農桿菌介導單子葉植物遺傳轉化研究進展

劉文欣

（山東農業(yè)大學 生命科學學院，山東 泰安 271018）

植物遺傳轉化即轉基因技術，是指將來自某一生物的目的基因或外源基因進行切割重組后引入植物，并使該基因在受體中穩(wěn)定地表達、轉移并獲得所需性狀的技術［1］。農桿菌具有對雙子葉植物的創(chuàng)傷部位侵染能力強，材料范圍廣，轉化率高，轉化子穩(wěn)定等優(yōu)勢，自借助農桿菌獲得首例轉基因煙草［2］后，農桿菌介導遺傳轉化技術便一直備受科研人員的關注。而單子葉植物薄壁細胞缺乏分化能力，因此，單子葉植物的愈傷組織并不能作為農桿菌的宿主，難以轉化，在早期農桿菌介導的單子葉植物基因轉化中，成功轉化的實例很少，所以人們普遍認為基于農桿菌的方法不適合于禾谷類和單子葉植物，但隨著對轉化機制的深入理解，農桿菌轉化法已然成為越來越多科研工作者選擇的主要途徑。

1 農桿菌介導遺傳轉化的原理

農桿菌是一種革蘭氏陰性菌，廣泛分布于土壤。20世紀初，其原理逐漸被人熟知，即自然狀態(tài)下可以在大部分的雙子葉植物的傷口處成功侵染，引起冠癭瘤的為根癌農桿菌，產(chǎn)生毛狀根的則為發(fā)根農桿菌［3］。轉化機制為利用Ti或Ri質粒，將一段DNA片段通過感染植株的傷口，傳入到宿主細胞中，然后通過減數(shù)分裂，將其傳遞到下一代［4］。因此，可以通過在T-DNA區(qū)域內插入目標基因加以改造，借助該區(qū)域的可轉移性，利用農桿菌的侵染，將基因導入到植物中，使其與植物細胞結合，進而利用細胞與組織培養(yǎng)技術獲得轉基因植株。

2 農桿菌轉化典型單子葉植物的研究進展

1984年，HERNALSTEENS等［5］首次成功將根癌農桿菌應用于單子葉植物石刁柏領域，為農桿菌應用于單子葉植物的轉化研究提供了理論依據(jù)，為單子葉植物的遺傳改良開辟了新的途徑。近年來，利用農桿菌介導的方法，已成功地應用于禾本科領域，并取得了較大的進展。

2.1 小麥

小麥是世界上最重要的谷類和植物蛋白來源。WOOLSTON等［6］盡管經(jīng)過多年研究尚未獲得轉基因植株，但卻通過1988年的感染試驗，證實了農桿菌對小麥細胞的可轉化性。1997年，CHENG等［7］將由35S啟動子、HSP70內含子構成的農桿菌載體插入到小麥中，并成功地得到了全球首個由農桿菌介導轉化的小麥，盡管最終轉化效率還比較低，但農桿菌轉化在小麥上的應用卻向前邁出了最初的一大步。之后，XIA等［8］報道了農桿菌介導的小麥抗性愈傷組織的誘導效應，并在此基礎上產(chǎn)生了再生植株。此后，隨著研究的不斷深入，已有越來越多的人成功地轉化了小麥，HESS等［9］將農桿菌注射到花期小麥穗的小穗上，發(fā)芽后獲得抗卡那霉素的植株，因此證明nptⅡ基因可以在小麥中穩(wěn)定遺傳。郭麗等［10］以小麥成熟胚為受體，獲得了3株PCR分析結果為陽性的再生植株，并構建了相應的遺傳轉化系統(tǒng)。目前，通過選擇標記和報告基因構建的轉化系統(tǒng)邁向了優(yōu)質基因的應用，轉化的途徑和條件也得到了進一步的改善。張月婷等［11］利用華麥13和揚麥158的胚胎作為受體材料，利用農桿菌介導技術，將ACE-D2基因導入到小麥中，使小麥的遺傳體系不斷擴大。閆棟［12］運用農桿菌介導法將含CL5527基因的重組質粒導入到愈傷組織中，進一步研究和優(yōu)化影響基因轉化效果的因素，確定了適宜的遺傳轉化條件。SINGH等［13］借助農桿菌采用無需組織培養(yǎng)的花噴霧轉化法，對3個面包小麥基因型進行花轉化，發(fā)現(xiàn)在Bobwhite和HD2967基因型中發(fā)生轉化，且轉化效率高，證明了花噴霧轉化法在轉基因面包小麥改良中具有極大的優(yōu)勢和潛能。

