白靈菇褐腐病防治藥劑藥效評(píng)價(jià)

初占宇，賈培松，，羅 影，努爾孜亞·亞力買買提，付永平，李 玉

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】白靈側(cè)耳(Pleurotustuoliensis)又稱白靈菇，隸屬于擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬[1-2]。白靈菇目前已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[3-4]。2010年我國(guó)白靈菇年產(chǎn)量高達(dá)323 713 t，2018年年產(chǎn)量55 832 t。在2010～2018年中白靈菇的病害也逐年上升，其中有細(xì)菌斑點(diǎn)病、菌褶滴水病、細(xì)菌性腐爛病、紅菇病等細(xì)菌性病害[5]。新疆白靈菇主產(chǎn)區(qū)細(xì)菌性褐腐病普遍發(fā)生，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率達(dá)90%以上[6-7]。白靈菇褐腐病在嚴(yán)重季節(jié)可達(dá)90%～95%。在自然條件下，白靈菇子實(shí)體在發(fā)病初期子實(shí)體菌蓋表面呈現(xiàn)水漬狀病癥，病變部分呈暗黃褐色，菌蓋表面形成一薄層菌濃，有淡淡的臭味。發(fā)病中期，水漬狀癥狀逐漸擴(kuò)大，約占子實(shí)體表面的1/2，病變部分顏色逐漸加重，呈深褐色，臭味逐漸加重。發(fā)病后期，水漬狀癥狀會(huì)蔓延至整個(gè)子實(shí)體，嚴(yán)重影響白靈菇的產(chǎn)量。該病的病原菌為托拉斯假單胞菌Pseudomonastolaasii，篩選出高效的防治藥劑對(duì)減少細(xì)菌性腐爛病有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】農(nóng)業(yè)防治主要是通過(guò)改善栽培環(huán)境，加強(qiáng)栽培各流程的管理，降低白靈菇細(xì)菌性褐斑病發(fā)病率[6-7]。農(nóng)業(yè)防治包括栽培場(chǎng)所的周邊環(huán)境、栽培場(chǎng)所的衛(wèi)生情況、白靈菇栽培料的配方、栽培過(guò)程中菌種的制作、栽培袋接種發(fā)菌、出菇管理、采摘管理等[8-10]。Fermor[13]從菇場(chǎng)、土壤、植物材料上分離出了一批P.tolaasii的拮抗細(xì)菌，這些細(xì)菌能顯著降低褐斑病的發(fā)病程度，具有很高應(yīng)用價(jià)值和研究?jī)r(jià)值。Soler-Rivas[14]發(fā)現(xiàn)Pseudomonasreactans產(chǎn)生的WLIP(white line inducing principle)能中和tolaasin毒素，在褐斑病生物防治中具有應(yīng)用開發(fā)的潛力。Tsukamoto[15]從已經(jīng)腐爛的糙皮側(cè)耳子實(shí)體上分離到一株革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，該細(xì)菌能顯著降低托拉斯假單胞菌P.tolaasii產(chǎn)生tolaasin的概率。呂銳玲等[16]從大蒜、蒲公英和魚腥草中篩選出大蒜粗提液對(duì)糙皮側(cè)耳褐斑病病原細(xì)菌菌株P(guān)H-1具有顯著抑菌作用，但發(fā)揮作用的物質(zhì)以及抑菌機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。劉芹等[17]發(fā)現(xiàn)殼聚糖對(duì)托拉斯假單胞菌生長(zhǎng)具有較好的抑制作用。【本研究切入點(diǎn)】針對(duì)白靈菇細(xì)菌性褐斑病，目前尚沒(méi)有非常有效的化學(xué)防治藥劑。四環(huán)素、鏈霉素、漂白粉液和二氧化氯等，化學(xué)藥劑在實(shí)際防治過(guò)程中，效果都不是特別理想[11-12]。目前生物防治方面的研究主要集中在篩選拮抗菌和tolaasin毒素降解等。該病的病原菌有關(guān)藥劑防治未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取20種殺菌劑測(cè)定其對(duì)白靈菇褐腐病病原菌的毒力，篩選出高效、低毒和環(huán)境友好型殺菌劑，為有效防治該病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

5株白靈菇褐腐病分離菌株，菌株編號(hào)分別為XJ2-3、XJ2-10、XJ4-6、XJ4-11、XJ7-2，分離自烏魯木齊縣和青河縣的白靈菇感病子實(shí)體，并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證致病性，菌株現(xiàn)保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心(CCMJ)和新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所。表1

表1 供試菌株信息

1.1.2 培養(yǎng)基

LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：酵母膏10 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

LB液體培養(yǎng)基：酵母膏10 g，胰蛋白陳10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 供試藥劑

從市場(chǎng)上選取20種常用殺菌劑，劑型包括可濕性粉劑、水分散粒劑、懸浮劑、乳油、可溶液劑、水劑、水乳劑。表2

表2 20種供試殺菌劑信息

1.2 方 法

1.2.1 菌懸液制備

將病原菌菌株活化出現(xiàn)的單菌落，接種至200 mL LB液體培養(yǎng)基中，用記號(hào)筆標(biāo)記接種人、接種日期及接種菌株編號(hào)，28℃ 150 r/min條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)16 h，備用。將紫外分光光度計(jì)在450 nm處將吸光度調(diào)整為0.3。通過(guò)涂布平板法(取少量菌懸液滴加于LB固體培養(yǎng)基上，用滅過(guò)菌的涂布器，將菌液均勻的涂布在培養(yǎng)基表面)適當(dāng)稀釋的LB固體培養(yǎng)基上的活細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將其放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗黑培養(yǎng)48 h。細(xì)菌菌懸液濃度(1.3±0.2)×108CFU / mL。

