葡萄皮皂苷提取條件優(yōu)化及其穩(wěn)定性分析

劉彥峰，李俊娥，毛亞玲，韓舜愈，李霞

（1.莫高股份葡萄酒廠，甘肅 武威 733008；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 武威 733008）

2020年全球葡萄酒產(chǎn)量為260億L，在釀酒過(guò)程中葡萄皮渣廢料占加工總量的20%左右［1-2］。葡萄皮渣中含有大量的膳食纖維、皂苷類、白藜蘆醇、多酚類、花色苷、蛋白質(zhì)等多種功能性成分，但資源化利用率較低，造成了資源浪費(fèi)的同時(shí)還嚴(yán)重污染了環(huán)境［3-18］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，皂苷類多具有祛痰止咳、抗菌、抗氧化、提高免疫能力、降血糖、抗結(jié)石和抗腫瘤等多方面的生物活性，同時(shí)植物皂苷類可以預(yù)防老年人骨質(zhì)疏松等多種疾病，是目前天然藥物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，具有深度開發(fā)和利用的價(jià)值［19-24］。

隨著萃取技術(shù)體系的逐步發(fā)展和成熟，雙水相萃取法已被廣泛應(yīng)用到天然產(chǎn)物的研究中［25-28］。與傳統(tǒng)的乙醇回流提取法相比，雙水相萃取法具有設(shè)備簡(jiǎn)單，可在常溫下進(jìn)行，能耗低，不會(huì)破壞萃取物性質(zhì)，回收效率高等優(yōu)勢(shì)［29-32］。但目前關(guān)于釀酒葡萄皮渣的皂苷類萃取研究未見報(bào)道。本研究以無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值對(duì)葡萄皮皂苷分配系數(shù)及萃取率的影響為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化萃取條件，以期為利用無(wú)水乙醇和硫酸銨雙水相體系提取葡萄皮渣中的皂苷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

葡萄皮渣：2020年9月采自甘肅莫高實(shí)業(yè)股份有限公司，將采集的葡萄皮渣經(jīng)挑選、曬干、粉碎，得到干凈的葡萄皮粉末，備用。

1.2 儀器與試劑

722型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；XO-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)（南京先歐儀器制造有限公司）；DKB-501超級(jí)恒溫水?。〒P(yáng)州三發(fā)電子有限公司）；FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)（河北黃驊中興儀器有限公司）；DD-5M離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）。

無(wú)水乙醇（≥99.7%）、香草醛（≥99%）、冰乙酸（≥99.5%）、高氯酸（≥72%）、硫酸銨、NaOH、HCl等均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄皮中皂苷含量測(cè)定條件優(yōu)化

1.3.1.1 粗提液的制備［33］稱取葡萄皮粉末5 g，放入250 mL的三角瓶中，葡萄皮粉末與50%的無(wú)水乙醇以1∶5（g/mL）的比例混合搖勻，超聲15 min后2 000 r/min離心5 min，取粗提液待用。

1.3.1.2 雙水相萃取方法［34］準(zhǔn)確量取一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無(wú)水乙醇、硫酸銨及葡萄皮皂苷粗提液，充分振蕩混勻后靜置，使兩相進(jìn)行分離。

1.3.1.3 香草醛冰乙酸-高氯酸比色法測(cè)定皂苷含量［30，35］取分離液0.1 mL，依次加入0.2 mL香草醛冰乙酸混合液、0.8 mL高氯酸在60℃下水浴15 min，再用水冷卻5 min，用冰乙酸定容至10 mL，測(cè)定510 nm下的吸光值（空白對(duì)照將上清液換為等量蒸餾水）。帶入回歸方程y=0.066 1x-0.023，R2=0.997，（x為皂苷質(zhì)量濃度mg/mL，y為吸光值）得到皂苷的質(zhì)量濃度。

1.3.1.4 皂苷萃取率的測(cè)定［30］在雙水相萃取中，常采用相比R、分配系數(shù)K和萃取率Y作表征來(lái)評(píng)判雙水相體系中萃取物的萃取效果。分配系數(shù)K指物質(zhì)在兩相中的分配情況，為上下相質(zhì)量濃度比，萃取率Y指上相中的物質(zhì)含量占雙水相萃取出的總物質(zhì)含量的比例。

