腦出血實驗動物模型動物選擇與制備方法的研究現(xiàn)狀*

蘇 男，石素琴，高天一，馮乘銘，蔡志平，徐 晗，方 剛，李 梁

(1.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014040；2.內蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院神經科；3.內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血，占據(jù)全部腦卒中疾病的20 %～30 %，腦出血急性期死亡率高達30 %～40 %。腦出血發(fā)病年齡趨于年輕化，嚴重危害了人們的身心健康[1]。腦出血發(fā)病的原因有很多，主要和腦血管的病變有關，同時和高血脂、糖尿病、高血壓、血管的老化、吸煙等因素密切相關，是腦血管類疾病中發(fā)病急、致死、致殘率高的一類腦血管疾病。腦出血的患者往往由于情緒激動、劇烈體力活動時突然發(fā)病，早期死亡率高，幸存者中多數(shù)留有不同程度的運動障礙、認知障礙、語言吞咽障礙等后遺癥，嚴重影響患者的生活質量[2]。但目前臨床上并沒有很好的診療方法醫(yī)治此病[3-4]。臨床上針對腦出血雖然有很多的治療方案，大多以外科手術和內科保守治療為主，無論采用何種治療方法，大多數(shù)病人經治療后最終會遺留有不同程度的神經功能障礙[5]。為了找到更好地治療腦出血的方法，研究者采用了不同的動物模型進行腦出血實驗，但每種模型都有自身的優(yōu)缺點，沒有單一的模型可以完全符合人類腦出血所帶來的組織生理上和病理上的變化過程，根據(jù)相關文獻的記載[6-10]，目前常用的腦出血的動物模型主要包括自體血注入腦出血模型、膠原酶注射腦出血模型、微球囊充盈腦出血模型、自發(fā)性(高血壓性)腦出血模型等4大類腦出血動物模型[11]。本文將重點從以上4個方法入手闡述腦出血動物模型的發(fā)展過程，概述其發(fā)展及運用情況。

1 腦出血模型的動物選擇

實驗室動物模型的種類有很多種，常用的有嚙齒類、魚類、靈長類等，研究人員根據(jù)所要研究的不同方面選擇適合的受試動物。在腦出血動物模型的選擇上，有文獻記載研究者做了不同種類動物模型的制作，包括靈長類腦出血動物模型、犬類腦出血動物模型、豬腦出血動物模型、兔腦出血動物模型、嚙齒類大、小鼠腦出血模型等[12]。

1.1靈長類動物模型 在早期研究者曾選擇靈長類動物制作腦出血動物模型[5]，其優(yōu)點是靈長類動物更近似于人類的生理和身體構造，黑猩猩等靈長類動物有90 %的DNA和人類相同，可以更好地模擬腦出血時人體的各種生理病理改變[12]。有學者分別選擇長尾黑顎猴和食蟹猴作為受試動物，將右側股動脈的自體血注入到猴子的大腦內，在實驗后12 h內，受試動物都表現(xiàn)出了感覺系統(tǒng)的損害現(xiàn)象，同時出現(xiàn)神經功能受損癥狀，實驗數(shù)據(jù)適用于觀察臨床腦出血病人神經受損后的恢復狀況[13-14]。靈長類動物作為受試動物制作腦出血動物模型，雖然可以獲得更加符合臨床的實驗數(shù)據(jù)，但由于實驗動物價格昂貴，獲取困難，且在倫理上存在一定的爭議，所以無法大規(guī)模地應用于臨床試驗中，樣本量有限也限制了此類動物應用于大樣本的臨床試驗，所以尋找一類成本小，可大樣本量應用的動物模型顯得尤其重要。

