和內(nèi)生菌，常在植物的根際和葉際中被發(fā)現(xiàn)，具有促進(jìn)植物生長的潛力[7]；貪噬菌屬還在生物修復(fù)方面發(fā)揮重要優(yōu)勢(shì)[8]，對(duì)芳香族化合物中硝基苯、苯酚等均有降解作用。鞘氨醇單胞菌屬（Spingomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）為煙葉中普遍存在的功能細(xì)菌微生物[9-10]。鞘氨醇單胞菌屬對(duì)呋喃和芳香烴等物質(zhì)降解以及合成類胡蘿卜素等方面的貢獻(xiàn)尤為突出[11]。芽孢桿菌屬表現(xiàn)出綜合產(chǎn)酶潛力，可產(chǎn)生蛋白酶[12]、纖維素酶[13]、淀粉酶[14]等，進(jìn)而降低煙葉中雜氣物質(zhì)，減輕刺激性氣味。假單胞菌屬為調(diào)控?zé)熑~中尼古丁的主要微生物，可降低煙葉中尼古丁含量[15]，并對(duì)芳烴、碳?xì)浠衔?、脂肪族化合物和木質(zhì)素的降解發(fā)揮著重要作用[16]，可強(qiáng)化煙葉的品質(zhì)并保證安全性?？偠灾?，豐富多樣的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群有利于煙葉中基質(zhì)成分的轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)煙葉的品質(zhì)形成。

根據(jù)細(xì)菌群落在屬水平上的豐度信息進(jìn)行PCoA 以表征不同品質(zhì)煙葉中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，結(jié)果見圖2（a）。細(xì)菌群落的多樣性與地域和煙葉品質(zhì)均有關(guān)系，上等煙和中等煙細(xì)菌群落相似，與下等煙存在差異，樣品分在了PC1 軸兩側(cè)；而云南和福建的煙葉樣品被分在了PC2 軸兩側(cè)。

進(jìn)一步通過Welch’st檢驗(yàn)分析煙葉細(xì)菌菌群在屬水平上的差異性，比較不同等級(jí)煙葉中相對(duì)豐度排在前10 位且差異顯著的細(xì)菌物種，結(jié)果見圖2（b）。上、中等與下等煙的差異菌屬主要為貪噬菌屬（Variovorax）、鞘氨醇單胞菌屬（Spingomonas）、紅球菌屬 （Rhodococcus）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia），且這些差異菌屬在上、中等煙葉樣品中的相對(duì)豐度顯著高于下等煙。根據(jù)云南和福建煙葉中細(xì)菌菌群差異信息（見圖2（c）），發(fā)現(xiàn)差異細(xì)菌物種主要為假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、金色單胞菌屬（Aureimonas）、泛菌屬（Pantoea）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）等，其中金色單胞菌屬（Aureimonas）和類芽孢桿菌（Paenibacillus）在福建煙葉中明顯上調(diào)。

圖2 不同品質(zhì)煙葉表面細(xì)菌群落差異性分析Fig.2 Analysis of the difference of bacterial community on the surface of different quality tobacco

據(jù)研究報(bào)道，紅球菌屬（Rhodococcus）在降解芳香族化合物方面具有優(yōu)勢(shì)性，對(duì)異戊二烯物質(zhì)具有降解作用[17]；而貪噬菌屬與類芽孢桿菌共存時(shí)可產(chǎn)生纖維素酶[18]，增加糖類含量，從而促進(jìn)煙葉醇化中非酶棕色反應(yīng)產(chǎn)生香氣。區(qū)域差異菌屬多為內(nèi)生菌，如泛菌屬（Pantoea）在水稻中被發(fā)現(xiàn)[19]；金色單胞菌（Aureimonas）于茶葉的內(nèi)生菌群中被發(fā)現(xiàn)[20]，對(duì)改善茶葉的品質(zhì)具有潛在作用，其在清香型煙葉以及許多產(chǎn)區(qū)的煙葉中均存在[6]，推測(cè)可能與煙葉的產(chǎn)香機(jī)制有著緊密的聯(lián)系；腸桿菌屬（Enterobacter）對(duì)煙堿、煙酸等具有降解潛力[16]。在煙葉醇化過程中這些優(yōu)勢(shì)差異細(xì)菌對(duì)煙葉中營養(yǎng)基質(zhì)成分的分解轉(zhuǎn)化和代謝作用在一定程度上導(dǎo)致了煙葉品質(zhì)差異，并體現(xiàn)出了地域差異。