在香草醛冰乙酸-高氯酸比色法測(cè)定皂苷含量的基礎(chǔ)上，按（1）式計(jì)算葡萄皮皂苷的萃取率Y：

式中：V1：上相體積（mL）；V2：下相體積（mL）；C1：上相皂苷的質(zhì)量濃度（mg/mL）；C2：下相皂苷的質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)分別以無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值為單一變量，對(duì)皂苷萃取率進(jìn)行分析。按照1.3.1.2、1.3.1.3方法計(jì)算萃取率并繪制圖表、解釋分析。

1.3.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)葡萄皮皂苷萃取率影響較大的3個(gè)因素，采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平（表1），采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平。并用響應(yīng)曲面法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較分析，確定各因素之間的交互作用對(duì)葡萄皮皂苷萃取率的影響，優(yōu)化其萃取條件［36-37］。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factors and levels design

1.3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取經(jīng)優(yōu)化工藝制備的同一樣液，分別在25、35、45、55℃條件下，每隔2 h測(cè)其吸光值，以吸光值的變化反映溫度對(duì)皂苷穩(wěn)定性的影響；測(cè)定Mg2+、K+、Ca2+等金屬離子在不同濃度下的吸光值，反映皂苷的金屬離子穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮中皂苷萃取率的影響選擇無(wú)水乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（V/V）分別為19%、21%、23%、25%、27%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，pH值為6時(shí)，對(duì)葡萄皮皂苷萃取率進(jìn)行研究。考察無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響。如圖1所示，皂苷萃取率和分配系數(shù)隨著無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，于分配理論而言，當(dāng)無(wú)水乙醇較少時(shí)，硫酸銨的鹽析起主要作用，隨著無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黏度增加，同時(shí)相界面的張力也增加，破壞雙水相體系的穩(wěn)定性，從而降低了皂苷的萃取率［38］。由圖1所示，當(dāng)無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%時(shí)，分配系數(shù)和萃取率達(dá)到最高值，綜合考慮確定無(wú)水乙醇的較佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%。

圖1 無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響Figure 1 Effect of mass fraction of anhydrous ethanol on extraction rate of saponins

2.1.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮中皂苷萃取率的影響選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為18%、20%、22%、24%、26%，無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，pH值為6時(shí)，對(duì)葡萄皮皂苷萃取率進(jìn)行研究。考察硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響。如圖2所示，分配系數(shù)和皂苷萃取率隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大，達(dá)到最大值后略有下降，主要原因是：隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，雙水相體系的分相能力逐漸增大，故皂苷萃取率會(huì)增大，但硫酸銨用量飽和后對(duì)萃取率影響不再有明顯的影響；硫酸銨用量不同，上下相電位差也不同，而電位差大小影響萃取率和分配系數(shù)，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，會(huì)破壞皂苷，從而使皂苷萃取率下降［39］。因此，硫酸銨的較佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為24%。

圖2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響Figure 2 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on extraction rate of saponins

2.1.3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)葡萄皮中皂苷萃取率的影響選擇粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%，無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，pH值為6時(shí)，對(duì)葡萄皮皂苷萃取率進(jìn)行測(cè)定。考察粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響。如圖3所示，分配系數(shù)和皂苷萃取率隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，可見，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響上下相的分配。當(dāng)粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到一定值時(shí)，由于皂苷的溶解性是一定的，只增加粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而在無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的情況下，不再溶解皂苷，增加粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)，反而可能會(huì)使溶出量下降。綜合考慮，確定較佳的粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。

圖3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響Figure 3 Effect of mass fraction of crude extract on extraction rate of saponins

2.1.4 pH值對(duì)葡萄皮皂苷萃取率的影響選擇體系pH值分別為3、4、5、6、7，無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)24%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，對(duì)葡萄皮皂苷萃取率進(jìn)行研究?？疾靝H值對(duì)皂苷萃取率的影響。體系pH值可以改變兩相電位差，因此pH值對(duì)萃取物的分配影響較大［2］。圖4表明，分配系數(shù)和皂苷萃取率隨pH值的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，pH值為6時(shí)分配系數(shù)和皂苷萃取率最高，因此確定較佳pH值為6。

圖4 pH值對(duì)皂苷萃取率的影響Figure 4 Effect of pH value on extraction rate of saponins

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化萃取條件及結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)葡萄皮皂苷萃取率影響較大的3個(gè)因素：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、pH值（B）、無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）分別為自變量，皂苷萃取率為響應(yīng)值，在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%的基礎(chǔ)上進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析對(duì)Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2、3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，建立葡萄皮皂苷萃取率工藝參數(shù)回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

