豬源致瀉大腸埃希菌系統(tǒng)進化分群及致病型檢測

王 瑩， 盧葛錦， 祝令偉， 關(guān)佳瑤， 紀 雪， 孫 洋， 郭學軍

(中國農(nóng)業(yè)科學院長春獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，吉林長春 130122)

大腸埃希菌是人與動物的腸道共棲菌，不僅包括共生菌株，還包括可引起人畜疾病的致病性菌株，具有顯著的多功能性，能夠在人類和動物中引起疾病[1]，也被叫做致瀉大腸埃希菌 (diarrheogenicEscherichiacoli，簡稱DEC)，DEC的致病性是其攜帶的毒力因子所致，這些毒力因子可破壞宿主的防御系統(tǒng)，并在受感染的人和動物中引起腹瀉和局部組織感染，嚴重時甚至引起新生兒的腦膜炎和敗血癥等嚴重疾病，是臨床感染性疾病的重要食源性致病菌之一[2]，全世界每年因大腸埃希菌病死亡的人數(shù)大約有200 萬人。DEC根據(jù)其攜帶的毒力基因、引起感染的部位以及引起疾病的原因，可將DEC分為6類：腸產(chǎn)毒素型大腸埃希菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，簡稱ETEC)、腸致病型大腸埃希菌(enteropathogenicEscherichiacoli，簡稱EPEC)、腸侵襲型大腸埃希菌(enteroinvasiveEscherichiacoli，簡稱EIEC)、腸集聚型大腸埃希菌(enteroaggregativeEscherichiacoli，簡稱EAEC)、腸出血型大腸埃希菌 (enterohemorrhagicEscherichiacoli，簡稱EHEC )和彌散黏附型大腸埃希菌(diffusely adherent Escherichia coli，DAEC)[3]。為了解長春某規(guī)?；B(yǎng)豬場中 DEC的污染情況，本研究對從豬場分離的大腸埃希菌進行系統(tǒng)進化分群和毒力基因檢測以及致病型鑒定，并檢測了菌株耐藥情況，為從豬肉生產(chǎn)源頭對DEC污染的防控提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

129株大腸埃希菌于2020年分離自哺乳仔豬、妊娠母豬、哺乳母豬和斷奶仔豬糞便，其中妊娠母豬糞便分離獲得36株大腸埃希菌，哺乳母豬分離獲得42株大腸埃希菌，哺乳仔豬糞便分離獲得30株大腸埃希菌，斷奶仔豬糞便分離獲得21株大腸埃希菌。

1.2 試劑

腦心液體培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖，購自美國Genview公司；DNA分子量標準DL2 000，購自美國TaKaRa公司；細菌鑒定卡、ID肉湯、AST肉湯和AST指示劑，購自美國BD公司；6種致泄大腸埃希菌(DEC)核酸檢測試劑盒，購自北京美正生物科技有限公司；引物均由吉林庫美生物科技公司合成。

1.3 模板的制備

將凍存管中的菌液接種于腦心固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，挑取至少10個單菌落，加入100 μL 無菌去離子水，混勻，采用煮沸法提取129株待檢大腸埃希菌的基因組DNA作為PCR擴增模板。

1.4 系統(tǒng)進化分群檢測

參考Clermont 等建立的方法[4]合成引物，通過多重PCR，檢測大腸埃希菌分離株系統(tǒng)進化分群。根據(jù)擴增結(jié)果將大腸埃希菌分為A群系(chuA基因和TspE4.C2基因PCR擴增結(jié)果均為陰性)、B1群系(chuA基因PCR擴增結(jié)果為陰性而TspE4.C2基因PCR擴增結(jié)果為陽性)、B2群系(chuA基因和yjaA基因PCR擴增結(jié)果均為陽性)、D群系(chuA基因PCR擴增結(jié)果為陽性而yjaA基因PCR擴增結(jié)果為陰性)。

表1 試驗所需引物

1.5 毒力基因與致病型檢測

采用多重熒光實時定量PCR技術(shù)檢測14種毒力基因，包括aggR、stx1、lt、ipaH、eae、bfpB、stp、afaD、astA、pic、escV、stx2、sth和invE，根據(jù)試劑盒說明書，設(shè)定PCR擴增條件，檢測毒力基因的攜帶情況，判讀DEC的致病型。

