鎘污染土壤中生物炭對紫花苜蓿鎘吸收、土壤性質(zhì)及氮礦化的影響

夏廣英， 高庚渠

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南平頂山 467000)

由于集約化農(nóng)業(yè)迅速發(fā)展和土壤地質(zhì)高背景，農(nóng)業(yè)土壤中重金屬污染程度日益嚴(yán)重，其中鎘(Cd)污染是脅迫農(nóng)田健康的主要重金屬之一[1]。鎘(Cd)具有高移動性和高毒害性等特征，可對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，同時通過食物鏈進一步威脅牲畜和人類健康，因此迫切需要采用生態(tài)友好的方法對污染土壤進行修復(fù)[2]。作為綠色友好的修復(fù)措施，植物修復(fù)技術(shù)可有效去除污染物[3]。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界范圍內(nèi)被廣泛用作修復(fù)重(類)金屬的功能植物，相對于其他修復(fù)植物紫花苜蓿具有根深蒂固、高產(chǎn)、耐旱等諸多明顯優(yōu)勢[4]。生物炭是廢棄物、畜禽糞便和污泥等生物質(zhì)材料在限氧或無氧條件下，經(jīng)熱裂解得到的一種富碳產(chǎn)品[5]。研究表明，生物炭由于其多孔結(jié)構(gòu)、較大的比表面積、較高的表面電荷密度以及高pH值，可以有效吸附和固定重金屬離子[6]，目前已廣泛運用于修復(fù)鎘(Cd)、鉛(Pb)、鉻(Cr)等金屬離子污染的土壤。

對于農(nóng)業(yè)土壤修復(fù)，除了去除或鈍化土壤污染物外，還應(yīng)關(guān)注土壤養(yǎng)分保持和生物地球化學(xué)循環(huán)的作用[7]。土壤養(yǎng)分受植物攝入量和根系分泌物調(diào)節(jié)，功能性植物可以通過改變土壤物理結(jié)構(gòu)來影響有機質(zhì)分解、養(yǎng)分釋放和土壤呼吸等[8]。因此，植物修復(fù)可以顯著改變受污染土壤的理化性質(zhì)，從而影響功能微生物的豐度，進而影響土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)[7，9]。土壤氮(N)礦化是地球生物化學(xué)N循環(huán)的重要過程，主要由功能性微生物介導(dǎo)[10]。作為N礦化的重要表征，蛋白酶在分解土壤蛋白質(zhì)以提供礦物質(zhì)氮方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]，編碼土壤蛋白酶的功能基因包括nprA和aprA基因，除蛋白酶外，幾丁質(zhì)酶亦參與了土壤有機質(zhì)中礦物N的釋放，微生物中編碼幾丁質(zhì)分解酶的關(guān)鍵功能基為chiA基因[12]。屬于水解酶的土壤蛋白酶和幾丁質(zhì)酶可以反映整個土壤微生物的活性，同時皆參與了污染物的轉(zhuǎn)化和降解[13]。眾多研究表明，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在恢復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)中扮演著極其重要的角色。

此外，功能性氨氧化古菌(AOA)和細菌(AOB)對土壤污染物反應(yīng)較為敏感，因此相對于其他生化過程，由于功能多樣性較低，土壤礦化對不同類型污染源的敏感性存在差異[14]。因此，N素礦化率(Rm)是反映功能微生物豐度、土壤理化性質(zhì)和污染物含量的重要表征，已被廣泛用作量化土壤環(huán)境質(zhì)量的有效指標(biāo)[7]。盡管一些研究已經(jīng)報道了污染土壤中N礦化速率的變化特征，然而很少有研究同時關(guān)注酶活性和相應(yīng)的功能基因豐度?；诖?，本研究通過盆栽試驗探討了Cd污染土壤中生物炭對紫花苜蓿鎘吸收、土壤性質(zhì)及氮礦化相關(guān)基因的影響，研究結(jié)果可為生物炭和植株修復(fù)廣泛運用于修復(fù)污染土壤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與材料