2.2 玉米

玉米是我國重要的糧食、飼料作物，也是一種具有代表性的單子葉模式作物。1996年，ISHIDA等［14］利用農桿菌LBA4404對A188玉米自交系的幼胚進行了轉化，得到了首個經(jīng)此技術轉化的玉米，并進一步驗證了該技術在玉米中應用的可行性，成為玉米遺傳轉化研究的堅實理論基礎。閆慧萍等［15］借助根癌農桿菌莖尖轉化技術發(fā)現(xiàn)，轉入2種外源基因的玉米植株在干旱脅迫下丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）含量會明顯下降，即外源基因的轉入對玉米的抗旱性具有明顯的影響。于彩虹等［16］借助農桿菌介導技術將構建的RNAi植物表達載體導入玉米幼胚Z31，獲得20株轉基因玉米T0代植株，雜交授粉后得到T1代種子，T1代植株都表現(xiàn)為雄性不育，而且與野生型對照植株之間沒有其他形態(tài)差異，從而得到完全雄性不育的植株，提高了雜交種的純度。韓平安等［17］借助農桿菌介導法對H99玉米自交系幼胚進行單因素試驗研究，得出最佳GUS表達率下的胚大小、農桿菌菌液濃度和培養(yǎng)時間，培育出抗草銨膦的植株。LIU等［18］利用未成熟胚進行農桿菌感染，通過對基因型、共培養(yǎng)條件、篩選濃度及分化培養(yǎng)基各物質濃度進行研究，進一步優(yōu)化了遺傳轉化體系，確定了最高誘導率的基因型、最佳的共培養(yǎng)方法以及分化培養(yǎng)基中物質濃度的最優(yōu)組合，確定了玉米遺傳轉化的最佳條件。李海霞等［19］以2個不同品種玉米雜交種的胚性愈傷組織為材料，對不同濃度的抗菌素、侵染液類型及侵染時間等條件進行了改進，得到優(yōu)質的抗性愈傷組織。

2.3 水稻

水稻是一種典型的單子葉植物，人們采用農桿菌介導水稻遺傳轉化已有相當長的歷史。水稻的遺傳轉化已經(jīng)從最初被認為不可能發(fā)展到可行，其應用領域已擴大到頻率的改良，從低頻轉化逐步優(yōu)化到高頻轉化。在此基礎上，水稻的遺傳轉化技術問題取得了重大突破，目前已成功開展了大量優(yōu)質外源基因向水稻的遺傳轉化［20］。