2.2 不同品質(zhì)煙葉表面真菌菌群的特征

對(duì)12 個(gè)不同品質(zhì)煙葉表面真菌群落進(jìn)行分析，共獲得811 724 條有效序列，并注釋到10 個(gè)門，561 個(gè)屬，1 580 個(gè)OTU。選取相對(duì)豐度大于1%，由圖3（a）可知，真菌群落以子囊菌門（Basidiomycota）、擔(dān)子菌門（Ascomycota）為主。由圖3（b）可知，在屬水平上以桑帕約氏酵母（Sampaiozyma，28.43%）、曲霉（Aspergillus，24.51%）、枝孢霉屬（Cladosporium，9.50%）、鏈格孢霉屬（Alternaria，6.67%）等為主。煙葉中真菌群落物種的種類少于細(xì)菌群落，在不同品質(zhì)煙葉中真菌群落相對(duì)豐度無明顯差異。

圖3 不同等級(jí)煙葉真菌群落的相對(duì)豐度柱形圖Fig.3 Column diagram of relative abundance of fungal communities in different quality tobacco

桑帕約氏酵母作為煙葉樣品的第一優(yōu)勢(shì)真菌屬，有研究表明其為煙葉的內(nèi)生真菌[21]，屬于擔(dān)子菌門，但目前未有報(bào)道關(guān)于其在醇化煙葉中的具體功能特征。李治瀅等從云南星云湖水樣中分離出桑帕約氏酵母菌株可降解類胡蘿卜素類物質(zhì)[22]，而從異龍湖水樣中分離出的Sampaiozyma vanillica具有降解果膠、脂肪等能力[23]。桑帕約氏酵母顯示出和風(fēng)味相關(guān)的潛在價(jià)值，有待進(jìn)一步研究。曲霉在許多發(fā)酵食品中表現(xiàn)出具有降解糖類化合物和蛋白質(zhì)的作用[24-25]，從而促進(jìn)香味物質(zhì)合成。而枝孢霉、鏈格孢霉屬等為煙葉中常見的腐生真菌[26]，易導(dǎo)致煙葉發(fā)生霉變[27]，往往與煙葉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。

根據(jù)煙葉中真菌群落的豐度信息進(jìn)行PCoA，結(jié)果見圖4（a）。不同等級(jí)煙葉樣品中真菌群落區(qū)分度較低，僅與地域存在相關(guān)性。云南和福建的煙葉樣品被分在PC1 軸兩側(cè)，表明煙葉中真菌菌群主要與煙葉產(chǎn)區(qū)有關(guān)，不同等級(jí)煙葉中真菌群落的差異不明顯。采用Welch’st檢驗(yàn)對(duì)福建和云南的真菌菌群進(jìn)行差異分析，結(jié)果見圖4（b）。云南煙葉中曲霉（Aspergillus）、枝孢霉屬（Cladosporium）、鏈格孢霉屬（Alternaria）等霉菌類物種的相對(duì)豐度顯著高于福建煙葉，而福建煙葉中則以桑帕約氏酵母（Sampaiozyma） 以及樣品中相對(duì)豐度較低的物種為上調(diào)差異菌屬。煙葉中真菌群落差異性反映了不同地域煙葉中微生態(tài)特征。

圖4 不同品質(zhì)煙葉真菌群落差異性分析Fig.4 Difference analysis of fungal communities in different quality tobacco

2.3 不同品質(zhì)煙葉中揮發(fā)性香氣成分的特征

揮發(fā)性香氣成分是評(píng)價(jià)煙葉品質(zhì)的重要因素。通過SPME-GC/MS 檢測(cè)不同品質(zhì)煙葉樣品的揮發(fā)性化合物，結(jié)果見圖5。共測(cè)得62 種揮發(fā)性成分，包括16 種酮類、15 種酯類、9 種醇類、6 種酸類、6 種雜環(huán)類、5 種醛類和7 種其他物質(zhì)。酮類是形成煙葉細(xì)膩、清香特征的主要成分，而酯類成分對(duì)煙葉的香氣和吃味有一定的影響，可以增加煙氣的醇和感[28]。另外，福建和云南的樣品被分為兩類，且福建煙葉樣品中各揮發(fā)性成分的相對(duì)質(zhì)量濃度明顯高于云南煙葉。另外，由煙葉樣品的層級(jí)聚類可知，上等煙和中等煙的揮發(fā)性物質(zhì)差異不大，并與下等煙區(qū)分開，這一結(jié)果與細(xì)菌群落的分析結(jié)果具有相似性。而Hu 等在跟蹤烤煙中微生物群落和化學(xué)成分動(dòng)態(tài)變化特征時(shí)發(fā)現(xiàn)，煙草的物質(zhì)轉(zhuǎn)化規(guī)律與細(xì)菌群落的功能相對(duì)應(yīng)[29]。細(xì)菌群落對(duì)于煙葉物質(zhì)分解和轉(zhuǎn)化發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用，從而促進(jìn)煙葉香氣形成。

