牛病毒性腹瀉-粘膜病實驗室診斷技術(shù)

陳智麗

（南京市溧水區(qū)永陽街道畜牧獸醫(yī)站，江蘇 南京 211200）

牛病毒性腹瀉-粘膜病需要采用實驗室檢測對病毒進行識別，為病毒診斷提供有效依據(jù)。隨著對牛病毒性腹瀉-粘膜病診斷技術(shù)的深入研究，已經(jīng)建立了多種診斷牛病毒性腹瀉粘膜病的診斷方法，本文將主要的方法介紹如下，供參考和選擇。

1 臨床表現(xiàn)

牛病毒性腹瀉-粘膜病是由牛病毒性腹瀉病毒感染引起，對牛具有較大的危害，該病的潛伏期7～10d。該病的臨床癥狀比較明顯可分急性和慢性兩種。（1）急性病癥 潛伏期一般在1周左右，病牛將出現(xiàn)持續(xù)高燒、精神不振等癥狀。嚴重時，將會引發(fā)腹瀉，致使牛體內(nèi)水分流失，使其體溫升高，進而引發(fā)牛的死亡。（2）慢性病癥 病牛的體溫長期偏高，臨床表現(xiàn)不如急性腹瀉劇烈，但同樣會對牛造成較大影響。而且，牛的眼角、鼻腔會出現(xiàn)大量的分泌物，導(dǎo)致牛逐漸消瘦，使其失去健康的體征。該病后期，病牛會極度消瘦，黏膜會出現(xiàn)大量的充血，腸道伴有粘液、氣泡等，導(dǎo)致牛無法正常采食，使其逐漸衰弱而死亡。所以，需要做好該病的防治工作，避免該病的發(fā)生和流行，應(yīng)結(jié)合實驗室診斷的方式，使病變能夠得到及早預(yù)防，降低粘膜病對牛的影響。

2 實驗室診斷技術(shù)

2.1 免疫過氧化物酶技術(shù)該技術(shù)具有較強的可靠性，診斷結(jié)果較為準確。采用該技術(shù)檢測時，需要對BVD-MDV抗原進行檢測，對其分布狀況進行確定，對抗原，需要采用過氧化物酶進行處理，制作組織切片，抗原將固定在組織中，確?？乖瓩z測精確度。切片需要采用0.02%蛋白酶進行處理，在4℃環(huán)境下，對切片進行消化處理，提高切片對酶的親和度。牛病毒性腹瀉—粘膜病屬于持續(xù)性的病毒血癥，對組織的影響較為嚴重，對病毒抗原應(yīng)進行嚴格檢測，提高病原檢測技術(shù)的有效性。對BVD-MDV可以采用間接鑒定形式，通過過氧化物酶對切片的著色檢查，借由免疫熒光法進行檢驗，進而可以通過顯微鏡進行觀察，確保染色后的細胞能夠肉眼可見。

2.2 蛋白A膠體金免疫電鏡技術(shù)電鏡檢查是病毒診斷的重要方式，能夠?qū)崿F(xiàn)病毒粒子的檢測，對病毒粒子進行敏感識別。電鏡技術(shù)對病毒粒子數(shù)量具有一定的要求，需要控制在107個/mL，保證病毒能夠通過電鏡進行識別。電鏡技術(shù)需要采用高速離心操作，對病毒液進行濃縮處理，以降低對病毒鑒定的難度。電鏡具有較高的檢測密度，可以在低倍數(shù)的情況下進行檢查，使病毒檢測便具可靠性，提高對病毒的識別能力。在蛋白A膠體金免疫的作用下，實現(xiàn)對抗原-抗體復(fù)合物的識別，使其形成抗體橋的形式，使金顆粒能夠分布在抗橋的周圍，確保病毒構(gòu)造的清晰程度。該診斷技術(shù)檢測過程較為迅速，對病毒的識別較為敏感，在診斷時間方面，僅用3～4h便可完成檢驗。電鏡技術(shù)可對病毒的特征進行識別，對病毒囊膜上的纖突進行確定，檢測具有較高的敏感性。

2.3 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)是較為新穎的診斷技術(shù)，并且實驗要求較高。核酸雜交可以對病變細胞進行識別，通常采用基因探針識別的方式，對病變細胞的基因序列進行檢驗。核酸雜交技術(shù)具有較強的敏感性，屬于基因檢測范疇，要重視探針的使用方法，提高探針的應(yīng)用水平。應(yīng)用該技術(shù)時，需要采用雜交方式進行診斷，通過對雜交率進行分析，對病毒對細胞的感染情況進行判斷?；蛱结樉哂休^強的針對性，其診斷精度很高，診斷過程中具有較高的檢出率。核酸雜交技術(shù)的難點在于對探針的制作，需要以病毒核酸作為制作探針的依據(jù)，確保探針能夠?qū)Σ≡催M行精準識別，保證雜家技術(shù)應(yīng)用的合理性。