1.2犬類動物模型 犬類腦出血動物模型的應用研究最早開始于1963年Whisnant等[15]采用自體血注入腦基底核和深層白質中，使之產生不同體積的血腫。經過研究的不斷改進，Steiner等[16]第一次對犬類受試動物進行了自體血注入并成功開展了研究。An等[17]采用膠原酶注射法在動物體內形成腦出血，可以觀察MRI上腦出血隨時間變化的圖像改變，但由于注射劑量太大，所以沒有大規(guī)模投入使用。但在犬類動物腦出血模型的制備中，引用的超聲波引導下穿刺出血是不同于其他種類動物模型的一種新的造模方法，Zhou等[18]利用超聲波定位腦血管位置的方法，在超聲圖像上尋找動脈的最優(yōu)穿刺點，用活檢穿刺針穿刺該部位，并留針5 min制造腦出血模型，可以形成體積大小幾乎一致的血腫塊。犬類腦出血動物模型的構建由于受試動物體積較大，腦出血部位比較清晰，可以更明確地在MRI上觀察到血腫塊及出血部位組織結構的變化過程。同時應用犬類制作的腦出血動物模型，可以觀察到在貧血性缺氧的情況下，大腦的血流動力學、血液中的氧供應與糖酵解穩(wěn)態(tài)之間的相互作用關系,對于腦出血后患者的腦缺氧的癥狀研究有很大的幫助,同時犬類動物模型較靈長類動物模型在受試動物的成本上更適宜，且有較好的實驗效果，故在部分的實驗中還會選用犬類動物做腦出血的動物模型[19]。但犬類動物也存在飼養(yǎng)價格較高，研究周期較長的不利情況，同時實驗動物給藥、記錄數(shù)據(jù)存在一定困難，所以大規(guī)模進行實驗研究也不利于實驗開展。

1.3豬腦出血動物模型 豬腦出血動物模型主要采用自體血注入法和微囊注入法制作腦出血動物模型，可以獲得穩(wěn)定且體積大小相差很少的血腫塊，但由于豬的體積較大，且獲得的實驗數(shù)據(jù)可以通過犬類等其他動物模型獲取，性價比低，故臨床實驗研究一般少用此類實驗動物[20-22]。

1.4兔腦出血動物模型 兔腦出血動物模型的使用在臨床試驗中很常見，因與人類有著相似的腦血管形態(tài)特征，且成本低，體積小，故也經常被用于腦出血模型制作的選擇動物。Kaufman等[23]首次采用了兔作為腦出血模型的受試動物，應用自體血單步注入的方法，進行腦出血的動物建模。也有研究記載采用兩步注入法構建兔腦出血動物模型，可以有效地避免血腫破入側腦室和蛛網膜下腔造成蛛網膜下腔出血的情況發(fā)生，同時可以生成穩(wěn)定均勻的血腫塊，對神經功能的損傷較輕且后續(xù)恢復較好[24]。

1.5嚙齒類腦出血動物模型 嚙齒類動物模型的選擇一般選用大鼠用來制作腦出血動物模型，因為大鼠比小鼠擁有更大的腦組織，更便于觀察實驗誘發(fā)腦出血后腦組織的組織形態(tài)變化和血管內血流信號的變化，且大鼠體積較小，繁衍易得，周期短，成本較低，適合于大樣本量的實驗室腦出血動物模型的制作，同時大鼠的神經系統(tǒng)發(fā)育與人類相似，基因組成與人類高度同源，所以近年成為腦出血模型的主要選擇動物。因此本文將采用大鼠實驗動物模型概述腦出血動物模型的制作方法，為以后的研究提供參考。

2 實驗動物腦出血模型的制備方法

大鼠腦出血動物模型經過科研人員多年的探索，形成了多種不同途徑的制作方法，而目前比較常用的大鼠腦出血模型主要包括自體血注入腦出血模型、膠原酶注射腦出血模型、微球囊充盈腦出血模型、自發(fā)性(高血壓性)腦出血模型等4種腦出血動物模型。

2.1自體血注入腦出血模型 自體血注入法制備腦出血模型是目前應用最廣泛的一種腦出血模型制備方法，主要是運用注射動物自身(非肝素化)自體血的方式，形成局部腦出血模型。模型制作方法通常是麻醉固定好動物以后，通過定位技術將自體血注入動物腦內基底核使之造成腦部出血水腫模型。