1993年首次報道了由農桿菌介導的粳稻胚胎遺傳轉化的個案［21］。1994年，HIEI等［22］在農桿菌介導的水稻轉化方面取得了突破，利用改進的農桿菌介導技術，將轉基因效率提高至28.6%，從分子層面上證實該基因已經(jīng)插入到水稻基因組中，且能夠穩(wěn)定地進行遺傳并構建了水稻轉化系統(tǒng)。RASHID等［23］應用農桿菌介導技術進行了秈稻的轉基因，為推廣該技術應用于秈稻打下了良好的基礎。LIN等［24］應用穿孔法，成功實現(xiàn)了農桿菌介導的粳稻轉化，該方法不需誘導愈傷組織，因此轉化速度快。高璐等［25］發(fā)現(xiàn)，利用2，4-D誘導水稻的成熟種子，7 d后的愈傷組織與農桿菌共轉化的效果最好，抗性愈傷的最佳選擇時間為14～28 d。崔永禎等［26］利用農桿菌介導技術，從高山離子芥中提取低溫誘導基因，并將其轉入水稻愈傷組織中，從而選育出耐冷性優(yōu)良水稻新品種。XU等［27］改良農桿菌介導的水稻轉化方法，為水稻雜交制種提供了優(yōu)良的遺傳去雄手段。王慧杰［28］以粳稻品種日本晴，秈稻品種明恢86、9311作為遺傳轉化材料，探究了不同篩選標記基因、不同培養(yǎng)條件、2個胚形態(tài)建成基因和三元載體系統(tǒng)對水稻遺傳轉化效率的影響，并建立了一種用于水稻遺傳轉化的三元載體系統(tǒng)。結果表明，三元載體系統(tǒng)引入額外的毒力基因Vir，提高了農桿菌侵染效率，且相比于雙元載體，三元載體有效提高了明恢86的遺傳轉化效率。殷敏［29］對脫落酸濃度、共培養(yǎng)時間等不同條件進行優(yōu)化，建立了水稻轉化體系。

3 影響單子葉植物遺傳轉化效率的因素

農桿菌通過5個步驟將所攜帶的外源基因導入到植物中：（1）土壤中農桿菌與植物敏感細胞間的相互作用及吸附；（2）激活土壤農桿菌的毒性區(qū)；（3）TDNA的切割和T復合物的生成；（4）T復合物借助土壤農桿菌通過植物細胞膜進入植物細胞；（5）T-DNA整合到植物染色體上。農桿菌介導的單子葉植物的遺傳轉化可大概總結為：農桿菌對單子葉植物細胞的吸附；農桿菌產(chǎn)生毒性以造成對植物細胞的侵染；最后，T-DNA成功進入植物細胞并順利整合［30］。

3.1 農桿菌的侵染能力

農桿菌和植物之間的互作是轉化的第1步，因此，篩選出高感染率的菌株是成功的關鍵。在農桿菌的侵染體系中，菌種與載體的正確選擇會極大影響轉化效率。不同的菌種其宿主范圍也各不相同，因此，即便是同一宿主，選擇不同的菌種進行侵染，其轉化效率也會有所不同。如易自立等［31］用EHA105、LBA4404和AGL1侵染水稻愈傷組織時發(fā)現(xiàn)，3種農桿菌對愈傷組織的轉化能力存在一定差異，其中EHA105的侵染轉化能力最好。蔣云等［32］用2種不同的農桿菌菌系感染小麥，認為利用C58C1菌株的抗性愈傷組織分化率更高，從而優(yōu)選出感染力強的菌株。

3.2 Ti質粒毒性區(qū)的激活

只有VirA-VirG二元調節(jié)系統(tǒng)活化才會使農桿菌中的Ti質粒毒性區(qū)發(fā)揮作用。首先，VirA蛋白作為受體與乙酰丁香酮（AS）等酚類物質的信號分子結合，將VirG蛋白磷酸化而被激活，隨后活化的VirG蛋白與其他毒性區(qū)域的啟動子結合，起始毒性區(qū)的轉錄過程［30］。但是部分單子葉植物遭受外部環(huán)境刺激損傷時，細胞會出現(xiàn)木質化、硬化，酚類物質的產(chǎn)生則被抑制，這也是導致單子葉植物不能作為農桿菌有效宿主的主要因素［33］。但許東暉等［34］在水稻部分時期的葉片抽提液中檢測到了酚類黃酮化合物。因此，可以得知，單子葉植物無法進行基因改造的根本原因不在于它缺少信號分子，而在于它僅存在于一定的發(fā)育時期中。因此，要合理的選擇植物受體，并運用相應的方法進行適當?shù)奶幚?，在內源分子濃度較低的情況下通過外源調節(jié)方法來提高農桿菌的侵染能力。在對很多轉基因單子葉植物進行研究時，往往把AS等信號分子作為共培養(yǎng)過程中重要且必不可少的信號分子。