1.6 耐藥性檢測

將分離的菌株接種于腦心固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h。先將ID肉湯放置于Phoenix SpecTM比濁儀內(nèi)調(diào)零，使用無菌棉簽刮取平板劃線4區(qū)中單菌落于ID肉湯中，將菌液調(diào)為麥氏比濁度0.5～0.6范圍內(nèi)，將46 μL AST指示劑垂直滴入AST肉湯，上下顛倒，緩慢混勻加入調(diào)好麥氏比濁度的ID肉湯25 μL，再次上下緩慢顛倒混勻，分別將ID肉湯和ASD肉湯緩緩倒入鑒定卡內(nèi)，把鑒定卡放置于全自動微生物藥敏系統(tǒng)內(nèi)對菌株進行敏感性檢測，根據(jù)全自動微生物藥敏系統(tǒng)檢測出的結(jié)果對菌株的敏感性及是否為產(chǎn)ESBLs菌株進行判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸埃希菌系統(tǒng)進化分群結(jié)果

對129株大腸埃希菌分離株系統(tǒng)進化分群分析結(jié)果見表2，A群占43.41%，B1群占51.49%，B2群占0.78%，D群占3.86%，B1群為優(yōu)勢群。妊娠母豬分離的36株大腸埃希菌中A群和B1群為優(yōu)勢群，3株大腸埃希菌為D群，未檢出B2群；哺乳母豬分離的42株大腸埃希菌中A群和B1群為優(yōu)勢群，1株大腸埃希菌為B2群，1株大腸埃希菌為D群；哺乳仔豬分離的30株大腸埃希菌中A群和B1群為優(yōu)勢群，1株大腸埃希菌為B2群，1株大腸埃希菌為D群；斷奶仔豬分離的21株大腸埃希菌中A群和B1群為優(yōu)勢群，未檢出B2群和D群。

表2 系統(tǒng)進化分群結(jié)果

2.2 大腸埃希菌 14種毒力基因攜帶情況

14種毒力基因中astA檢出率最高，為30.23%；其次是escV，為5.43%，stp和stx2均為0.78%；未檢出毒力基因bfpB、eae、aggR、stx1、lt、ipaH、afaD、pic、sth和invE。129株大腸埃希菌主要為5種毒力基因組合形式：astA(占29.46%)、escV(占4.65%)、stp(占0.78%)、stx2(占0.78%)、astA-escV(占0.78%)。

2.3 不同種群大腸埃希菌毒力基因的攜帶情況

不同種群大腸埃希菌所攜帶的毒力基因存在差異，結(jié)果如表3所示。根據(jù)毒力基因攜帶情況進行分析，astA基因在A群、B1群中檢出率最高，escV基因在B1、B2群檢出率最高，stp基因在僅A群中檢出，stx2基因僅在B1群檢出。根據(jù)不同群系攜帶毒力基因的情況進行分析，B1群含有檢出的3種毒力基因，A群含有檢出的2種毒力基因，B2群含有檢出的1種毒力基因，D群未檢出任何毒力基因。

2.4 大腸埃希菌致病型分析

根據(jù)毒力基因的檢出情況可以將大腸埃希菌分離株歸入不同的致病型，本研究將分離自不同生長周期的大腸埃希菌致病型分布進行歸納，結(jié)果如表4所示。妊娠母豬分離的36株大腸埃希菌中DEC占22.22%，其中EAEC檢出7株，占19.44%，毒力基因型均為astA；EHEC檢出1株，占2.78%，毒力基因型為stx2。哺乳母豬分離的42株大腸埃希菌中DEC占38.10%，均為EAEC，毒力基因型均為astA。哺乳仔豬分離的30株大腸埃希菌中DEC占33.33%，其中EAEC檢出7株，占23.33%，毒力基因型均為astA；EPEC鑒定出3株，占10.00%，毒力基因型為escV。斷奶仔豬分離的21株大腸埃希菌中DEC占61.90%，其中EAEC檢出8株，占38.10%，毒力基因型均為astA；ETEC鑒定出1株，占4.76%，毒力基因型為stp；EPEC鑒定出3株，占14.29%，毒力基因型為escv；EAEC-EPEC鑒定出1株，占4.76%，毒力基因型為astA-escV。

