柴胡-黃芩對(duì)急性胰腺炎大鼠的抗炎及鎮(zhèn)痛作用研究

陳丹丹，宋 亮，衛(wèi)培峰

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）作為臨床上一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)急重癥，主要表現(xiàn)為劇烈持續(xù)的上腹部疼痛、惡心嘔吐、發(fā)熱、血胰酶升高等［1］，AP 的發(fā)病率逐年升高，目前已達(dá)到萬(wàn)分之三十，其中10%～20%會(huì)發(fā)展為重癥急性胰腺炎［2-3］，發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎就要及時(shí)有效的治療，如果病情繼續(xù)發(fā)展，就會(huì)危及患者的生命健康，死亡率為20%～40%。近年來(lái)，隨著對(duì)AP 的研究發(fā)現(xiàn)，采用中藥治療AP 會(huì)減少副作用及并發(fā)癥的發(fā)生，降低死亡率［4-6］。

中醫(yī)治療AP 主要是以疏肝理氣、清熱解毒、通里瀉下為主，柴胡-黃芩是根據(jù)中醫(yī)“益活清下”治療思想為指導(dǎo)加疏肝解郁、活血散瘀、理氣止痛而生［7-9］，能夠修復(fù)胰腺損傷，清除腸道生物屏障和腸源性內(nèi)毒素，抑制蛋白酶激活和腸道細(xì)菌移位，具有一定的抗炎、止痛和抗氧化活性［10-12］。本研究通過(guò)腹腔注射20%L-精氨酸復(fù)制急性胰腺炎大鼠模型，觀察柴胡-黃芩對(duì)急性胰腺炎大鼠炎性反應(yīng)、疼痛反應(yīng)及抗氧化能力的影響，為該藥對(duì)用于治療急性胰腺炎提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試劑與儀器

白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β，1L-1β）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，1L-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor nercrosis factor-α，TNF-α）、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；過(guò)氧化氫酶（Catalase form micrococcus lysodeikticus，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒采購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；抗p-NF-κB p65 抗體、抗NF-κB p65 抗體、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

使用儀器包括：Practum-5101-1CN-電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；TGL-20B-離心機(jī)（上海雅程儀器設(shè)備有限公司）；1510-03241-酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；BS-330E-邁瑞全自動(dòng)血清生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只，約6 周齡，體質(zhì)量200 ± 20 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030。動(dòng)物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試藥

稱取柴胡飲片15 g，黃芩飲片15 g（根據(jù)柴芩承氣湯中柴胡-黃芩劑量）［12］，加入8倍量水，將兩味藥浸泡30 min。煮沸10 min 后保持微沸30 min，過(guò)濾后保留濾液；藥渣加入6 倍量水，煮沸后保持微沸20 min，過(guò)濾；合并2次濾液，配成生藥用量為1 g/mL的柴胡-黃芩水煎液。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥

SD 雄性大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為3組：陰性對(duì)照組、AP 模型組和柴胡-黃芩干預(yù)組，每組10 只。其中，AP 模型組和柴胡-黃芩干預(yù)組腹腔注射20% L-精氨酸（L-Arg，2.5 g/kg，2 次，間隔1 h）復(fù)制AP 模型［13］，隨后分別給予生理鹽水（6 mL/kg）和柴胡-黃芩水煎液（6 mL/kg；約為臨床人用劑量12.0 倍，人體質(zhì)量按60 kg 計(jì)）灌胃，每天2 次，連續(xù)3 d。陰性對(duì)照組給予相應(yīng)的生理鹽水腹腔注射和灌胃。

2.2 大鼠疼痛行為觀察

將大鼠放入熱板刺激儀的有機(jī)玻璃罩內(nèi)適應(yīng)30 min后取出，將熱板升溫至50℃，再次將大鼠放入有機(jī)玻璃罩內(nèi)，從大鼠腳掌接觸熱板開(kāi)始計(jì)時(shí)，大鼠第1 次出現(xiàn)舔后足或抬起即縮足反應(yīng)時(shí)計(jì)時(shí)停止，此時(shí)間為大鼠腳掌回縮潛伏期（Paw withdraw latency，PWL）。