3.3 單子葉植物的基因型

在農桿菌介導技術的轉化過程中，基因環(huán)境和受體本身狀態(tài)的影響也很大。當T復合物進入植物細胞后，植物細胞本身的敏感性便成為限制農桿菌發(fā)揮作用的重要因素。不同類型的組織和細胞的敏感程度存在差異，所以選擇合適的單子葉植物是實現(xiàn)轉化的先決條件。1986年，ABE等［35］經(jīng)過對66個粳稻、秈稻品種組織培養(yǎng)后得出，不同品種的培養(yǎng)力差異明顯。粳稻一般具有較高轉化率和成功率，而秈稻愈傷誘導和再生能力相對較弱，其轉化率通常不超過10%。郭志江等［36］檢測了68個小麥品種成熟胚的GUS基因表達，并對部分品種的幼胚進行PCR檢測，篩選出了優(yōu)良的農桿菌侵染敏感型受體材料。李朝煒等［37］借助農桿菌對石4185和科麥一號2個小麥品種的成熟胚進行轉化，經(jīng)過對GUS表達率的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，用LBA4404菌株進行侵染時，轉化率相差近15%。AADEL等［38］研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型的小麥成熟胚的轉化結果各不相同，Amal和Rajae基因型的轉基因植株最多。

3.4 其他因素

農桿菌導入受體后，再生系統(tǒng)還需要有合適的培養(yǎng)基來進行移植，否則同樣難以實現(xiàn)成功轉化。在組織培養(yǎng)過程中，為了促進細胞分裂、誘導愈傷組織和生根，通常會向培養(yǎng)基中加入一定的植物生長調節(jié)劑，有利于細胞分裂，活躍培養(yǎng)基，促進轉化。彭亞博等［39］發(fā)現(xiàn)，2，4-D和Picoram（氨氯吡啶酸）在愈傷組織的早期預培養(yǎng)階段具有促進成熟胚誘導的作用。但不同品種對應植物生長調節(jié)劑的最適濃度及種類不相同，且成熟胚和幼胚的培養(yǎng)條件也不相同。同時，共培養(yǎng)階段不同的培養(yǎng)基類型及添加的植物生長調節(jié)劑、微量元素與無機離子等成分也會對轉化效果產(chǎn)生很大的影響。

4 提高農桿菌轉化效率的方法

4.1 添加表面活性劑

目前，國內外廣泛使用的表面活性劑有離子型和非離子型2種，非離子型毒性相對較低，對植物的殺傷力較小。表面活性劑的使用能夠改善細胞膜的透過性，所以在農桿菌的基因轉化中，能夠有效地增強其對植株的吸附能力，并加快T-DNA從農桿菌中向植物傳遞，提高其轉化率。王志成等［40］改良了農桿菌轉化水稻的方法，結果表明，用表面活性劑0.1%Tween 20溶液可降低細胞表面張力，提高愈傷組織的侵染和轉化，使抗性植株再生能力得到提高。CHHABRA等［41］的研究發(fā)現(xiàn)，在農桿菌侵染液中加入0.2%Tween 20會顯著提高農桿菌對小麥愈傷組織的轉化，但超過一定的濃度范圍時GUS瞬時表達率便大幅度下降。