2.4 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)該技術(shù)具有較高的敏感性、特異性，操作比較方便，適用于對病變細胞的檢測。聚合酶鏈反應(yīng)需要對引物進行DNA的序列層面擴增，同時需要在正常細胞中培養(yǎng)，將病變細胞與其進行對比，使病毒的檢測更加的標準化。在聚合酶的作用下，可以對病毒進行反轉(zhuǎn)錄，提高病毒檢測的敏感性。檢測過程中，敏感度的臨界值為半數(shù)組織培養(yǎng)感染量，能縮短診斷時間，提高細胞檢測的有效性。聚合酶鏈反應(yīng)屬于基因?qū)用娴臋z測，一般采用特異性引物，提高DNA序列的轉(zhuǎn)錄效率，保障病毒診斷能夠順利進行。

2.5 病毒分離鑒定技術(shù)病毒分離鑒定技術(shù)是指在血清中分離病毒，并對其進行鑒定，進而診斷疾病的技術(shù)，此種技術(shù)應(yīng)用較為成熟，屬于病原鑒定的重要技術(shù)手段之一。在技術(shù)應(yīng)用的過程中，需要對接種細胞進行培養(yǎng)，同時對細胞的病變情況。在實驗過程中，要采集病牛病料并分離病毒，接種到健康細胞中，經(jīng)過細胞傳代，分析病毒感染情況。為了確保病毒的分離效果，需要將病原接種到MDBK細胞中，經(jīng)過培養(yǎng)和傳代可發(fā)現(xiàn)細胞病變，經(jīng)過檢定后發(fā)現(xiàn)細胞呈現(xiàn)陽性，進而證明病毒為牛病毒性腹瀉病毒。病毒分離鑒定診斷是一種間接診斷方式，在外部對接種細胞進行培養(yǎng)，需要消耗一定數(shù)量的時間?；疾≡缙诓∨]有臨床表現(xiàn)，需要采用病原進行外部培養(yǎng)，以提高對病毒的診斷效率。病毒分離鑒定可通過細胞培養(yǎng)提高病原的數(shù)量，以提高整頓的精準性。

2.6 血清抗體檢測技術(shù)血清抗體檢測技術(shù)，是指采集液制備血清，對血清中的病毒抗體進行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果診斷疾病的技術(shù)。診斷過程中，應(yīng)當首先要進行人工感染，將病原注入到動物體內(nèi)，使其對體內(nèi)細胞進行感染，使病原能夠得到外部檢驗。通常，選擇小健康小白鼠進行試驗，將病料對小白鼠進行接種。（1）可將5mL病原上清液靜脈注射到小白鼠體后正常飼養(yǎng)。（2）將2mL病原上清液由鼻腔滴入。接種后需要對小白鼠的臨床表現(xiàn)進行觀察，確定病原對小白鼠健康狀況的影響。同時，還要對小白鼠進行病毒分離及血清抗體檢測，對病原進行進一步的診斷，確定病原是否在其體內(nèi)存活，若存活則牛病毒性腹瀉病毒進行診斷，確定是否由該病原引起小白鼠患病。

2.7 電鏡技術(shù)電鏡技術(shù)又稱電子顯微鏡技術(shù)，屬于細胞生物學(xué)研究手段之一，可對細胞亞顯微結(jié)構(gòu)和病毒進行觀察，從而達到診斷疾病的目的。檢測前需要對病原進行培養(yǎng)，使病毒能夠達到一定的數(shù)量，確保電鏡下能夠?qū)Σ《具M行識別。電鏡檢驗需要對病料進行處理，將病料制成超薄切片形式，采用電鏡確定病毒粒子的形態(tài)，對病毒的體征進行判斷。但病毒粒子的數(shù)量需要控制在10-6/mL以上，才能符合電鏡觀察的要求。同時，可對病原進行細胞培養(yǎng)，將病料接種到MDBK細胞中，將其繁衍10代左右。采用電鏡技術(shù)觀察細胞培養(yǎng)物，對牛病毒性腹瀉病毒進行檢驗?？梢姷讲《倦x子呈現(xiàn)圓形、有囊膜、有突起等特征，直徑在40～60nm。

2.8 特異性抗體檢測技術(shù)特異性抗體技術(shù)主要指中和實驗，通過對細胞的定性檢驗，實現(xiàn)對疾病的診斷?？蓪⑴２《拘愿篂a病毒接種在睪丸細胞或犢牛腎細胞中，并進行細胞形態(tài)觀察。經(jīng)過2～3周后，采用被檢血清與接種細胞稀釋液進行混合，若檢測結(jié)果為陽性，則說明有牛病毒性腹瀉病毒存在。中和實驗診斷方式具有較高的檢出率，便于進行定性、定量檢驗，屬于常用的實驗室檢測方式。中和實驗診斷是病毒或毒素與相應(yīng)抗體結(jié)合后，失去對易感動物的致病力和試驗方法，該法敏感性強特異性高使用范圍廣?？啥ㄐ詸z測，也可定量檢測。