1.2.2 藥劑初篩

用無(wú)菌水按照重量/體積比(或體積/體積比)將各供試藥劑稀釋300倍，備用。取配置好的菌懸液100 μL涂布于直徑為9 cm的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，將滅菌后的紙碟放置于平板培養(yǎng)基正中間，吸取100 μL藥劑加至紙碟上，對(duì)照組添加100 μL無(wú)菌水，于28℃恒溫箱中暗培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理3次重復(fù)。記錄紙碟周圍有無(wú)明顯抑菌現(xiàn)象，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=(處理組抑菌圈直徑-紙碟直徑)/處理組抑菌圈直徑×100%。

1.2.3 藥劑濃度梯度

將初篩出來(lái)的殺菌劑設(shè)置300、500、700、900、1 100倍稀釋液5個(gè)濃度稀釋梯度和150、300、450、600、750倍稀釋液5個(gè)濃度梯度，采用紙碟法測(cè)定各殺菌劑在不同濃度梯度下的抑菌圈直徑，每個(gè)處理梯度重復(fù)3次，計(jì)算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用 SPSS 軟件計(jì)算各殺菌劑毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)和抑菌率的大小以對(duì)各殺菌劑的毒力大小進(jìn)行評(píng)價(jià)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 白靈菇褐腐病病害防治藥劑初篩

研究表明，46%二氯異氫尿酸鈉、32%唑酮·乙蒜素對(duì)白靈菇褐腐病菌具有明顯的抑制作用。100×108cfu/g枯草芽孢桿菌、60%唑醚·代森辛、50%烯酰嗎啉、50%硫磺、50%咪鮮胺錳鹽等18種殺菌劑對(duì)白靈菇褐腐病菌無(wú)明顯的抑制作用。圖1

圖1 部分藥劑初篩

2.2 二氯異氫尿酸鈉藥劑濃度梯度評(píng)價(jià)

研究表明，在稀釋濃度為300倍下，二氯異氫尿酸鈉抑菌率區(qū)間為36%～62%，在同樣的稀釋濃度下，不同菌株之間存在一定差異。在稀釋濃度為300倍下，XJ7-2的抑制率明顯高于其他4個(gè)菌株，但隨著稀釋濃度逐漸增大，抑菌率逐漸變小，在稀釋濃度為1 100倍下，5個(gè)菌株的抑菌率區(qū)間僅為7%～29%。抑菌率越大藥劑毒力越強(qiáng)。藥劑二氯異氫尿酸鈉在稀釋濃度300倍下，抑菌效果最為明顯。表3

2.3 唑酮·乙蒜素藥劑濃度梯度評(píng)價(jià)

研究表明，在稀釋濃度為150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率區(qū)間為41%～50%，在稀釋濃度為150倍下，XJ4-6的抑菌率為50%，抑制率明顯高于其他4個(gè)菌株。隨著稀釋濃度逐漸增大，抑菌率逐漸減小。當(dāng)稀釋濃度為750倍下，抑制率區(qū)間為3%～16%。隨著稀釋濃度逐漸增大，抑菌率逐漸變小。故藥劑唑酮·乙蒜素在稀釋濃度150倍下，抑菌效果最為明顯。表4

表3 46%二氯異氫尿酸鈉對(duì)白靈菇褐腐病菌的毒力回歸方程

3 討 論

針對(duì)白靈菇褐腐病室內(nèi)及田間化學(xué)防治藥劑的篩選迫切重要[19-20]。選擇新疆地區(qū)常用的20種商品殺菌藥劑對(duì)白靈菇褐腐病菌進(jìn)行室內(nèi)抑菌，試驗(yàn)初篩得到抑菌效果較好的2種殺菌藥劑，并將2種殺菌劑采用紙碟法分別進(jìn)行室內(nèi)毒力顯示，在稀釋濃度為150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率區(qū)間為41%～50%，在稀釋濃度為300倍下，二氯異氫尿酸鈉抑菌率區(qū)間為40%～62%，2種藥劑殺菌效果皆明顯，且2種商品藥劑又都屬于高效、低毒和環(huán)境友好型殺菌劑，可作為后續(xù)田間藥劑防治試驗(yàn)的首選藥劑。在采取農(nóng)藥防治的同時(shí)根據(jù)不同的實(shí)際情況選擇合適的農(nóng)業(yè)防治措施配合防治，如從培育和引進(jìn)抗性品種、增強(qiáng)品種的抗病性、及時(shí)清除病殘?bào)w等全方面防控措施[21-23]。

表4 32%唑酮·乙蒜素對(duì)白靈菇褐腐病菌的毒力回歸方程

防控中也應(yīng)避免單一藥劑的多年重復(fù)施用，可將此次篩選出的2種藥劑復(fù)配、交替使用，得到較理想的田間防控效果。

4 結(jié) 論

篩選獲得在稀釋濃度為150倍下，唑酮·乙蒜素抑菌率區(qū)間為41%～50%，在稀釋濃度為300倍下，二氯異氫尿酸鈉抑菌率區(qū)間為36%～62%，2種藥劑殺菌效果皆明顯。唑酮·乙蒜素和二氯異氫尿酸鈉作為白靈菇褐腐的防治藥劑。

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