4.2 添加抗氧化劑

在農桿菌轉化單子葉植物過程中，共培養(yǎng)階段愈傷組織會出現(xiàn)影響組織分化的褐化現(xiàn)象。這是因為在逆境中，植物細胞內存在大量過氧化物，細胞產(chǎn)生氧化脅迫反應。因此，添加抗氧化劑使細胞內的活性氧成分被有效清除，并能促進組織分化。王秀紅等［42］對農桿菌介導轉化玉米有關因素進行了研究，愈傷組織誘導率與AgNO3質量濃度呈顯著的正相關關系，其中AgNO3質量濃度為5.0 mg/L時誘導率可高達94.3%，與未添加AgNO3相比，胚性愈傷率增加37.2%；此外通過直觀觀察還發(fā)現(xiàn)，AgNO3的添加有效地緩解了褐色物質的分泌，對基質的透明度有一定的持續(xù)作用。

4.3 超聲波處理

超聲波引發(fā)產(chǎn)生的高壓高溫沖擊，會使組織表面和細胞膜上形成大量的微小傷口，加速農桿菌對植物的侵染，提高轉化效率。王旭明等［43］對已經(jīng)萌發(fā)的小麥種子進行超聲波處理一段時間后，經(jīng)農桿菌侵染處理，使之達到結實狀態(tài)，并用卡那霉素對成熟種子進行抗性篩選，PCR分析結果表明，產(chǎn)生的植株均為抗性后代，而GUS染色結果表明，未經(jīng)超聲波處理的種子，沒有發(fā)生轉化。然而超聲波產(chǎn)生的熱化作用不可避免地損傷植物，因此，超聲波處理的時間和強度要適宜。

4.4 共培養(yǎng)過程中干燥處理

在農桿菌感染后，農桿菌的存活和再生能力會受植物細胞生理狀態(tài)等因素的影響。適當?shù)母稍锾幚砜梢源龠M組織水分的流失，提高滲透勢，增強農桿菌的吸附作用和T-DNA的轉移，促進細胞的分裂，使愈傷組織的生長分化能力增強。CHENG等［7］首次在濾紙上將小麥幼胚與農桿菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)干燥共培養(yǎng)處理對T-DNA轉移和細胞的恢復再生有明顯的促進作用。共培養(yǎng)后所有幼胚全部存活并快速生長，而非干燥對照組的幼胚存活率只有60%～80%，且恢復生長緩慢。另外，干燥條件下農桿菌的過度生長受到明顯抑制，其數(shù)量是對照組的25%左右。丁莉萍等［44］在濾紙上共培養(yǎng)小麥成熟胚愈傷組織與農桿菌，GUS瞬時表達率可高達90%，表明干燥條件下的愈傷中的細菌數(shù)量少，有利于抑制后續(xù)農桿菌的培養(yǎng)和受體組織的再生，有效地促進轉化。彭亞博等［39］利用無菌濾紙進行干燥共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，預培養(yǎng)時間較短時能顯著提高愈傷分化率，經(jīng)GUS染色發(fā)現(xiàn)干燥處理出現(xiàn)藍斑，而未干燥處理無染色現(xiàn)象。

5 小結與展望

農桿菌介導法在生物監(jiān)測與解毒、提高作物產(chǎn)量、提高作物營養(yǎng)價值等方面發(fā)揮著至關重要的作用。如今農桿菌介導單子葉植物遺傳轉化已在許多領域取得了長足的發(fā)展。近幾年來在小麥、玉米、水稻等作物領域，通過改良一些單子葉植物的相關基因，其品質和產(chǎn)量大大提高。但是與農桿菌技術在雙子葉植物的應用相比，目前還面臨著許多問題，如轉化范圍窄、轉化效率低、感受態(tài)細胞稀少、外源基因表達量低等［33］。因此，今后農桿菌介導單子葉植物的研究還需進一步加強，尤其是在分子水平對其深入探討，同時對影響轉化率相關因素的主要作用進行更科學完善的分析，從農桿菌侵染植物細胞的原理入手，不斷優(yōu)化轉化方法，逐漸擴大遺傳轉化的范圍，得到更優(yōu)的遺傳轉化體系。此外，無選擇標記基因的轉基因植株生產(chǎn)也是如今亟待解決的關鍵問題。