2.9 瓊脂擴散技術(shù)瓊脂擴散技術(shù)原理簡單，但僅能夠?qū)崿F(xiàn)粗略檢驗，檢出率難以達到精準的水平，此項技術(shù)的優(yōu)勢在于能夠?qū)ζ渌\斷結(jié)果進行佐證，常用于對其它診斷方式進行驗證。在使用該診斷技術(shù)時，需要以病變組織作為實驗部位，將其與陽性血清混合進行瓊脂擴散。在實驗過程中，血清滴度應(yīng)控制為1:2，將血清分為若干份進行實驗，這樣可以提高檢測結(jié)果的精度，促進瓊脂擴散實驗檢出率的提升。瓊脂擴散診斷成本較低，檢驗過程較為快速，是牛病毒性腹瀉病毒診斷的重要方式。瓊脂擴散實驗的檢出率在70%～80%，檢出率受到病原數(shù)量的影響，一旦檢測出病原且結(jié)果為陽性，則說明病變部位存在牛病毒性腹瀉病毒，需要做好該病的應(yīng)對工作。

2.10 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)是科研機構(gòu)實驗室中的重要診斷方式，檢測前，需要對病毒粒子進行培養(yǎng)，采用熒光法對其進行標記，使病毒粒子能夠以熒光的形式呈顯，便于對病毒進行鑒定。在試驗過程中，需要以病牛血清作為實驗材料，采用熒光法對抗體進行標記，使得診斷技術(shù)具有較高的特異性，可以增強對病毒的識別效率，使檢出率能夠達到98%以上。免疫熒光技術(shù)敏感性較高，對病毒的檢測速率較快，在需要快速得出診斷結(jié)果的情況下，采用該診斷技術(shù)較為適宜。然而，該診斷技術(shù)的缺點是無法對非特異性病原進行檢測。

2.11 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)要求對抗原以及抗體進行固化，在此基礎(chǔ)上，加入其它物質(zhì)，形成抗原抗體復(fù)合物，通過檢測，可產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過定量分析診斷疾病。在技術(shù)應(yīng)用的過程中，需要嚴格做好病毒分離操作，提高病毒診斷的效率。在病毒分離檢測過程中，采用多樣本檢測的方式，取400份牛血清樣品進行實驗，對血清采用檢驗手段。其中，182份血清呈現(xiàn)陽性，218份血清呈現(xiàn)陰性。酶聯(lián)免疫吸附試驗是重要的診斷形式，可以對血清樣品進行檢驗，并且不需要較高純度的抗原，可以縮短病原的培養(yǎng)時間，提高對病原的檢測效率。利用酶聯(lián)免疫吸附試驗原理，能夠?qū)崿F(xiàn)試紙的檢測形式，使病原診斷的操作更加方便。酶聯(lián)免疫吸附試驗對抗體檢測具有較高的靈敏度，在室溫下便可以進行實驗，便于將診斷技術(shù)進行推廣。該法具有快速、敏感性高、操作簡便、易于標準化等優(yōu)點，適合推廣使用。

2.12 分子生物學(xué)診斷技術(shù)分子生物學(xué)診斷技術(shù)要求以DNA以及RNA作為診斷用材料，通過相應(yīng)的檢測技術(shù)觀察待檢測樣本中是否存在基因異常表達的情況，從而達到診斷疾病的密度。在分子生物學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)用的過程中，需要應(yīng)用到反轉(zhuǎn)錄PCR，通過DNA的不同對病毒進行區(qū)分，以作為牛病毒性腹瀉病毒的診斷依據(jù)。分子生物學(xué)診斷需要注重機體的選擇，使機體具有良好耐受特征，確保病毒能夠快速地完成轉(zhuǎn)錄工作，確保病毒對細胞的感染能力。在分子生物學(xué)方面，具有完善的核酸檢測手段，可以通過探針來對牛病毒性腹瀉病毒的核酸進行檢驗，對特定的基因序列進行識別，對病毒實施精準化對檢驗。為了提高病毒檢測的精度，可以采用RT-PTR技術(shù)進行診斷，并且與熒光定量技術(shù)相結(jié)合，對檢測到的基因序列進行標記，進而實現(xiàn)感染細胞的熒光檢驗。另外，需要對抗原捕獲ELISA技術(shù)進行應(yīng)用，提高病毒檢測的靈敏度，可以將靈敏度提升10倍以上，根據(jù)病毒的特異性進行診斷，豐富對牛病毒性腹瀉的臨床診斷經(jīng)驗。

3 結(jié)論

牛病毒性腹瀉—粘膜病是常見的牛病，需要注重實驗室診斷技術(shù)的應(yīng)用，通過病原診斷、血清學(xué)診斷、分子生物等方面的應(yīng)用，使腹瀉病原得到全面地檢測，確保診斷過程更加科學(xué)合理，提高了對病毒識別的有效性。實驗室診斷是診斷牛病的重要技術(shù)，需要嚴格按照實驗過程進行分析，提高對腹瀉病毒的診斷能力，保障牛病毒性腹瀉的診斷技術(shù)更加充分。