血液注入法歷史沿革可大致分為單步注入法、兩步注入法和三次注入法。單步注入法最早由Ropper等[25]提出，但此時所用血為異體血，受試動物采用無麻醉的方法，直接將血液注入受試動物基底核區(qū)。此法比較符合臨床患者清醒時發(fā)病狀態(tài)，但異體血注射弊端較多，會產生排異等不良反應。經過諸多研究者的實驗研究，逐漸將異體血變?yōu)閷嶒瀯游镒泽w血，同時通過改變血流壓力、使用不同大小的注射器、改變注射量及注射時間等方法，將單步注射法的實用性進一步加強，但由于實驗需控制的變量較多，實驗重復率及成功率較低。在此基礎上Deinsberger等[26]進一步研究進行兩步注射法。先注射20 μL的自體血，后靜止針頭7 min，使血凝塊形成將針道封住，再注射30 μL的自體血。該方法減少了破裂出血血腫延伸至硬膜下間隙的失敗次數(shù)，但仍有血液反流問題的產生。后有學者研究進行了三步注入法，適用于出血量更大的動物模型的制作，多次的注入可以比兩步注入法能更好地控制血液反流現(xiàn)象的發(fā)生，更好地保證實驗動物受試部位所需要的壓力和血流量[27]。自體血注入法的優(yōu)點在于可以很好地觀察自體血注入腦組織后，在腦組織釋放的血管活性物質對腦組織的刺激病理作用，符合臨床患者腦出血疾病發(fā)生的病理生理過程，在臨床上具有較強的可借鑒性。但此方法也有一定的局限性，由于是外在注射器注入體內血液造成的腦出血，血液返流現(xiàn)象還是會對血腫的形成及大小有一定的影響，而目前通過使用電子微量注射等注射流量控制輔助儀器有效改善了這種情況。

2.2膠原酶注射腦出血模型 膠原酶注入法是指在腦內局部注射膠原酶，膠原酶可以溶解血管內皮下基膜層和細胞間基質的膠原，造成血管壁破壞，從而造成腦出血的發(fā)生。膠原酶是從溶解組織的梭狀芽胞桿菌中提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分[28]。膠原酶動物模型基本操作過程是向腦組織中注射膠原酶，10 min后腦組織周圍開始出現(xiàn)出血點，并向周圍滲血，5～24 h開始出血并形成完整的血腫塊。膠原酶的種類有很多種，目前在腦出血動物模型制備中最常用的是Ⅶ型膠原酶模型,其次應用廣泛的是Ⅵ型膠原酶蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，注射0.5 U的Ⅶ型膠原酶的生理鹽水2 μL，注入大鼠尾狀核內，10 min后即有血液滲出，這個劑量方法制備出的動物模型受試動物死亡率最低，所以得到了廣泛的推廣應用[7,29]。膠原酶注入法的優(yōu)點是通過膠原酶局部注入，形成血塊大小和形狀可以得到較好控制，并且補足了采用自體血注入時不能模擬人體自身血管破裂造成腦出血的問題，可以較好地模擬臨床患者腦出血腦內血腫擴大的發(fā)病過程，模型制作簡單快捷，可重復性好。該方法克服了由于血液返流造成的血腫體積減小，固定靶點組織的血腫形成較好，可以觀察血腫形成過程中的模型機體反應情況。該制備模型也存在一定的不足之處，由于膠原酶注入后是彌散性出血引起的血腫，所以形成的血腫存在的時間比較短，且由于彌漫的時間較慢，不太符合臨床上腦出血急性出血期的發(fā)病機制，且由于膠原酶自身帶炎癥反應和有細胞毒性作用，不同于自身患者腦出血形成的血腫，會對血腦屏障產生較強的破壞，且恢復時間較長，所以不適用于腦出血的發(fā)病機制的研究，而更加適用于對腦出血后治療恢復期的各項指標的研究[11,28,30-31]。