2.3 采集血清

首次注射L-Arg 或生理鹽水72 h 后，用1%戊巴比妥鈉［14］（6 mL/kg）麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，收集至10 mL 離心管內(nèi)，待血液凝固后，3 000 rpm/min離心20 min 后分離血清，分裝凍存，標(biāo)記后于-80℃冰箱保存。檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α、CAT、GSHPx、MDA 活性；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清淀粉酶水平。

2.4 胰腺組織病理學(xué)檢測(cè)

取胰腺組織后用4%多聚甲醛固定24 h 后，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，脫蠟后進(jìn)行染色，脫水后封片。顯微鏡下觀測(cè)各組胰腺組織病理變化。

2.5 Western blot 法檢測(cè)

取胰腺組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白，采用BCA 試劑盒定量分析，隨后常規(guī)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（p-NF-κB p65，1：1 000 稀釋；NF-κB p65，1：1 000 稀釋；GAPDH，1：2 000稀釋）、洗膜、孵育二抗、洗膜、最后采用ECL發(fā)光，對(duì)圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠疼痛行為

與陰性對(duì)照組比較，AP 模型組大鼠第1 次出現(xiàn)疼痛行為（舔后足或抬起）的時(shí)間顯著縮短，與AP模型組比較，柴胡-黃芩藥對(duì)干預(yù)能使大鼠疼痛行為第1次出現(xiàn)時(shí)間延長(zhǎng)，見(jiàn)表1。

表1 大鼠第1次疼痛行為的出現(xiàn)時(shí)間Tab.1 The appearance time of the first pain behavior in rat

3.2 胰腺組織病理改變

陰性對(duì)照組大鼠的胰腺細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰，未見(jiàn)炎性細(xì)胞。AP 模型組大鼠胰腺組織可見(jiàn)大片凝固性壞死，未壞死細(xì)胞也表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)模糊不清，且組織明顯水腫，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。柴胡-黃芩干預(yù)后，胰腺組織水腫程度減輕，片狀壞死區(qū)域減少，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞數(shù)量降低，但仍可見(jiàn)少量壞死區(qū)域。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠胰腺組織H&E染色Fig.1 H&E staining of pancreatic tissue in rats

3.3 血清淀粉酶水平

與陰性對(duì)照組相比，AP模型組血清淀粉酶水平明顯升高，與AP 模型組比較，柴胡-黃芩干預(yù)能夠降低血清淀粉酶水平。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 血清淀粉酶活性Tab.2 The amylase activity in serum

3.4 血清炎性因子水平

和陰性對(duì)照組相比，AP模型組大鼠血清的促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，與預(yù)期結(jié)果一致，而使用柴胡-黃芩干預(yù)之后，三種炎性因子表達(dá)水平均出現(xiàn)回落。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量Tab.3 The contents of IL-6、IL-1β and TNF-α in serum

3.5 大鼠胰腺組織NF-κB通路活性變化

如圖2所示，與陰性對(duì)照組相比，AP 模型組大鼠胰腺組織內(nèi)NF-κB p65蛋白的磷酸化程度明顯升高，表現(xiàn)為p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)量顯著增加，而NF-κB p65 蛋白表達(dá)量無(wú)明顯改變。柴胡-黃芩干預(yù)后，p-NF-κB p65蛋白表達(dá)下降，未明顯影響NFκB p65 蛋白表達(dá)。提示柴胡-黃芩干預(yù)抑制了AP發(fā)生時(shí)出現(xiàn)的NF-κB通路活化。

