基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的蒺藜皂苷D抗肺纖維化的作用機制研究*

楊雪苗，薄彧坤，楊 丹，張淑寧，郭博宇，安 明1,

(1.蒙藥藥效物質(zhì)與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院2020級研究生)

肺纖維化是一種呈進(jìn)行性、不可逆轉(zhuǎn)性發(fā)展的肺間質(zhì)性呼吸系統(tǒng)疾病，也是肺部疾病中高發(fā)病率和病死率的主要原因，具有多致病因素且病因未明的特點，是各種慢性肺部疾病的終末期病理特征。肺纖維化是因藥物毒性、自身免疫性、感染性等因素[1]導(dǎo)致的肺組織結(jié)構(gòu)破壞，后經(jīng)人體自我異常修復(fù)產(chǎn)生瘢痕組織的結(jié)果[2]。肺纖維化的發(fā)生與炎性介質(zhì)致肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞的募集、活化以及大量細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集有關(guān)[3]。目前尚未發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)肺纖維化的藥物，只能通過改善其臨床癥狀緩解纖維化進(jìn)程，因此，探索可以抑制肺纖維化發(fā)展的有效藥物迫在眉睫。

近年來，隨著對肺纖維化研究的不斷深入，利用中蒙藥對肺纖維化進(jìn)行治療的研究逐漸增多。蒺藜(Tribulus terrestris L.)是蒺藜科的干燥成熟果實，已被用作中草藥預(yù)防疾病數(shù)千年，常用于補腎、止咳、祛痰、明目和眩暈，可以治療尿路感染、不孕癥、陽痿等[4]。蒺藜皂苷D是蒺藜中提取分離出的一種甾體皂苷，具有廣泛的藥理作用，其可通過抑制神經(jīng)傳遞介質(zhì)與樹突狀細(xì)胞的相互作用，降低樹突狀細(xì)胞的成熟，下調(diào)炎癥因子的表達(dá)水平[5]，還能通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞周期阻滯和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗腫瘤和抗血管生成活性的藥理作用[6]，因此，蒺藜皂苷D具有明顯的抗炎和抗癌活性，但蒺藜皂苷D對肺纖維化保護(hù)作用的研究甚少。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個相對較新的學(xué)科，它通過數(shù)據(jù)庫及生物信息來闡明藥物的分子相互作用，并且是研究復(fù)雜草藥制劑作用機制的有力工具，已成功應(yīng)用于研究中藥制劑的作用機制，并通過了體外和體內(nèi)驗證。分子對接是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進(jìn)行藥物設(shè)計的方法，主要研究分子間(如配體和受體)相互作用，并預(yù)測其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的研究方法，從分子水平上探討蒺藜皂苷D治療肺纖維化的作用機制，為蒺藜皂苷D治療肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫、軟件與方法

1.1數(shù)據(jù)庫 本研究部分的實驗數(shù)據(jù)是通過網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫獲得，數(shù)據(jù)庫具體名稱的網(wǎng)址見表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)在線數(shù)據(jù)庫名稱及網(wǎng)址

1.2軟件 操作系統(tǒng)：Windows 10 (64位)操作系統(tǒng)。Cytoscape 3.7.2：一個將蛋白-蛋白互作(PPI)

網(wǎng)絡(luò)、ClueGO分析和蒺藜皂苷D-潛在靶點-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)可視化的軟件，并將這些網(wǎng)絡(luò)、注釋與其他狀態(tài)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和可視化。Autodock：一個用于模擬小分子配體(活性成分)與大分子受體(潛在靶點)通過幾何匹配和能量匹配產(chǎn)生相互作用的軟件。Autodock具有對接速度快和對接質(zhì)量高的優(yōu)點，是分子對接領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛的軟件之一。PyMOL-2.5.2：是用于分子對接研究中對受體和配體進(jìn)行預(yù)處理和將分子對接結(jié)果可視化的軟件。

1.3方法

1.3.1靶點的收集 利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫收集已知的成分靶點。具體操作過程為：使用PubChem數(shù)據(jù)庫查詢蒺藜皂苷D的Canonical SMILES序列，然后導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫，Species選擇Homo sapiens，結(jié)果篩選Probability>0的靶點作為蒺藜皂苷D的治療靶點。為獲得更多的藥物靶點，通過PubMed數(shù)據(jù)庫以“Terrestrosin D”為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)檢索以收集蒺藜皂苷D更多的潛在作用靶點。