目前針對腦出血的研究中，應用比較廣泛的是自體血注入法和膠原酶注入法，應用這兩種方法可以從多個角度觀察腦出血模型，而觀察腦出血中血腫塊的形態(tài)學改變可以更直觀地描述腦出血的危害程度[32-34]。自體血注入法和膠原酶注入法比較，自體血注入法制備的腦出血動物模型可以模擬血腫形成的占位效應、血液在血管外對腦組織的損害等，可以看到血腫周圍有明顯的細胞浸潤；而膠原酶注入后所形成的腦血腫較自體血注入法形成的腦出血血腫更加清晰明顯，出血后再次形成血腫過程以及血腫后出現(xiàn)水腫和炎癥反應,同時會伴隨明顯的神經功能障礙表現(xiàn)。在急性腦出血時，采用Ⅵ型膠原酶制備腦出血動物模型，可以清楚地觀察到大鼠出現(xiàn)了氧化應激反應及神經樣改變[35],機體生成大量的氧自由基和丙二醛(Lipid Peroxidation,MDA)，進而對腦組織產生毒性作用[36]，加重神經功能的損傷。采用膠原酶的方法進行腦出血模型制備，膠原酶本身就可以產生細胞毒性作用，運用此方法制備的實驗大鼠，在實驗后期對大鼠進行藥物治療，能夠很清晰地觀察到受試動物神經功能的改變，這也是需要科研工作者值得注意的事項。同時，由于腦出血后患者第一天就有可能出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，紅細胞的溶解會導致腦水腫、神經元壞死和神經功能缺陷,隨著時間的推移，神經功能障礙會越來越嚴重[37-38]。膠原酶注射法可以針對腦出血后神經功能的不同程度的損傷提供研究適用的方法，在臨床上可以針對性地進行治療，以提高患者的生存率。

2.3微球囊充盈法 微球囊充盈法是采用向腦組織內插入微球囊，微球囊擴充使得腦組織受壓迫出血，該方法是模擬顱內壓升高的狀況的一種方法。該方法的優(yōu)點在于機械壓迫出血可人為操縱壓迫位置的范圍，精準控制血腫大小，具有可重復強，使用方便的優(yōu)點，故可以利用控制微球囊擴張的時間來研究血腫的各種形態(tài)大小，可用于外科手術對于血腫的清除的研究[39]，但由于是機械壓迫出血，并沒有血管刺激性因子的加入，并不能直觀反應細胞毒性作用，不能用來評估血液本身存在的成分，血管和周圍組織的理化環(huán)境變化，對于腦出血后各種細胞組織的損害狀況不好觀察，不適用于腦出血發(fā)病機制的研究。對于出血后各項指標的研究也不如自體血注入法，故現(xiàn)在臨床試驗一般很少采用微球囊充盈法。