試驗于2021年4—7月在河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院研究場地溫室中進行，棚中晝/夜平均溫度為 28 ℃/19 ℃，相對濕度為75%。

供試紫花苜蓿種子來自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，紫花苜蓿種子在體積分數(shù)10%的過氧化氫溶液中進行表面消毒，在黑暗中潮濕的濾紙上催芽24 h。供試生物炭來自河南省生物炭工程技術(shù)研究中心，采用玉米和小麥秸稈(質(zhì)量比1 ∶2)在低氧、450 ℃條件下連續(xù)炭化60 min制得，其基本性質(zhì)為：全碳含量49.5%，總氮含量2.15%，比表面積為15.48 m2/g，容重為0.27 g/cm3，pH值為8.32，主要官能團為羥基、烷烴和酰胺基。

供試土壤取自河南省平頂山某鎘污染農(nóng)田土壤0～20 cm表層。土壤類型為褐土，pH值為8.06，土壤全Cd含量為5.28 mg/kg，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB 15618—1995)，pH值>7.5，Cd含量>1 mg/kg，即為鎘超標(biāo)，該農(nóng)田土壤Cd含量為限額的5.28倍。土壤理化性質(zhì)為：有機質(zhì)含量 20.26 g/kg，全氮含量1.05 g/kg、堿解氮含量140.86 mg/kg，有效磷含量17.52 mg/kg，速效鉀含量115.61 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用完全隨機設(shè)計，設(shè)置5個處理分別為，MX：單獨種植紫花苜蓿；MX+BC1：種植紫花苜蓿+1%生物炭；MX+BC2：種植紫花苜蓿+2%生物炭；MX+BC4：種植紫花苜蓿+4%生物炭；不種植苜蓿植物修復(fù)和不添加生物炭的為空白對照處理(CK)；其中1%、2%、4%生物炭指添加生物炭質(zhì)量與盆栽用土質(zhì)量的百分比。每個處理3次重復(fù)。每盆裝土2 kg。將相應(yīng)處理的生物炭比例與土壤提前混合均勻。每盆播撒種子3粒(按田間種植密度8×107粒/hm2)，保持70%土壤持水量。種植期間不定時加入自來水，其他管理措施同作物培育方法，試驗培育期90 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 植株生物量、Cd含量及土壤Cd含量測定 培育結(jié)束后收獲紫花苜蓿植株，采用清水小心清洗根系，將苜蓿不同部位分離，小心快速沖洗，然后置于烘箱中105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒質(zhì)量并稱質(zhì)量記錄。采用石墨爐-原子吸收光譜法測定植物提取物中的Cd濃度。

稱取1.00 g土壤樣品于Teflon PFA窄口瓶中，加入2 mL HNO3和2 mL 30% H2O2在封閉條件下高溫消解得到消解樣品。采用電感耦合等離子體光譜儀(ICP-OES)測定土樣中的Cd濃度。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性測定 采用奧豪斯ST3100/F型pH值計進行土壤pH值測定(水 ∶土=2.5 ∶1)，采用K2Cr2O7氧化還原滴定法測定土壤有機碳(SOM)含量，總氮(TN)含量采用半微量凱氏定氮法測定，速效氮含量采用堿解擴散法測定，陽離子交換量(CEC)采用EDTA-銨鹽快速法[15]測定。

土壤中性蛋白酶活性(SNPA)、堿性蛋白酶活性(SAPA)及土壤幾丁質(zhì)酶活性(SCA)分別采用試劑盒BC0275、BC0880及BC1935-100T/48S測定(Solarbio，北京)。