圖5 不同等級(jí)煙葉樣品揮發(fā)性成分聚類熱圖Fig.5 Cluster heat map of volatile components in different quality tobacco

為了更明確不同品質(zhì)和產(chǎn)地?zé)熑~中揮發(fā)性成分的差異，通過PLS-DA 模型按不同等級(jí)對(duì)煙葉中揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見圖6（a）。云南和福建煙葉的揮發(fā)性成分差異顯著，且不同產(chǎn)地的上等煙和中等煙的揮發(fā)性物質(zhì)差異不大，與下等煙樣品有較大差異。

基于PLS-DA 模型得到各個(gè)揮發(fā)性化合物的變量重要性投影值（VIP），用來衡量各揮發(fā)性成分對(duì)煙葉樣品分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力。如圖6（b）所示，VIP 值大于1（紫色）的揮發(fā)性成分共有23 種，主要為2-乙?；量?（C56）、5-甲基糠醛（C18）、麥斯明（C53）、5-羥甲基糠醛（C20）、巨豆三烯酮B（C12）、α-大馬酮（C7）、5-羥基麥芽酚（C26）、α-尼古?。–52）、香葉基芳樟醇（C29）、巨豆三烯酮A（C11）等。這些重要揮發(fā)性成分多為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，如呈甜味的α-大馬酮[30]、具有堅(jiān)果及煙草香的巨豆三烯酮類物質(zhì)[31]，可作為潛在風(fēng)味化合物對(duì)煙葉的整體香氣具有很好的調(diào)和與修飾作用。

將VIP 值大于1 的重要揮發(fā)性物質(zhì)于載荷圖中進(jìn)行標(biāo)注，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行差異分析。根據(jù)載荷圖（見圖6（c））可知，在福建的中、上等煙附近主要聚集了糠醛（C17）、5-羥甲基糠醛（C20）、5-甲基糠醛等具有焦糖香的物質(zhì)[32]，云南的中、上等煙附近則主要為香蘭素（C21）。其中，糠醛帶有果香和面包香，5-羥甲基糠醛帶有花香，5-甲基糠醛帶有甜味，突顯中、上等福建煙葉具有焦甜香、微弱花果香的特征；香蘭素帶有香草氣息且呈濃而甜的奶香[33]，賦予中、上等云南煙葉豐滿度和甜味的特征。而下等煙與α-尼古丁（C52）、麥斯明（C53）位置相近，且α-尼古丁和麥斯明在下等煙中含量較高，從而增加下等煙煙氣的刺激性和雜氣。由不同等級(jí)煙葉揮發(fā)性成分的差異分析發(fā)現(xiàn)（見圖6（d）），相較于下等煙，大部分重要揮發(fā)性成分（VIP ＞1）在中、上等煙中的相對(duì)含量有增加的趨勢(shì)，豐富中、上等煙的香氣特征。

圖6 不同品質(zhì)煙葉揮發(fā)性風(fēng)味成分PLS-DA 分析和差異性分析Fig.6 PLS-DA and difference analysis of volatile flavor components in different quality tobacco

2.4 煙葉表面菌群與其揮發(fā)性香氣物質(zhì)關(guān)聯(lián)分析

為進(jìn)一步明確微生物群落與揮發(fā)性成分之間的關(guān)系，選取屬水平上總相對(duì)豐度排在前10 位的細(xì)菌物種和前4 位的真菌物種，分別與煙葉中所有揮發(fā)性風(fēng)味成分（n=62，平均相對(duì)含量大于0.1%）計(jì)算Pearson 相關(guān)系數(shù)，采用Cytoscape 軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖7。揮發(fā)性成分和微生物之間共有168 個(gè)成對(duì)相關(guān)（|r| ＞0.6，P＜0.05），其中以紅線表示正相關(guān)，以藍(lán)線表示負(fù)相關(guān)。在這些揮發(fā)性化合物中的相關(guān)性分析中，44 種與細(xì)菌相關(guān)，33 種與真菌相關(guān)。

