食用菌發(fā)酵液對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和生物膜形成的影響

陳 敏 梁馨云 文秋嘉 張 薇 郭文濤

抗生素的使用能夠有效降低感染性疾病的致死率，然而長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)對(duì)病原菌形成選擇壓力，產(chǎn)生抗性突變，導(dǎo)致病原菌耐藥性的產(chǎn)生和蔓延。耐藥菌的存在限制了抗生素的使用，因此尋找新的抗菌藥物迫在眉睫[1]。群體感應(yīng)是細(xì)菌通過感知周圍環(huán)境中的信號(hào)分子調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)節(jié)自身以及周圍細(xì)菌的生長(zhǎng)，菌體間相互感應(yīng)、交流，從而適應(yīng)環(huán)境變化[2-3]。群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠?qū)ι锬さ男纬?、毒力因子的表達(dá)等進(jìn)行調(diào)控，由于群體感應(yīng)不會(huì)直接影響微生物的生長(zhǎng)，可避免產(chǎn)生生存壓力與誘導(dǎo)耐藥性，因此群體感應(yīng)可以作為新型抗微生物藥物的靶標(biāo)[4]。

銅綠假單胞菌是常見致病菌，臨床上常發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的耐藥菌，給臨床治療造成很大困難[5-6]。食用菌多糖能夠抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，前期的研究發(fā)現(xiàn)香菇和雞腿菇發(fā)酵液在一定程度上可以抑制白色念珠菌生物膜的形成[7]，本研究通過制備食用菌的液態(tài)發(fā)酵液，分析其對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和生物膜形成的影響，為篩選新型抗感染藥物尋找新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌和指示菌株供試食用菌香菇、茶樹菇、金針菇、杏鮑菇、雞腿菇、木耳為本實(shí)驗(yàn)室保存。銅綠假單胞菌PAO1 和紫色桿菌CV026 均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉20 g，麩皮40 g，蔗糖30 g，溶于1 000 ml 蒸餾水中，調(diào)pH 值為7.0。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）、沙氏瓊脂（Sabouraud's agar, SDA）培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基購(gòu)于杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備YC-1102D 大容量恒溫振蕩器：上海程造儀器設(shè)備有限公司；LHP150L/250L 恒溫恒濕培養(yǎng)箱：常州冠軍儀器制造有限公司；生物安全柜：蘇州長(zhǎng)留凈化科技有限公司；Multiskan SkyHigh全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 食用菌液體發(fā)酵液的制備食用菌菌種接種于PDA 斜面，28 ℃培養(yǎng)6 d 得到斜面菌種，將菌種接種到100 ml 液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 轉(zhuǎn)/min 搖床培養(yǎng) 5 d 得到液體種子。按照7%的比例接種液體種子到100 ml 液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 轉(zhuǎn)/min 搖床培養(yǎng)10 d，得到液體發(fā)酵液。

1.2.2 群體感應(yīng)抑制劑的篩選報(bào)告菌株CV026 活化后轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基，按體積分?jǐn)?shù)1%接種到10 ml含有20 μg/ml 卡那霉素的LB 培養(yǎng)基，150 轉(zhuǎn)/min，30 ℃ 培養(yǎng)16 h，取1 ml 菌液與含有20 μg/ml C6-HSL LB 半固體培養(yǎng)基混勻，倒平板。用打孔器打孔，將食用菌發(fā)酵液分別注入到小孔中，放置在28 ℃下恒溫培養(yǎng)18 h，觀察紫色素產(chǎn)生情況，判斷食用菌發(fā)酵液是否具有群體感應(yīng)抑制作用。

1.2.3 銅綠假單胞菌的培養(yǎng)配制2×LB 液體培養(yǎng)基，取1 ml 加入試管中，加入1 ml 食用菌發(fā)酵液，對(duì)照組設(shè)置為加蒸餾水，充分混勻。加入10 μl 吸光度A600 nm值為0.5的銅綠假單胞菌液，30 ℃，150轉(zhuǎn)/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜。置于離心管中4 500 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，取上清液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 食用菌液體發(fā)酵液對(duì)綠膿菌素產(chǎn)生量的影響取上清液2 ml，與1.5 ml 氯仿震蕩混合，置于離心機(jī)中4 500 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，將氯仿提取液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1.5 ml 2 mol/L HCl，充分混勻后靜置片刻，取上層鹽酸相中的液體，分光光度計(jì)檢測(cè)在520 nm 處的吸光值，實(shí)驗(yàn)3 次取平均值。

1.2.5 牛奶平板法分析胞外蛋白酶活性量取2 g脫脂奶粉溶解到50 ml 蒸餾水中，同時(shí)稱1.5 g 瓊脂溶解到50 ml 蒸餾水中。兩液分別高壓滅菌后冷卻至45～50 ℃，混合均勻后倒平板。使用0.6 cm的無菌打孔器在平板上打孔，取50 μl 上清液加入孔中，第2 天測(cè)量透明圈大小，比較不同組別水解圈的直徑。