以“pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞，在DrugBank數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索肺纖維化的相關(guān)疾病靶點，將3個數(shù)據(jù)庫靶點合并，同時刪除重復(fù)項，最終獲得肺纖維化疾病靶點。

1.3.2韋恩(Venn)圖的構(gòu)建 獲得蒺藜皂苷D作用靶點與肺纖維化作用靶點的交集靶點，并繪制Venn圖，以篩選蒺藜皂苷D-肺纖維化共同靶點。

1.3.3PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。通過UniProt數(shù)據(jù)庫將交集靶點名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(gene symbol)，然后輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中，Organism選擇“Homo sapiens”，采用Cytoscape 3.7.2軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)圖可視化并使用“Network Analyzer”工具進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3.4靶點功能注釋分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件中“ClueGO”工具對得到的交集靶點進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)分析并對其功能進(jìn)行注釋，選擇“Organism”為“homo sapiens”，設(shè)置閾值P<0.05。其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個過程。

1.3.5靶點通路注釋分析 為明確潛在靶點的作用途徑，通過生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(DAVID)進(jìn)行基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析，選擇“homo sapiens”。為獲得重要作用的信號通路，選取作用中重要性排名前15的信號通路通過微生信在線作圖工具可視化KEGG網(wǎng)絡(luò)。

1.3.6蒺藜皂苷D-靶點-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將蒺藜皂苷D-肺纖維化的交集靶點及信號通路導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建蒺藜皂苷D-靶點-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并對其進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3.7分子對接 整合“1.3.3”中排名前8的核心靶點進(jìn)行分子對接。采用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接以模擬蒺藜皂苷D與肺纖維化相關(guān)信號通路中關(guān)鍵靶點的相互作用。配體小分子(蒺藜皂苷D)的三維結(jié)構(gòu)(3D-SDF)由PubChem(PubChem CID:101995328)獲得，通過PyMOL軟件轉(zhuǎn)化為PDB格式。受體(靶點蛋白)的三維結(jié)構(gòu)文件由PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫獲得，為避免下載的蛋白晶體結(jié)構(gòu)攜帶其他小分子配體和溶劑，導(dǎo)入PyMOL軟件后將其去除并轉(zhuǎn)化為PDB格式。分別將配體和受體PDB格式導(dǎo)入AutoDock軟件，通過加入氫原子和去除水分子來優(yōu)化結(jié)構(gòu)，并保存為PDBQT格式文件。最后，運行AutoDock軟件中“AutoDock Vina”程序?qū)ε潴w和受體進(jìn)行分子對接。

根據(jù)配體小分子(蒺藜皂苷D)與受體(靶點蛋白)的結(jié)合自由能大小來評估二者的自發(fā)結(jié)合能力，最小結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol被認(rèn)為二者可以自發(fā)進(jìn)行結(jié)合。將符合條件的分子對接結(jié)果導(dǎo)出并進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1潛在靶點的篩選 通過查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫收集共獲得43個與蒺藜皂苷D相關(guān)的作用靶點。刪除重復(fù)項后，DrugBank、OMIM和GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲得1 492個與肺纖維化相關(guān)的疾病靶點。

2.2Venn圖的構(gòu)建 將“2.1”獲得的蒺藜皂苷D和肺纖維化相關(guān)靶點進(jìn)行整合，獲得二者共同作用的靶點17個，作為蒺藜皂苷D治療肺纖維化的潛在靶點。通過在線網(wǎng)絡(luò)繪制Venn圖，見圖1。17個潛在靶點包括HTR2B、HTR2A、CYP2D6、HTR1B、HSP90AA1、PSEN2、STAT3、VEGFA、FGF1、FGF2、VDR、LGALS3、MAPK3、IL6、PPARG、TNF和TGFβ1。