圖2 胰腺組織NF-κB通路活性變化Fig.2 The activity of NF-κB pathway in pancreatic tissue

3.6 血清CAT、GSH-Px、MDA含量

與陰性對(duì)照組相比，AP 模型組大鼠血清的CAT、GSH-Px 水平明顯降低，MDA 水平顯著性升高。使用柴胡-黃芩干預(yù)之后，大鼠血清CAT、GSHPx 水平出現(xiàn)回升，MDA 水平顯著回落。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 血清CAT、GSH-Px和MDA水平Tab.4 The levels of CAT、GSH-Px and MDA in serum

4 討論

AP 發(fā)病急，病情進(jìn)展快，在臨床上出現(xiàn)胰腺?gòu)浡猿鲅?、組織局部壞死等，并伴有膿毒血癥、多臟器衰竭等，如果不能及時(shí)采取有效治療措施，疾病致死率較高［13-14］。目前認(rèn)為，AP 誘發(fā)多器官損傷的主要發(fā)病機(jī)制在于：①局部炎癥引起大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，釋放眾多細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)發(fā)生；②腸黏膜屏障功能障礙，使得腸功能衰竭，出現(xiàn)細(xì)菌移位［15］。已有研究證明，抑制AP 時(shí)炎癥因子釋放和提高抗氧化能力能夠改善AP的病理進(jìn)程［16-17］。

中藥藥對(duì)配伍是在辨證審機(jī)、確立治法的基礎(chǔ)上，按照組方結(jié)構(gòu)選擇藥物，酌定用量而妥善配伍組成的有特定劑型用法的配伍藥對(duì)。中藥藥對(duì)柴胡-黃芩可以有效緩解急性胰腺炎。柴胡能夠疏散退熱并有抗炎作用，黃芩能夠清熱燥濕、瀉火解毒、對(duì)急、慢性炎癥均有抑制作用，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者配成藥對(duì)，可以抑制炎癥反應(yīng)，而且1：1的配對(duì)比例效果最佳［18］，起到緩解急性胰腺炎癥狀的作用。因此，本研究選擇柴胡-黃芩藥對(duì)AP進(jìn)行干預(yù)，觀察柴胡-黃芩聯(lián)用對(duì)AP 大鼠的治療效果。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柴胡-黃芩能夠延長(zhǎng)大鼠疼痛行為第1次出現(xiàn)時(shí)間，說(shuō)明此藥對(duì)具有減輕炎性疼痛的作用，但潛在機(jī)制尚有待闡明。而且，柴胡-黃芩干預(yù)能夠改善AP 大鼠的胰腺損傷，明顯降低AP 大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平，并抑制大鼠胰腺內(nèi)NFκB通路活化，說(shuō)明柴胡-黃芩對(duì)胰腺的保護(hù)作用可能和抑制NFκB通路，減少促炎因子表達(dá)有關(guān)。機(jī)體具有清除多余自由基的能力，主要依靠?jī)?nèi)源性自由基清除系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶、CAT、GSH-Px 等酶類發(fā)揮作用［19］。AP 發(fā)生時(shí)，機(jī)體的抗氧化能力降低，經(jīng)柴胡-黃芩干預(yù)治療后使CAT、GSH-Px水平升高，MDA水平降低，提示柴胡-黃芩能夠提高抗氧化能力。本研究結(jié)果說(shuō)明柴胡-黃芩可能通過(guò)抑制炎性反應(yīng)和提高抗氧化能力發(fā)揮對(duì)AP 的治療作用，但1：1 的配比是否是最佳比例，需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

中藥藥對(duì)既是辨證論證的產(chǎn)物，也是古今醫(yī)家臨床經(jīng)驗(yàn)與學(xué)術(shù)思想的載體。中藥藥對(duì)作為理法方藥的重要組成部分，一直是中醫(yī)防治疾病的主要工具。研究藥對(duì)配伍是對(duì)傳統(tǒng)中醫(yī)藥配伍理論的一種傳承創(chuàng)新與豐富發(fā)展，對(duì)開(kāi)拓中藥新藥創(chuàng)制研究與推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化、國(guó)際化發(fā)展具有重要意義。