1.3.4 土壤酶活基因及功能基因豐度測定 稱取新鮮土壤樣品500 mg，采用FastDNA?SPIN土壤試劑盒(MP Biomedicals，USA)提取土壤DNA。并用NanoDrop ND-1000紫外-可見分光光度計(NanoDrop Technologies，Wilmington，簡稱DE)采用紫外分光光度法檢測DNA質(zhì)量和濃度，并將DNA 懸浮液保持在-20 ℃環(huán)境。采用實時熒光定量 PCR (RT-PCR) 測定土壤氮循環(huán)中關(guān)鍵酶基因的豐度，土壤酶活基因(nprA、aprA、chiA)引物參考Man[17]，AOA及AOB基因引物為常規(guī)(古)細菌氨氧化基因引物[18](表1)。使用SYBR GREEN PCR Master Mix(Toyobo，Osaka，Japan)和Bio-Rad CFX96光學(xué)實時檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories，Inc. Hercules，CA)上進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL SYBR? Premix ExTaqTM(TaKaRa Biotech，中國大連)、7.6 μL ddH2O、0.2 μL 正向引物(10 μmol/L)、0.2 μL反向引物(10 μmol/L)、2.0 μL模板DNA。qRT-PCR反應(yīng)步驟為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。通過對含有評估基因的純化質(zhì)粒進行10倍連續(xù)倍比稀釋(101～108倍)獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個反應(yīng)組都運行包含無菌ddH2O作為模板的空白對照，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值范圍為0.991～0.999。

表1 實時定量 PCR的引物序列信息

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0進行檢驗分析(α=0.05)，采用Origin 9.1進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘污染土壤中生物炭對紫花苜蓿生物量累積及鎘吸收的影響

由表2可知，紫花苜蓿地上部生物量、根系生物量及總生物量均表現(xiàn)為生物炭MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理皆顯著大于單一苜蓿種植處理(MX)，且生物炭處理中，皆表現(xiàn)為隨著生物炭用量增加生物量累積量降低，各處理生物量順序皆呈 MX+BC1>MX+BC2>MX+BC4>MX處理，與 MX+BC1處理相比，地上部生物量、根系生物量及總生物量分別顯著降低27.24%～68.93%、29.12%～72.97%、27.77%～70.07%。在根系Cd濃度中，與MX處理相比，MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理分別顯著降低23.25%、27.33%、26.02%；地上部Cd濃度表現(xiàn)為MX+BC4>MX+BC1>MX>MX+BC2處理，但處理間無顯著差異。各處理植株Cd累積量與根系生物量累積規(guī)律基本一致。

表2 鎘污染土壤中生物炭對紫花苜蓿生物量累積及鎘吸收的影響

2.2 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤理化性質(zhì)的影響

由表3可知，pH值整體以生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4大于CK、MX處理，其中MX+BC4處理顯著大于CK、MX處理。土壤有機質(zhì)中，不同處理呈MX+BC4>MX+BC2>MX+BC1>MX>CK處理，且較MX+BC4處理相比，MX+BC2、MX+BC1、MX、CK處理分別顯著降低9.87%、15.07%、17.35%、20.67%。陽離子交換量中，MX處理顯著大于CK，且生物炭處理均顯著高于CK、MX處理。各處理全氮含量、速效氮含量規(guī)律基本一致，即生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4皆顯著小于CK、MX處理，由于表現(xiàn)在速效氮指標(biāo)中，且上述3個指標(biāo)中生物炭處理間無顯著差異。土壤有效Cd濃度中，以苜蓿+生物炭處理MX、MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4較低，皆顯著低于CK，同時生物炭處理間呈MX+BC4

表3 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤理化性質(zhì)的影響

2.3 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤酶活性及基因豐度的影響

相關(guān)酶活性中，土壤幾丁質(zhì)酶以MX+BC1處理活力最大，MX+BC2處理其次，二者差異顯著且皆顯著大于其他處理，同時CK、MX+BC4這2個處理顯著低于MX處理(圖1-a)。由圖1-b可知，各處理中性蛋白酶活性表現(xiàn)為MX+BC4>MX+BC2>MX+BC1>MX>CK處理，較CK相比，苜蓿及生物炭處理MX、MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4顯著提高31.69%～90.39%。土壤堿性蛋白酶活性仍以CK最低，MX+BC2、MX+BC4、MX+BC1、MX處理較其分別顯著提高267.79%、236.99%、213.50%、154.29%。