圖1 蒺藜皂苷D-肺纖維化靶點Venn圖

2.3PPI網(wǎng)絡(luò)分析 為鑒定蒺藜皂苷D抗肺纖維化的中心靶點，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化。如圖2所示，網(wǎng)絡(luò)包含15個節(jié)點(靶蛋白)，58條邊(蛋白間的相互作用)，聚類系數(shù)(Clustering coefficient)為0.715，平均節(jié)點度(Avg.number of neighbors)為7.733。根據(jù)度值(Degree)篩選對該網(wǎng)絡(luò)貢獻(xiàn)較大、作用較顯著的靶點，度值排名前8的潛在靶點分別為MAPK3、PPARG、IL6、TNF、VEGFA、TGFβ1、FGF2和STAT3。節(jié)點越大、線條越粗，相應(yīng)的顏色越深，表明其在該網(wǎng)絡(luò)中的貢獻(xiàn)程度越大。上述結(jié)果表明，蒺藜皂苷D可能通過多靶點的協(xié)同作用發(fā)揮抗肺纖維化的療效。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4靶點功能注釋分析 為更好地闡明蒺藜皂苷D對肺纖維化的保護(hù)作用，將“2.2”中獲得的交集靶點進(jìn)行GO富集分析。GO分析篩選得到BP條目418條，CC條目22條，MF條目29條。BP包括脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程的正向調(diào)節(jié)和對脂質(zhì)生物合成過程的調(diào)節(jié)等；CC包括免疫突觸、小凹、白細(xì)胞介素-6受體復(fù)合物、血小板等；MF包括RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和生長因子活性等，重要過程展示見圖3。

圖3 GO功能富集結(jié)果圖

2.5靶點通路注釋分析 將“2.2”中獲得的交集靶點通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到69條信號通路，包括與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)和PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等；與免疫系統(tǒng)(immune system)相關(guān)的有Th17細(xì)胞分化(Th17 cell differentiation)；與神經(jīng)系統(tǒng)(nervous system)相關(guān)通路有5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)；本研究僅對影響顯著的前15條通路進(jìn)行展示，具體見圖4，詳細(xì)參數(shù)見表2。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果圖

表2 KEGG通路富集信息

2.6蒺藜皂苷D-靶點-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)分析 為進(jìn)一步說明蒺藜皂苷D與肺纖維化間的相關(guān)性，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建了蒺藜皂苷D-靶點-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。該網(wǎng)絡(luò)由83個節(jié)點和293條邊組成，其網(wǎng)絡(luò)集中化(network centralization)和網(wǎng)絡(luò)質(zhì)性(network heterogeneity)參數(shù)分別是0.587和1.273。圖中綠色節(jié)點表示肺纖維化，藍(lán)色節(jié)點表示蒺藜皂苷D，黃色節(jié)點表示疾病與活性成分的交集靶點，紅色節(jié)點表示交集靶點可能作用的信號通路，每條邊表示活性成分與交集靶點之間的相互作用。

圖5 蒺藜皂苷D-靶點-肺纖維化-通路網(wǎng)絡(luò)圖

節(jié)點的貢獻(xiàn)和重要性通過Degree值和中介度值(Betweenness centrality)來評價。靶點MAPK3(Degree:11;Betweenness:1)、PPARG(Degree:11;Betweenness:1)、IL6(Degree:11;Betweenness:1)、TNF(Degree:11;Betweenness:1)、VEGFA(Degree:11;Betweenness:1)、TGFβ1(Degree:10;Betweenness:0.92)、FGF2(Degree:9;Betweenness:0.85)、STAT3(Degree:9;Betweenness:0.85)等具有較高的Degree值和中介度值，上述靶點主要參與了與肺纖維化相關(guān)的MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路等。以上結(jié)果表明，蒺藜皂苷D通過多靶點、多途徑發(fā)揮抗肺纖維化的作用。

2.7分子對接 本研究中，F(xiàn)GF2、MAPK3、TGFβ1、TNF和IL6等核心靶點富集于MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路，結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出度值排名前8的潛在靶點MAPK3、FGF2、TGFβ1、TNF、STAT3、VEGFA、IL6和PPARG進(jìn)行分子對接研究，并采用PyMol軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化處理。藍(lán)色背景代表各潛在靶點的結(jié)構(gòu)，綠色代表蒺藜皂苷D結(jié)構(gòu)，黃色代表蒺藜皂苷D與靶蛋白間的氫鍵。見圖6，MAPK3與ARG-278、GLN-266、GLU-351、ASP-354、ASP-353殘基形成氫鍵；FGF2與LEU-57、LYS-67、GLN-55、ASN-105殘基形成氫鍵；STAT3與RHE-50、GLU-87殘基形成氫鍵；IL6與AGL-30、LYS-27、ARG-24、GLU-23、THR-20、LEU-19殘基形成氫鍵；PPARG與LYS-373、SER-380、PRO-378、GLU-388殘基形成氫鍵。分子對接結(jié)果表明，蒺藜皂苷D可以靶向作用于MAPK3、FGF2、STAT3、IL6和PPARG等靶點發(fā)揮抗肺纖維化的作用。蒺藜皂苷D與各靶蛋白的對接的結(jié)合能見表3。