在細(xì)菌菌群和揮發(fā)性成分相關(guān)性分析中（見圖7（a））。金色單胞菌屬（Aureimonas）為與揮發(fā)性成分連接數(shù)最多的一種優(yōu)勢(shì)菌屬，與煙葉中14 種香氣物質(zhì)正相關(guān)，尤其是與煙葉中重要香氣物質(zhì)新植二烯具有較強(qiáng)相關(guān)性（|r| ＞0.7）。其次，芽孢桿菌屬（Bacillus）與煙葉中14 種香氣物質(zhì)有相關(guān)性，呈正相關(guān)有11 種，包括β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、香葉基丙酮、2-乙酰基吡咯，這些物質(zhì)多為類胡蘿卜素降解產(chǎn)物，有研究表明芽孢桿菌可以產(chǎn)生糖苷酶促進(jìn)煙葉中類胡蘿卜素等物質(zhì)降解[34-35]，這與前文結(jié)果一致。另外，紅球菌屬（Rhodococcus）和貪噬菌屬（Variovorax）共同表現(xiàn)出對(duì)5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛具有正向促進(jìn)作用，進(jìn)一步說明在中、上等煙中的優(yōu)勢(shì)微生物菌群對(duì)其香氣特征的形成具有一定貢獻(xiàn)。紅球菌屬（Rhodococcus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia）與煙葉中的α-尼古丁、麥斯明等煙堿類物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，其中Gong 等已明確紅球菌屬（Rhodococcus）對(duì)煙堿類物質(zhì)具有降解作用[36]，表明這幾類菌屬對(duì)煙堿類物質(zhì)有降解潛力。

圖7 不同等級(jí)煙葉揮發(fā)性成分與菌群的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of volatile components and flora in different quality tobacco leaves

在真菌群落和揮發(fā)性成分相關(guān)性分析中（見圖7（b）），連接數(shù)較多的菌屬為桑帕約氏酵母（Sampaiozyma）、枝孢霉屬（Cladosporium）和鏈格孢霉屬（Alternaria）。其中桑帕約氏酵母（Sampaiozyma）與煙葉的香氣成分連接數(shù)最多，涵蓋煙葉中大部分的香氣物質(zhì)。而枝孢霉屬（Cladosporium）和鏈格孢霉屬（Alternaria）與多種香氣物質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，表明枝孢霉屬（Cladosporium）和鏈格孢霉屬（Alternaria）不利于煙葉品質(zhì)形成。

3 結(jié) 語

煙葉中豐富多樣的微生物資源對(duì)其品質(zhì)形成具有重要影響。作者對(duì)煙葉表面的微生物群落和揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性香氣成分因煙葉品質(zhì)的不同而存在差異，在一定程度上闡明微生物與香氣品質(zhì)之間的關(guān)系。

煙葉中的細(xì)菌群落與香氣品質(zhì)更為相關(guān)。芽孢桿菌屬（Bacillus）作為主要優(yōu)勢(shì)物種，對(duì)類胡蘿卜素類物質(zhì)具有降解潛力，有助于煙葉香氣的形成。貪噬菌屬（Variovorax）、鞘氨醇單胞菌屬（Spingomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）為上、中等煙與下等煙的差異物種，與煙葉中多種重要揮發(fā)性香氣物質(zhì)相關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)紅球菌屬（Rhodococcus）可作為調(diào)控?zé)焿A類物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌源，可應(yīng)用于降解下等煙中較高含量的α-尼古丁。對(duì)于真菌群落，桑帕約氏酵母（Sampaiozyma） 對(duì)煙葉中多種香氣成分的形成具有積極作用，而枝孢霉屬（Cladosporium）和鏈格孢霉屬（Alternaria）與煙葉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。

研究結(jié)果表明煙葉微生物的種類和相對(duì)豐度對(duì)其香氣品質(zhì)具有重要的影響。挖掘煙草中的微生物資源，為提高煙草品質(zhì)、降低危害，利用微生物資源獲得煙草香味物質(zhì)提供理論參考。