外周血淋巴細胞染色體畸變分析中的標本制備解析及常見問題

陳盼盼，傅春林，馮駿超，馬楠，劉玉龍

(1.96603部隊醫(yī)院檢驗科，湖南 懷化，418000； 2.蘇州大學附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州，215004)

外周血淋巴細胞培養(yǎng)及標本制片技術是輻射細胞遺傳學的重要實驗步驟。細胞培養(yǎng)程序簡單，但要求嚴謹，要使細胞在體外長期生存，必須模擬體內環(huán)境，供給細胞存活所必需的條件。培養(yǎng)后的淋巴細胞要經(jīng)過低滲、固定、制片、染色等步驟才能進行染色體畸變的分析。其過程對實驗環(huán)境的溫濕度、試劑的質量和配比、技術人員的操作水平都有一定要求。本文結合實踐工作，介紹了淋巴細胞染色體畸變類型、染色體標本操作流程及常見問題。

1 染色體畸變

染色體畸變是指染色體在受到物理、化學及生物因素影響后發(fā)生的數(shù)目和結構的改變，包括染色體結構畸變和數(shù)目異常，前者又可分為染色單體型畸變和染色體型畸變。染色單體型畸變主要有單體裂隙、單體斷裂、單體缺失、單體互換等。染色體型畸變主要包括雙著絲粒或多著絲粒體(dic)、著絲粒環(huán)(r)、無著絲粒環(huán)(ar)、無著絲粒斷片(f)、微小體(min)、相互易位(t)、倒位(inv)和缺失(del)，其中ar、f和min統(tǒng)稱為無著絲粒體(ace)，在上述畸變中除del和f為電離輻射一次擊中外，其他畸變均為2次或2次以上擊中。按照染色體型畸變在體內的轉歸，又可將上述這些畸變分為非穩(wěn)定性染色體畸變和穩(wěn)定性染色體畸變，前者在細胞分裂的后期會形成染色體橋引起細胞死亡(dic、r)或因沒有著絲粒結構隨細胞分裂丟失(ace)故稱非穩(wěn)定性畸變，后者(t、inv和del)在細胞分裂中不存在力學障礙，細胞分裂不受影響可在體內長時間存在故稱為穩(wěn)定性畸變[1]。在放射工作人員職業(yè)健康檢查和生物劑量估算中，主要分析受檢者的外周血淋巴細胞染色體型畸變，利用雙著絲粒染色體(dic)指標估算生物劑量也是迄今為止唯一得到國際學界認可的“金標準”[2]。

2 標本制備流程解析

外周血中小淋巴細胞幾乎都處在細胞增殖周期的G1期或G0期(不同于體外培養(yǎng)的體細胞)，一般條件下是不會再分裂的。當在培養(yǎng)物中加入適量的植物血凝素(PHA)，37 ℃培養(yǎng)52～72 h后，淋巴細胞開始轉化，進入細胞增殖周期，此時可獲得大量的有絲分裂細胞。再經(jīng)過秋水仙素的處理、低滲、固定，即可在顯微鏡下觀察到良好的中期染色體分裂相[3]。

2.1 血樣采集

采集受檢者靜脈血約2 mL注入肝素抗凝管內，顛倒混勻。

解析：適量的肝素抗凝劑不會影響細胞在體外的生長和染色體收獲，而其它抗凝劑如EDTA一般會抑制細胞生長[2]。

2.2 細胞培養(yǎng)

將采集的靜脈血取0.3～0.5 mL，加入配制好的5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基[4]中混勻，在培養(yǎng)瓶上標注培養(yǎng)開始時間和日期。每人接種兩瓶，以防細胞量不夠。如果懷疑受照人員可適當增加接種數(shù)量。在培養(yǎng)開始前每瓶培養(yǎng)基內加入終濃度為0.04 μg/mL的秋水仙素，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～52 h后收獲細胞[1]。

解析：秋水仙素就是秋水仙堿，是一種生物堿。純秋水仙素呈黃色針狀結晶，熔點157 ℃。易溶于水、乙醇和氯仿。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在細胞分裂的中期[5]。在染色體畸變分析中，要求加入秋水仙素的終濃度可以使99%以上的有絲分裂相為第一次有絲分裂細胞，才可使非穩(wěn)定性染色體畸變的丟失不會影響檢測結果。

2.3 染色體標本制備

2.3.1低滲

將已到培養(yǎng)時間的培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，用吸管棄掉上清液，加入8 mL經(jīng)37 ℃預熱的0.075 mol/L氯化鉀低滲液,將細胞團塊充分打勻后轉移至10 mL的尖底離心管內，放入37 ℃恒溫水浴箱中低滲20～30 min。

解析：低滲液是指滲透壓和離子強度均低于正常細胞生理條件的溶液，與培養(yǎng)的外周血混合后水分子進入血細胞內，使淋巴細胞質膜膨脹，紅細胞膜破裂，經(jīng)離心后棄掉上清液完成低滲。一般選用0.075 mol/L氯化鉀作為低滲液，其優(yōu)點有：①染色體輪廓清楚，可染色性強，染色時間短；②用于顯帶染色時能充分顯示帶型特點；③37 ℃低滲處理20～30 min，可提高淋巴細胞膜通透性及誘導細胞脹大，去除其中的紅細胞碎片和一部分細胞雜質[6]。