圖6 分子對接結(jié)果圖

表3 蒺藜皂苷D與核心靶點對接結(jié)果

3 討論

本文是基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的研究方法探究蒺藜皂苷D抗肺纖維化的作用機制。通過度值大小篩選出MAPK3、PPARG、IL6、TNF、VEGFA、TGFβ1、FGF2和STAT3等靶點為蒺藜皂苷D治療肺纖維化的關(guān)鍵靶點。TNF-α作為一種重要的致炎因子，能活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，促進(jìn)膠原纖維的過度增生和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，加速肺纖維化病理進(jìn)程，同時TNF-α可刺激其他炎癥因子的表達(dá)，增強成纖維細(xì)胞的增殖，膠原的合成[8]。在腫瘤發(fā)展中TNF-α可增強TGF-β的表達(dá)，TGF-β在臟器纖維化過程中扮演著重要角色，TGF-β的激活是間質(zhì)增生的誘因，是肺纖維化炎癥反應(yīng)向纖維化病理過程轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵介質(zhì)，在纖維化中發(fā)揮“總開關(guān)”作用。TGF-β1可以刺激細(xì)胞增殖和活化，分泌大量的膠原纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分促使臟器發(fā)生纖維化[9]。張娜等[10]通過體外實驗用TGF-β1誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞間質(zhì)纖維化，表明TGF-β1是肺纖維化的誘因之一。VEGFA是血管生成劑之一，肺纖維化的發(fā)生伴有血管生成異常的現(xiàn)象和VEGFA蛋白表達(dá)的增加。因此，抑制VEGF的激活可以緩解肺纖維化的發(fā)生進(jìn)程[11]。

在肺纖維化發(fā)展過程中，脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)會被破壞。正常細(xì)胞大多數(shù)依靠從血流中攝取脂肪酸和脂蛋白來滿足其脂質(zhì)需求，而異常細(xì)胞會重新激活脂質(zhì)生物合成，以促進(jìn)細(xì)胞膜的生成，并支持其生長增殖，最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成及代謝異常。GO富集結(jié)果表明，蒺藜皂苷D發(fā)揮治療肺纖維化的藥效機制可能與脂肪細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝過程的正向調(diào)節(jié)和對脂質(zhì)生物合成過程的調(diào)節(jié)等生物過程有關(guān)。

PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路是肺纖維化發(fā)生發(fā)展中重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K-Akt信號通路是調(diào)控細(xì)胞自噬過程的重要途徑，而肺纖維化被認(rèn)為伴有自噬現(xiàn)象，肺組織損傷后會進(jìn)行修復(fù)，局部活化的肺成纖維細(xì)胞會分泌膠原蛋白完成組織修復(fù)，之后基質(zhì)膠原蛋白收縮產(chǎn)生刺激信號誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而避免肺成纖維細(xì)胞過度增殖、膠原蛋白異常沉積，阻止肺纖維化的發(fā)生。現(xiàn)有證據(jù)表明，TGF-β和PI3K-Akt的相互作用促進(jìn)肺纖維化的形成[12]。MAPK信號通路是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，廣泛分布于哺乳動物細(xì)胞中，該通路在炎癥、腫瘤等一系列疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，此外，其在許多主要器官的纖維化過程中發(fā)揮重要作用，如心肌纖維化、腎纖維化和肺纖維化[13-14]。TGF-β、TNF-α等細(xì)胞因子的生成與MAPK信號通路的激活有密切聯(lián)系，MAPK信號通路的激活又會促使各細(xì)胞因子的大量生成，從而加速肺纖維化的發(fā)展[15]。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接的方法顯示，蒺藜皂苷D可能通過MAPK3、FGF2、TGFβ1、TNF、STAT3、VEGFA、IL6、PPARG等靶點作用于EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等，發(fā)揮抗炎、抗肺纖維化的藥理作用；蒺藜皂苷D與受體MAPK3、FGF2、STAT3、IL6和PPARG的結(jié)合活性較高。蒺藜皂苷D治療肺纖維化通過多靶點、多途徑發(fā)揮作用，該研究為蒺藜皂苷D治療肺纖維化的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。