相關(guān)酶基因豐度中，chiA基因豐度以CK最高，其他處理較其顯著降低20.31%～51.81%，此外，MX、MX+BC4處理顯著低于MX+BC4、MX+BC4這2個處理(圖1-d)。nprA基因豐度中，整體以生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4較高，均顯著高于CK，且MX+BC1、MX+BC2處理顯著大于MX處理(圖1-e)。aprA基因豐度中，各處理呈MX

2.4 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤氮轉(zhuǎn)化基因豐度的影響

由圖2-a可知，AOA-amoA基因中，以CK豐度最低，1.35×108拷貝數(shù)/g，MX、MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理較其顯著增加31.85%、77.78%、104.44%、51.11%，其中CK與MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4均存在顯著差異。AOB-amoA基因中，以CK豐度最低，顯著低于其他處理，且各處理呈MX+BC4>MX+BC2>MX+BC1>MX>CK處理，MX+BC4處理顯著高于其余各處理(圖2-b)。而在AOA-amoA/AOB-amoA中，CK、MX、MX+BC1、MX+BC2處理間差距較小，處理間無顯著差異；以MX+BC4處理比例最低，CK、MX、MX+BC1、MX+BC2較其分別顯著提高68.35%、49.89%、62.50%、76.02%。

2.5 鎘污染土壤中生物炭及紫花苜蓿對土壤氮礦化率的影響

由圖3可知，氮礦化率以生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4大于CK、MX處理，且生物炭處理間表現(xiàn)為MX+BC1>MX+BC2>MX+BC4處理，且MX+BC1處理顯著大于MX+BC4處理。以CK礦化率最低，MX處理較其顯著提高58.55%。與單一紫花苜蓿處理MX相比，MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4處理分別顯著提高270.62%、235.04%、182.75%。

2.6 氮礦化速率與土壤性質(zhì)、功能基因豐度之間的關(guān)系

從表4可以看出，Rm與全氮(TN)、速效氮(AN)土壤有效Cd濃度(A-Cd)均呈極顯著負相關(guān)，Rm與pH值、有機質(zhì)(SOM)、堿性蛋白酶(SAPA)、nprA、AOB-amoA呈極顯著正相關(guān)，與AOA-amoA呈顯著正相關(guān)。A-Cd與土壤性質(zhì)、功能基因豐度之間的相關(guān)性分析則和Rm相反。由表5可知，在Rm與相關(guān)功能基因的逐步回歸分析中，回歸模型為Rm=18.27×AOB-amoA+6.92×10-7×nprA-5.45，且P<0.01，同樣，Rm與有效Cd濃度的逐步回歸分析顯示Rm與A-Cd濃度存在對數(shù)關(guān)系，且P<0.01。

3 討論與結(jié)論

土壤Cd污染已成為制約農(nóng)業(yè)安全發(fā)展的重要因素，物理修復(fù)和植物修復(fù)已被證明可極大地作用于土壤Cd修復(fù)[19-20]。本研究中，在Cd污染土壤中，紫花苜蓿地上部生物量累積大于根系，而在Cd濃度分布趨勢則反之，且在植株Cd累積量中，表現(xiàn)為MX+BC1>MX+BC2>MX+BC4>MX處理，這意味著紫花苜蓿的修復(fù)作用涉及根系的吸收富集，從而從根部轉(zhuǎn)移到地上部，然后在地上組織中積累，生物炭可進一步促進紫花苜蓿的修復(fù)效果。從植物吸收和土壤微生物的利用角度來看，有效重金屬含量是決定植物組織中重金屬的吸收和累積的重要因素[21]。本研究結(jié)果表明，紫花苜蓿植物修復(fù)處理均顯著降低了土壤有效鎘含量，造成這種現(xiàn)象的原因可能是：(1)苜蓿根系分泌物與Cd絡(luò)合，降低了有效Cd含量[22]；(2)紫花苜蓿根系可以吸附金屬離子，且改變土壤微生物群落，從而進一步固定更多的重金屬Cd[23]。