2.3.2預固定

從37 ℃恒溫水浴箱中取出低滲完的離心管，每管加入1～2 mL新配制的固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)，用潔凈吸管輕輕吹打混勻后，水平離心機1 000～1 500 r/min，離心8～10 min。

解析：固定液的重要特性是能迅速穿透細胞，將其固定并維持染色體結構的完整性，還能夠增強染色體的嗜堿性，達到優(yōu)良染色效果。甲醇和冰乙酸都具有揮發(fā)性，長時間放置會影響固定效果，每次使用前需要臨時配制固定液。經(jīng)固定處理的細胞懸液滴在載玻片表面干燥后，染色體會牢牢的粘在載玻片表面，在后期的染色過程中也不會脫落，也不會改變染色體的分散程度。

2.3.3第一次固定

取出離心管，棄掉上清液，沿管壁往每個離心管內加入8 mL固定液，用吸管快速吹打細胞團塊使之混勻，常溫下固定20～30 min。然后在水平離心機中1 000～1 500 r/min，離心8 min。

2.3.4第二次固定

取出離心管，重復第一次固定操作，如二次固定完細胞團顏色較深可以再重復固定1次，直到細胞懸液為淡白色狀。

2.3.5制片

取出離心管，棄掉上清液，根據(jù)細胞團塊大小每離心管內加入3～5滴固定液以調節(jié)細胞濃度，然后以一定高度(10～30 cm)將細胞懸液滴在30～45度角斜面放置(傾角過大會損失很多細胞，一般是手持載玻片以水平或一定傾角滴片)，4 ℃預冷的潔凈載玻片上。每張玻片滴2～3滴，對滴好的玻片逐一核對編號，室溫放置自然干燥，做好記錄。

解析：細胞懸液以一定高度滴在載玻片上，細胞懸液在載玻片表面沿長軸方向由一端流向另一端。在表面張力的作用下細胞變扁，中期細胞內的染色體變得靠近細胞膜上下表面，遇冷細胞膜更容易破裂。隨著細胞在載玻片表面流動，固定液的進一步揮發(fā)，細胞破裂，染色體從中期細胞中釋放出來[7]。

2.3.6染色

將pH6.8的磷酸緩沖液與吉姆薩(Giemsa)原液混合，配制成10%的吉姆薩磷酸鹽染液(pH6.8磷酸緩沖液：吉姆薩(Giemsa)原液=9∶1)，染色8～10 min，以一定傾斜角度用自來水輕輕從玻片長軸沖洗，洗掉染液后置于玻片架上室溫自然晾干。

解析：pH6.8的磷酸緩沖液，用于調節(jié)pH值。吉姆薩染液為天青色素、伊紅、次甲藍的混合物，可將細胞核染成紫紅色或藍紫色，胞漿成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細胞染色體圖像[6]。

3 染色體標本制備中常見問題

當輻射遺傳學實驗室遇到技術問題時，首先要確定問題可能發(fā)生在哪個階段，確定解決問題的方向，再進行下一步的分析和檢測，以最快的速度發(fā)現(xiàn)問題和解決問題。如何盡可能地避免問題的發(fā)生，可以從以下幾個方面進行考慮。

(1)需建立完整的實驗室工作流程、規(guī)章制度和標準化操作規(guī)程。不擅自改變已有的實驗條件，詳細認真地對實驗過程進行記錄。

(2)有條件的實驗室建立和應用細胞遺傳學信息化系統(tǒng)，對實驗和分析全流程進行信息記錄和過程監(jiān)控，保證樣品處理和分析過程有可溯源性。

(3)輻射遺傳學實驗室盡可能使用有質量保障的試劑和耗材，定期清點耗材，應用耗材出入庫系統(tǒng)。對新批次的試劑和耗材進行嚴格的驗證測試，使用質量合格的產品。

(4)實驗室之間經(jīng)常進行技術交流，參與線上線下的交流會，必要時派遣人員外出進修學習，總結經(jīng)驗，提高人員水平。

(5)定期對實驗室的儀器進行計量校正，儀器進行定期保養(yǎng)維護，保證其使用過程中的穩(wěn)定性。

染色體標本制備中常見問題列于表1。

4 結論

染色體標本制備步驟多且復雜，整個試驗的周期較長，環(huán)節(jié)較多，操作繁瑣，易受實驗室環(huán)境溫度、濕度的影響。輻射遺傳學實驗室在日常的染色體畸變分析中常常會遇到各種各樣的問題。無法快速和高效的解決遇到的問題，會給輻射遺傳學實驗室的日常工作帶來很大的麻煩。了解試驗的本質，能更好的面對試驗中出現(xiàn)的各種問題，解決問題，保證分析結果的可靠性。