新疆野生中國(guó)美味蘑菇的遺傳多樣性分析

羅 影，賈培松，努爾孜亞·亞力買買提，祁顥萱，趙振豪，賈文捷

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】中國(guó)美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)隸屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agaricales)，蘑菇科(Agaricaceae)，蘑菇屬(Agaricus)[1]。王卓仁等[2]從形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，命名為中國(guó)美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。其屬于中亞地區(qū)特有種，主要生長(zhǎng)在內(nèi)陸湖泊沿岸，蘆葦腐殖質(zhì)豐富的沙灘上，子實(shí)體碩大。分析中國(guó)美味蘑菇野生資源開展種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和遺傳多樣性，對(duì)于中國(guó)美味蘑菇新品種選育、種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ISSR可以直接從DNA水平上檢測(cè)DNA多態(tài)性，擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)、重復(fù)性好，是目前在分析和評(píng)估生物種群的遺傳多樣性中使用最廣泛的分子標(biāo)記之一[3]，木耳[4-6]、草菇[7]、灰樹花[8]、白靈菇[9]、香菇[10-12]等均有多校性評(píng)價(jià)文獻(xiàn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)中國(guó)美味蘑菇的研究，主要從其形態(tài)描述、生境調(diào)查[13,14]、營(yíng)養(yǎng)成分分析[15-18]及馴化栽培[19-22]進(jìn)行了研究。目前尚未有應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記對(duì)中國(guó)美味蘑菇進(jìn)行遺傳多樣性分析的報(bào)道。亟需分析新疆野生中國(guó)美味蘑菇的遺傳多樣性。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用生物學(xué)培養(yǎng)特征與ISSR分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，對(duì)從新疆博斯騰湖周邊采集的20個(gè)野生中國(guó)美味蘑菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，為保護(hù)開發(fā)中國(guó)美味蘑菇種質(zhì)資源及新品種選育等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

20個(gè)野生中國(guó)美味蘑菇子實(shí)體均采集于新疆博湖縣，菌株保藏于新疆農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲活化與菌絲體收集

將菌種接種到PDA平板上，25℃下避光培養(yǎng)20 d左右活化。活化后，取菌絲尖端再接于PDA平板，培養(yǎng)基表面鋪一層玻璃紙。固體培養(yǎng)的菌絲體，用滅菌的接種刮沿著玻璃紙的表面將菌絲體輕輕刮下，置稱量紙上，天平稱量備用。

1.2.2 菌株生物學(xué)培養(yǎng)特征測(cè)定

將活化的20個(gè)中國(guó)美味蘑菇供試菌株，打孔器分別打取活化后適齡菌種菌落邊緣作接種塊，接種至PDA培養(yǎng)基中央，每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù)，25℃避光培養(yǎng)。定期觀察菌株生長(zhǎng)情況，觀察指標(biāo)有：菌絲顏色、菌落邊緣形態(tài)、菌絲濃密度等4項(xiàng)菌絲培養(yǎng)特征指標(biāo)，菌絲生長(zhǎng)速度采用“十”字交叉法測(cè)量計(jì)算菌落直徑。

1.2.3 DNA提取

對(duì)采集的菌絲體進(jìn)行干燥處理，取一部分干燥子實(shí)體，采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取總DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。

1.2.4 ITS序列測(cè)定

采用通用引物 ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGGATATGC，(由生工生物工程股份有限公司合成)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL：引物(10 μmol/L各1.0 μL、模板1.0 μL，2×TaqPCR MasterMix12.5 μL無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將PCR產(chǎn)物交于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。選取同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA 6.0軟件首先進(jìn)行多重序列比對(duì)，再采用Neighbour-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次Bootstrap自舉法檢驗(yàn)。

將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST，選取同源性較高的序列及現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的序列，以口蘑科口蘑屬松茸 (TricholomamatsutakeEU294302.1) 的ITS為外群，與采集的20個(gè)野生中國(guó)美味蘑菇樣本一起，用MEGA 6.0中Neighbor-joining 法(Maximum likehood Bootstrap trials=1 000)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 ISSR-PCR擴(kuò)增與聚類分析

通過引物篩選實(shí)驗(yàn)[23,24]從42個(gè)引物[25,26]中篩選出15個(gè)引物，擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性較高，且擴(kuò)增出豐富的多態(tài)性位點(diǎn)。篩選出引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，所用引物及擴(kuò)增程序參考李輝平[3]和朱堅(jiān)[26]方法，由上海生工生物有限公司合成。

擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL，其中2×TaqPCR MasterMix12.5 μL，引物(0.2 mmol/L)1 μL，模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。擴(kuò)增體系：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃補(bǔ)平10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)ISSR擴(kuò)增結(jié)果。表1

1.3 數(shù)據(jù)處理

將ISSR-PCR 的電泳結(jié)果人工比對(duì)校正，有條帶記為1，無(wú)條帶記為0，構(gòu)建初始“0/1”矩陣表。統(tǒng)計(jì)條帶總數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)并計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率P，公式為：P=k/n(100%)，式中：P為多態(tài)位點(diǎn)百分率，k為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，n為測(cè)定的位點(diǎn)總數(shù)。

使用NTSYSpc分析軟件對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，生成遺傳聚類圖，分析聚供試野生中國(guó)美味蘑菇菌株間的遺傳多樣性及遺傳分化特征。

表1 供試ISSR引物的序列

圖1 不同中國(guó)美味蘑菇菌株的菌絲形態(tài)