表4 豬源DEC毒力基因檢出及致病型分布

2.5 耐藥結(jié)果

2.5.1 大腸埃希菌對17種抗生素耐藥表型結(jié)果 129株大腸埃希菌中檢出產(chǎn)ESBLs菌株25株，檢出率為19.38%。由表5可知，不同來源的大腸埃希菌對16種抗生素耐藥表型基本相同，均對氨芐西林、哌拉西林、氯霉素和四環(huán)素耐藥率較高，對阿米卡星和黏菌素耐藥率較低，對亞胺培南、美洛培南和頭孢他啶無耐藥。耐藥性檢測的抗生素有六大類，包括氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、酰胺醇類、氟喹諾酮類、多黏菌素類和四環(huán)素類，根據(jù)多重耐藥菌的定義，對3類及3類以上抗生素耐藥的細菌為多重耐藥菌，在129株大腸埃希菌中檢出多重耐藥菌83株。

2.5.2 DEC對17種抗生素耐藥表型結(jié)果 分離自妊娠母豬的8株DEC中有4株多重耐藥菌，占50.00%；分離自哺乳母豬的16株DEC中有9株多重耐藥菌，占56.25%；分離自哺乳仔豬的10株DEC中有6株多重耐藥菌，占60.00%；分離自斷奶仔豬的13株DEC中有11株多重耐藥菌，占84.62%；47株DEC菌株中檢出產(chǎn)ESBLs菌株3株，均為EAEC型。

3 討論與結(jié)論

大腸埃希菌病在養(yǎng)殖業(yè)常見且多發(fā)，在養(yǎng)豬場可引起豬腸道相關(guān)的傳染性疾病，如仔豬黃白痢和水腫病，具有高發(fā)病率和低治愈率的特點，所以死亡率較高，大腸埃希菌病是導(dǎo)致養(yǎng)豬場遭受巨大經(jīng)濟損失的重要原因之一[5]。豬肉在我國居民飲食結(jié)構(gòu)中一直占據(jù)主要地位，在肉類產(chǎn)品消費中的比重高達60%以上，也是DEC污染的高危肉產(chǎn)品，對DEC進行合理的監(jiān)控，能減少DEC通過食物鏈傳播給人類，也對保障食品衛(wèi)生安全有重大意義[6]。

表5 不同來源大腸埃希菌對17種抗菌藥物敏感性結(jié)果

本試驗對129株豬源大腸埃希菌進行系統(tǒng)進化分群研究，結(jié)果顯示129株菌株分別屬于A群(43.41%，56/129)，B1群(51.94%，67/129)，B2群(0.78%，1/129)，D群(3.86%，5/129)，其中優(yōu)勢群為B1群。有研究表明，大腸埃希菌的致病力與系統(tǒng)進化分群相關(guān)[7]，群A和B1為條件致病群，因毒力較弱直接引起宿主患病的概率較低，但在宿主免疫力降低時則會發(fā)揮致病性，群B2和D為可攜帶較多毒力因子且與致病性緊密相關(guān)的致病群[8]，引起腸道感染的大都為A、B1和D群，引起腸外感染的分布于B2和D群，本試驗分離的大腸埃希菌條件致病群所占比例最大(95.35%，123/129)，這與韓一嘯等報道的吉林省長春市豬源大腸埃希氏菌系統(tǒng)進化分群檢測結(jié)果[9]一致，本試驗中，檢測出的大部分毒力基因均在A和B1群，有研究表明，雖然大多數(shù)共生大腸埃希菌來自A和B1群，但致瀉性大腸埃希菌變異主要發(fā)生在A、B1和D群中，相關(guān)的毒力因子可以通過水平轉(zhuǎn)移進入其他譜系，從而將受體菌株轉(zhuǎn)化為潛在病原體[7]，試驗結(jié)果表明，分離自哺乳仔豬的大腸埃希菌，系統(tǒng)進化分群更為復(fù)雜，應(yīng)引起注意。