1.2.6 結(jié)晶紫染色法分析生物膜形成用去離子水輕輕地沖洗試管壁上的浮游菌。加入福爾馬林固定5 min，倒出后加入0.1%的結(jié)晶紫染色30 min，倒出染液加入去離子水輕輕洗滌3 次。45 ℃烘箱干燥后，加入95%乙醇洗脫附著在生物膜上的染料，分光光度計(jì)檢測(cè)有色溶液在650 nm 處的吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，單因素方差分析比較不同組別間的差異，t檢驗(yàn)用于兩組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 群體感應(yīng)抑制劑篩選

在瓊脂平板上，香菇和雞腿菇發(fā)酵液加樣孔周圍的紫色素含量下降，出現(xiàn)渾濁、不透明的抑菌圈；而茶樹菇、金針菇、杏鮑菇、木耳發(fā)酵液孔周圍紫色素變化不大，菌株能正常生長(zhǎng)。

2.2 食用菌發(fā)酵液對(duì)綠膿菌素產(chǎn)生量的影響

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)香菇和雞腿菇發(fā)酵液A520 值分別為（0.276±0.022）和（0.319±0.035），與對(duì)照組（0.477±0.041）相比顯著降低（P＜0.05）。

2.3 食用菌發(fā)酵液對(duì)胞外蛋白酶活性的影響

細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶能夠分解平板中脫脂牛奶形成的透明圈，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)加入香菇和雞腿菇發(fā)酵液后，透明圈的直徑分別為（1.4±0.1）cm 和（1.3±0.2）cm，與對(duì)照組（2.1±0.2）cm 相比顯著降低（P＜0.05）。

2.4 食用菌發(fā)酵液對(duì)生物膜形成的影響

經(jīng)過培養(yǎng)后，能夠在試管表面形成一層薄膜，且不會(huì)被無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗掉，香菇和雞腿菇發(fā)酵液均可在一定程度上抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，A650 值分別為（0.278±0.022）和（0.316±0.032），與對(duì)照組（0.475±0.044）相比顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

群體感應(yīng)系統(tǒng)的存在提高了細(xì)菌的種群適應(yīng)性，為細(xì)菌的耐藥性研究提供了新的角度。針對(duì)群體感應(yīng)系統(tǒng)尋找群體感應(yīng)抑制劑已成為抗菌藥物研究和耐藥性研究熱點(diǎn)領(lǐng)域[8-9]。食用菌作為天然可食用的大型真菌，研究發(fā)現(xiàn)提取物和發(fā)酵液除了具有藥用價(jià)值外，還具有一定的抑菌能力。食用菌中的多糖成分能夠?qū)瘘S色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等多種微生物產(chǎn)生抑制作用[10-11]。羅青等[12]的研究發(fā)現(xiàn)靈芝和猴頭菌絲體發(fā)酵液能夠?qū)Υ竽c桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌產(chǎn)生抑制作用，其中猴頭的抑菌效果更優(yōu)。董蕾等[13]的研究發(fā)現(xiàn)杏鮑菇和蛹蟲草的發(fā)酵液、菌糠提取液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制效果。本研究采用紫色桿菌CV026 為研究菌株，對(duì)不同食用菌發(fā)酵液進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)香菇和雞腿菇發(fā)酵液加樣孔周圍紫色素含量降低，這兩種食用菌可顯著抑制紫色桿菌CV026 紫色素的產(chǎn)生，具有作為群體感應(yīng)抑制劑的潛能。

銅綠假單胞菌作為感染的常見致病菌，近年來在臨床中發(fā)現(xiàn)其耐藥性越來越嚴(yán)重。該菌的致病性受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，群體感應(yīng)系統(tǒng)能夠?qū)G膿菌素、胞外蛋白酶、生物膜等細(xì)菌生物學(xué)特征產(chǎn)生影響，增強(qiáng)了細(xì)菌的致病性[14]。生物膜是細(xì)菌分泌多種產(chǎn)物組成的復(fù)合物，依附于細(xì)菌表面。有生物膜的細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)能力提高，增加了在附著面的黏附能力，抑制部分藥物進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)，提高了細(xì)菌的耐藥性，逃避宿主的免疫防護(hù)[15]。本研究通過檢測(cè)香菇和雞腿菇發(fā)酵液對(duì)銅綠假單胞菌綠膿菌素、胞外蛋白酶、生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)這兩種發(fā)酵液可以抑制綠膿菌素、胞外蛋白酶和生物膜的的產(chǎn)生。

食用菌發(fā)酵液純天然無公害，對(duì)人體的安全性較高，其抑菌作用的深入研究將有可能在食品和醫(yī)療上得到應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)香菇、雞腿菇發(fā)酵液在控制銅綠假單胞菌感染中具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。通過對(duì)其作用成分的深入研究，將具有開發(fā)利用的巨大潛力。