表4 氮礦化速率與土壤性質(zhì)、功能基因豐度之間的相關(guān)性分析

表5 氮礦化速率與功能基因豐度、有效鎘(A-Cd)之間的逐步回歸分析

土壤氮含量、有機質(zhì)及陽離子交換性能等土壤特性會顯著影響土壤氮素代謝微生物活性、生物量和群落結(jié)構(gòu)，從而影響氮素礦化等過程[7]。本研究中，單一紫花苜蓿種植或與生物炭組合施用均改變了一系列土壤特性，即苜蓿種植顯著增加了SOM、CEC含量，并且相對于苜蓿單一種植，應(yīng)用生物炭進一步提高了SOM、CEC含量。然而，生物炭及紫花苜蓿提高SOM的機制可能不同，前人研究表明，苜蓿具有廣泛的主根系統(tǒng)，苜蓿根系分泌物(碳水化合物、酚酸和脂質(zhì))有利于根際微生物的建立，具有促進土壤微生物生物量和活性的潛力[22]，因此苜蓿種植可通過功能性微生物(如根瘤菌和叢枝菌根真菌)作用的生物效應(yīng)增加SOM含量[24]，而生物炭則主要通過非生物功能增加SOM含量。

作為N礦化的重要表征，蛋白酶在分解土壤蛋白質(zhì)以提供礦物質(zhì)氮方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。本研究中，紫花苜蓿處理的蛋白酶(中性、堿性)和幾丁質(zhì)酶活性高于對照，這可能是由于土壤蛋白酶和幾丁質(zhì)酶由土壤細菌和真菌活動所介導(dǎo)[4]，在植物修復(fù)后細菌和真菌的生物量增加[21]，蛋白酶和幾丁質(zhì)酶因此增加。另一方面，紫花苜蓿生長需要從試驗土壤中攝取礦質(zhì)N并降低有效N含量[23]，這可能對土壤N礦化產(chǎn)生正反饋效應(yīng)并進一步刺激酶活性[11，25]。土壤酶的整個生物學(xué)過程包括DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達[17]。重金屬Cd可能對mRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生有害影響并下調(diào)功能基因表達[26]。本研究結(jié)果表明，CK土壤有效Cd濃度最高，各處理的相關(guān)土壤酶基因的絕對豐度波動不大。然而，盡管CK中aprA和chiA基因豐度與單一苜蓿處理(MX)中的差距不大，但CK的酶活性更低，這意味著蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄過程受到Cd抑制。本研究中，添加生物炭處理MX+BC1、MX+BC2、MX+BC4對3種酶活性和相應(yīng)的酶功能基因豐度整體提高，這與前人的研究結(jié)果[27]趨于一致。原因可能是添加生物炭后改變了土壤特性如土壤持水能力、pH值和SOM含量，從而影響mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達[28]。

氨氧化古菌基因(AOA-amoA)和細菌功能基因(AOB-amoA)是反映土壤微生物性N轉(zhuǎn)化的重要表征。Ribbons等研究表明，土壤氮轉(zhuǎn)化尤其是氮礦化過程受AOA-amoA、AOB-amoA介導(dǎo)[29]。相關(guān)研究表明，土壤氮礦化率活性主要與AOA-amoA相關(guān)[23]。本研究結(jié)果表明，苜蓿種植處理的AOA-amoA、AOB-amoA豐度皆整體高于CK，且AOA-amoA基因豐度始終高于AOB-amoA，這與之前的研究結(jié)果一致，即基于植物修復(fù)可以顯著刺激受污染土壤中AOA類固氮微生物的繁殖及其功能活性[30]。氮素礦化率單一苜蓿處理顯著高于CK，而生物炭處理顯著大于上述2個處理，表明生物炭在促進土壤氮礦化中具有顯著的促進作用。相關(guān)性分析表明，Rm與AOA-amoA、AOB-amoA皆呈明顯正相關(guān)，且與AOB-amoA關(guān)系更密切。此外，本研究結(jié)果表明，AOA-amoA/AOB-amoA的比值與土壤有效Cd含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，表明土壤AOB對Cd的生物毒性比其古細菌更敏感。逐步回歸分析表明，AOB-amoA基因比其AOA-amoA更能影響Rm，表明AOB是影響農(nóng)業(yè)土壤中的土壤氮素轉(zhuǎn)化的主要功能菌類[23，31-32]。