致瀉大腸埃希菌的致病性是由它所攜帶的毒力因子所導(dǎo)致的，本試驗納入的分離菌株共檢測到4種致病力相關(guān)的毒力基因，其中編碼集聚熱穩(wěn)定性毒素A的基因astA與多次食源性EAEC暴發(fā)相關(guān)，在此次檢測中分離率最高[10]；編碼豬源熱穩(wěn)定性腸毒素基因stp介導(dǎo)大腸埃希菌小腸定植及黏膜黏附過程，導(dǎo)致腸細胞電解質(zhì)和水轉(zhuǎn)運嚴重功能障礙，與ETEC的典型感染癥狀有關(guān)，僅斷奶仔豬源中的1株大腸埃希菌檢測到stp基因[11]；表達志賀毒素基因Ⅱ(stx2e)的E.coli被稱為EHEC，是導(dǎo)致仔豬水腫病的病原菌，也是重要的食源性人畜共患病病原，可通過污染飲食引發(fā)大規(guī)模食源性食物中毒，本研究妊娠母豬源分離菌有攜帶stx2的菌株檢出[12-13]；EPEC為攜帶有蛋白分泌物調(diào)節(jié)基因escV的大腸埃希菌，可附著于腸絨毛頂端上皮細胞，并引起病變，缺乏stx和eae基因的escV陽性菌株被歸類為非典型EPEC，常經(jīng)由生豬等動物制品傳播，導(dǎo)致人類感染[1，14-16]，本研究在仔豬來源的菌株中檢測到escV，并且在斷奶仔豬來源的菌株中檢測到1株同時攜帶astA-escV基因，為EAEC-EPEC雜交型菌株。對毒力因子的檢測結(jié)果提示肉類來源致病菌造成人類感染的潛在風險，應(yīng)加以重視。

本試驗中養(yǎng)豬場DEC的陽性檢出率為36.43%，略高于上海市和海南省規(guī)?；B(yǎng)豬場DEC陽性檢出率(24.2%和21.28%)[17-18]，表明該養(yǎng)豬場應(yīng)重視養(yǎng)殖場內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生，即時合理地處理排泄物，同時強化豬場消毒的頻次和方法，切斷DEC的傳播途徑，降低DEC的檢出率。本試驗發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬時期DEC污染率高于哺乳仔豬時期，與Wu等研究報道的斷奶仔豬的糞便中大腸菌群紊亂可能反映了對各種腸道疾病敏感性增加的結(jié)論[19]相一致，由于斷奶仔豬的腸壁結(jié)構(gòu)不健全，生理功能也不完全，而斷奶后母源抗體被切斷，同時仔豬無法適應(yīng)飲食結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致免疫力降低，更易感染致病菌，提示應(yīng)更加關(guān)注斷奶仔豬養(yǎng)殖過程中DEC的感染。另外從仔豬和母豬來源分離出的DEC存在差異，仔豬中DEC陽性菌株的比例略高于母豬，而且仔豬中出現(xiàn)的毒力基因的多樣性也高于母豬中檢測到的毒力基因，與Bok等研究報道的結(jié)果[20]一致，研究結(jié)果表明，來自仔豬的菌株，構(gòu)成了一個相當大的毒力基因庫，可能增加腸外感染的潛在風險，并隨著宿主生物的進化，共生大腸桿菌的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化[21]。

DEC可引起豬腸道傳染性疾病，嚴重時可導(dǎo)致死亡，因此了解養(yǎng)殖場分離的大腸埃希菌的耐藥情況尤為重要。本試驗中分離自斷奶仔豬的13株DEC中有11株多重耐藥菌，占84.62%，其他3種來源的DEC中多重耐藥菌也超過50%，DEC多重耐藥情況嚴重，不同來源大腸埃希菌對17種抗生素耐藥表型情況基本相同，提示一些固有型耐藥抗生素不建議作為治療藥物，本結(jié)果中亞胺培南和美羅培南耐藥率較低，與朱德永等的報道[22]一致，碳青霉烯類、酶抑制劑復(fù)合抗菌藥物是治療大腸埃希菌病最有效的抗生素。本結(jié)果還顯示黏菌素耐藥性較低，但因2017年黏菌素禁用政策的發(fā)布和其藥物毒性較大，并不是作為治療藥物的最佳選擇。根據(jù)藥敏結(jié)果提示在治療DEC時抗菌藥物的選擇應(yīng)以藥敏試驗為科學依據(jù)，不應(yīng)盲目用藥，采取合理的針對性治療藥物，防止超級耐藥菌出現(xiàn)。

養(yǎng)豬場環(huán)境是人畜共患病原菌的生存與繁殖的天然儲存庫，DEC可能通過糞便排出，造成環(huán)境、水和食物的污染來進行傳播，另外可能在屠宰過程中錯誤的運輸方式和不當?shù)膬Υ鏃l件也會增加DEC污染的風險。在豬肉生產(chǎn)中，尤其是在養(yǎng)殖階段，仔豬特別是斷奶仔豬是豬場DEC防控的關(guān)鍵點，分階段管理、提高飼養(yǎng)水平、及時并合理處理糞便從源頭切斷傳播途徑，對于保障居民食品衛(wèi)生安全和防控食源性疾病流行有重大意義。