2.4自發(fā)性腦出血模型(高血壓型) 高血壓性腦出血是一種嚴重危害人類健康的疾病，是高血壓最嚴重的并發(fā)癥之一，在不同原因腦出血中其致殘率、致死率很高。該病的發(fā)病機制最為復雜，目前研究中主要有以下幾種發(fā)病機制：(1)血壓增高為腦血管破壞的病理生理基礎；(2)星形膠質細胞的破壞；(3)腦內血腫的擴大；(4)高血壓腦出血繼發(fā)性損害，所產生的凝血酶被認為是引發(fā)腦水腫的重要因素之一[40]。高血壓腦出血模型現(xiàn)在一般主要有兩種，一種是腎源性高血壓大鼠，另一種是自發(fā)性高血壓大鼠[11,41-42]。自發(fā)性高血壓大鼠通過基因敲除獲得，目前已有實驗室通過基因培育的方法培育出易出血的高血壓基因鼠，可以在出生數(shù)日起血壓自發(fā)升高，并在短時間就可以發(fā)生自發(fā)性腦出血。該模型的出血部位主要在大腦前內側皮質、枕皮質和基底節(jié)部位，和人類腦出血的部位相似，可以制作出比較理想的腦出血大鼠模型。但這類大鼠模型一般需要的成本較高，且大鼠死亡率也比較高，只能應用于高血壓性腦出血實驗模型，故目前實驗室經常使用腎源性高血壓大鼠。腎源性高血壓模型優(yōu)點是制作簡單，采用結扎雙側腎動脈，使雙側腎動脈縮窄進而誘導高血壓動脈硬化，誘發(fā)腦出血的產生。運用此方法誘導的高血壓，高壓峰值穩(wěn)定，且能并發(fā)與人類高血壓病類似的腦動脈損害及各種類型的腦出血[43]。該方法成本較低，但也存在一定的缺陷，受試大鼠的個體差異性的影響使得腦出血的發(fā)生率不確定，每次實驗存在較大的客觀差異，重復性不太好。除此外也有用藥物誘導高血壓腦出血模型的方法，對受試小鼠定量注入血管緊張素Ⅱ和一氧化氮合酶抑制劑使小鼠產生慢性高血壓，再通過后續(xù)注射血管緊張素Ⅱ可以誘發(fā)高血壓性腦出血[44]。藥物誘導的方法應用簡單方便，但不能形成一致的出血部位，存在個體差異性較大，可復制性差的缺點。高鹽誘導法也可誘發(fā)高血壓的產生，有研究認為氯化鈉對腦血管的破壞作用直接導致了腦出血的產生[45]。傳統(tǒng)觀點認為高鹽高鈉攝入會使得血管的滲透性增強，血管管壁韌性減少，脆性增加，當血流量增加時很容易造成血管破裂引起腦出血發(fā)生。高鹽誘發(fā)的腦出血，受試動物的出血體積較小，且散在存在于腦部，對腦組織有輕微的破壞，比較符合人類少量多發(fā)腦出血的發(fā)病機制，但由于出血量不可控，實驗可重復性差，出血部位變化不定，故不太適用于一般大規(guī)模的腦出血模型的制備。

3 其他腦出血動物模型及影響因素

除了上述比較常用的腦出血動物模型外，根據(jù)腦出血的不同部位還有針對性的腦出血模型制備方法。如在研究大腦皮層出血時，撕裂相應腦血管制作腦出血動物模型，采用細針撕裂靜脈導管引起大腦皮層出血。該方法簡單實用，針對性強。除了方法選擇不同，實驗過程中的客觀因素對于最終的實驗結果也有很大影響，其中影響較大的因素之一是動物的年齡[46]。腦出血的發(fā)生往往是伴隨著年齡的不斷增長，發(fā)病率不斷增加，而受試動物一般處于動物年輕的時期，單純運用上述方法誘發(fā)腦出血的發(fā)生，與人類隨著年齡的增長機體機能逐漸退化不相符合，尤其是腦功能退化，而腦出血后對患者進行神經功能的評估是治療腦出血患者的一個重要指標，故實驗過程這些因素在一定程度上影響著實驗結果與臨床應用的差別，在以后的實驗中應考慮這些因素的存在。

腦出血的模型制備方法經過歷年研究發(fā)展，各種模型都具有在臨床或基礎理論實驗方面的可用性，但又各有不足，目前應用最廣泛的是自體血注入法和膠原酶注入法這兩種方法，微球囊充盈法和自發(fā)性腦出血方法雖有制備簡單的特點，但微球囊充盈法存在較多的局限性，而自發(fā)性腦出血方法需控量較多，且成功率較低，所以綜合以上4種方法，目前最常使用的建模方法是自體血注入和膠原酶注入法。任何的實驗方法都存在一定的不足之處，要獲得更加完備的實驗建模方法，需要一個長時間研究的過程，在考慮好受試動物倫理的情況下，找出更加符合臨床患者腦出血生理病理改變的動物模型實驗方法。