2 結(jié)果與分析

2.1 野生中國(guó)美味蘑菇菌株菌絲培養(yǎng)特征比較

研究表明，各菌株菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲長(zhǎng)勢(shì)及是否形成原基上均有明顯差異，其中菌株BK039、BK042菌絲生長(zhǎng)最快，平均生長(zhǎng)速度分別為1.46、1.44 mm/d；菌株BK052菌絲生長(zhǎng)最慢，平均生長(zhǎng)速度為0.22 mm/d。易形成原基的菌株有BK36、BK40、BK52、BK72。表2

根據(jù)菌絲形態(tài)、菌絲濃密度及是否形成原基等，將20個(gè)中國(guó)美味蘑菇菌株劃分為4個(gè)組群。第1組群：氣生菌絲濃密，菌落邊緣菌絲濃白，不易形成原基，包括BK01、BK03、BK08、BK10、BK30、BK50、BK51、BK73、BK74、BK75；第2組群：氣生菌絲一般，不易形成原基，包括BK38、BK39、BK42、BK49；第3組群：氣生菌絲一般，易形成原基，包括BK36、BK40、BK52、BK72；第4組群：菌絲稀疏，且不易形成原基，包括BK11、BK33。圖1

表2 中國(guó)美味蘑菇菌株的菌絲培養(yǎng)特征描述

2.2 野生中國(guó)美味蘑菇ITS分子鑒定

研究表明，中國(guó)美味蘑菇的ITS序列大小介于720～750 bp，采集的20株野生樣本Blast結(jié)果均為中國(guó)美味蘑菇，構(gòu)建發(fā)育樹也聚為一簇，從分子水平上鑒定采集的樣本均為中國(guó)美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。圖2

圖2 基于ITS序列的中國(guó)美味蘑菇的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 野生中國(guó)美味蘑菇菌株的ISSR多態(tài)性分析

研究表明，實(shí)驗(yàn)共選擇42個(gè)ISSR引物，其中有16個(gè)引物對(duì)供試的20個(gè)中國(guó)美味蘑菇菌株有很好的擴(kuò)增效果，條帶清晰，重復(fù)性好。16個(gè)引物共擴(kuò)增出206條較為清晰的DNA條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出12.88條多態(tài)性條帶。平均多態(tài)性條帶頻率為83.46%，其中P1、P5、P22等3個(gè)引物多態(tài)性比率為100%，引物 P25多態(tài)性比率為 92.31%。供試菌株間的遺傳多態(tài)性較高。表3

表3 ISSR 引物的擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性

2.4 供試菌株的聚類

研究表明，20個(gè)供試中國(guó)美味蘑菇菌株間遺傳相似系數(shù)范圍在 0.60～0.91，在遺傳相似系數(shù)0.60水平上15個(gè)供試菌株分為2個(gè)類群，BK033和BK036與其他菌株區(qū)分開來(lái)，說(shuō)明BK033和BK036與其他供試中國(guó)美味蘑菇之間的遺傳差異較大。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.80時(shí)，可分為8個(gè)類群，最大的類群包括12個(gè)菌株，占總數(shù)的60%，另有2個(gè)菌株成一個(gè)類群，其他菌株單獨(dú)成一個(gè)類群，博湖縣的中國(guó)美味蘑菇已經(jīng)發(fā)生較為明顯的遺傳分化現(xiàn)象。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.91時(shí)，可分為17個(gè)類群，其中BK03和BK08、BK40和BK49、BK050和BK052兩兩為一類，這三組菌株之間親緣性較近；其他菌株各自為一類群，20個(gè)供試中國(guó)美味蘑菇菌株均采自博斯騰湖附近，具有豐富的遺傳多樣性。圖3

圖3 供試中國(guó)美味蘑菇菌株ISSR多態(tài)性的聚類

3 討 論

3.1中國(guó)美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)是2015年王卓仁等[2]從形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)進(jìn)行研究命名的新種。在此之前主要對(duì)其生境[13,14]、子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)成分[15-18]、馴化栽培[19-22]及其生境微生物群落[27]進(jìn)行了分析研究。

3.2ISSR標(biāo)記是由Zietkiewi CZ等[28]創(chuàng)建的一種簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記，直接從DNA水平上檢測(cè)基因多態(tài)性。

3.3在ISSR分析中，在遺傳相似系數(shù)為0.75時(shí)，將20個(gè)供試中國(guó)美味蘑菇菌株劃分為4個(gè)種群，但是與表觀形態(tài)學(xué)的分組不一致。在遺傳相似系數(shù)為0.80時(shí)，可劃分為8個(gè)類群，最大的類群包括12個(gè)菌株，占總數(shù)的60%，與表觀形態(tài)學(xué)分組略有差異，其又進(jìn)一步將表觀形態(tài)學(xué)分組的第1組群進(jìn)一步細(xì)化分組，20個(gè)供試中國(guó)美味蘑菇菌株雖然均采自博斯騰湖附近，但是各菌株間也具有豐富的遺傳多樣性。ISSR分子標(biāo)記在木耳[4-6]、草菇[7]、灰樹花[8]、白靈菇[9]、香菇[10-12]等均有應(yīng)用，ISSR標(biāo)記在食用菌種植資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析中應(yīng)用是可信的。

4 結(jié) 論

采集于新疆博湖縣的20個(gè)樣本均為中國(guó)美味蘑菇(Agaricussinodeliciosus)。將20個(gè)樣本劃分為4個(gè)組群；16條ISSR引物共擴(kuò)增出206條清晰的DNA條帶，多態(tài)性條帶176條，多態(tài)比率為83.50%。各菌株間遺傳相似系數(shù)范圍在 0.60～0.91，遺傳相似系數(shù)為0.80時(shí)，20個(gè)樣本分為8個(gè)類群。新疆博湖縣的中國(guó)美味蘑菇已開始發(fā)生遺傳分化，具有豐富的遺傳多樣性，有較好的馴化育種潛力。

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