由表3數(shù)據(jù)可知，模型P<0.000 1，說(shuō)明回歸方差分析模型顯著，失擬項(xiàng)P值=0.888 1>0.05，差異不顯著，說(shuō)明皂苷萃取率的其他未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾程度小，試驗(yàn)誤差小，該回歸模型與實(shí)測(cè)值能較好的擬合，能很好的對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=0.72%，較低，表明試驗(yàn)具有較好的可靠性；模型決定系數(shù)R2=0.997 7，說(shuō)明響應(yīng)值皂苷萃取率試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值間擬合度良好，校正系數(shù)R2Adj=0.994 8，表明該模型能解釋99.48%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好，可用此模型來(lái)預(yù)測(cè)和分析葡萄皮中的皂苷萃取率。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 The ANOVA results of response surface

從方差分析結(jié)果可以看出，該回歸模型F檢驗(yàn)非常顯著（P<0.01），模型的一次項(xiàng)系數(shù)B（pH值）、C（無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)皂苷萃取率（Y）的影響均為極顯著（P<0.01），而A（粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的影響不顯著（P>0.05）；交互項(xiàng)AC對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著（P<0.01），其他交互項(xiàng)均不顯著（P>0.05）；二次項(xiàng)A2、B2、C2均極顯著（P<0.01）。由模型各因素的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小可知，3個(gè)因素對(duì)葡萄皮中皂苷萃取率影響的大小順序依次是：C>B>A，即無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)>pH值>粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析利用Design-Expert 8.0.6軟件繪制粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)因素的交互作用對(duì)葡萄皮皂苷萃取率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖（圖5）。響應(yīng)曲線圖的曲線越平緩則表示影響越不顯著，反之則亦然；等高線為圓形，表示交互作用不顯著，等高線為橢圓形，則表示交互作用顯著。該結(jié)果與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線Figure 5 Response surfaces and contour plots of interaction of various factors

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用軟件Design-Expert V 8.0.6對(duì)模型進(jìn)行分析，獲得葡萄皮皂苷萃取的最優(yōu)條件為：粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.02%，pH值5.86，無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21.11%。為驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)準(zhǔn)確性及試驗(yàn)的實(shí)際操作考慮，將其修正為粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，pH值6，無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21%。在調(diào)整后的最佳萃取條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，最終皂苷萃取率平均值為90.3%，這與預(yù)測(cè)值90.615 6%相接近，表明了模型的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值擬合較高，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.4.1 溫度對(duì)皂苷穩(wěn)定性的影響由圖6可知，溫度在45℃時(shí)吸光值變化幅度較小，說(shuō)明在此溫度下皂苷的穩(wěn)定性好；而吸光值在25、35、55℃時(shí)都有大幅度的變化，皂苷有被破壞的跡象。

圖6 溫度對(duì)皂苷穩(wěn)定性的影響Figure 6 Effect of temperature on the stability of saponins

2.4.2 金屬離子對(duì)皂苷穩(wěn)定性的影響由圖7所示，不同的金屬離子對(duì)皂苷的穩(wěn)定性有一定的破壞，若吸光值變化幅度較小，說(shuō)明皂苷的穩(wěn)定好；若出現(xiàn)大幅度的變化，說(shuō)明皂苷穩(wěn)定性不好。因此，Mg2+、K+、Ca2+對(duì)皂苷的穩(wěn)定性都有不同程度的影響［40］。

圖7 金屬離子對(duì)皂苷穩(wěn)定性的影響Figure 7 Effect of metal ion on the stability of saponins

3 討論

葡萄皮渣作為葡萄酒生產(chǎn)過(guò)程的主要廢棄物，包括葡萄皮、葡萄籽及少量果肉，年產(chǎn)量近1 000萬(wàn)t。葡萄皮渣中含有多種有機(jī)質(zhì)，可作為生產(chǎn)原料進(jìn)一步開發(fā)利用［41］。近年來(lái)，國(guó)外對(duì)葡萄皮渣的再利用已有較深的研究和了解，且部分研究成果已成功應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)［42-43］。我國(guó)將酒釀葡萄皮渣作為牲畜飼料、肥料甚至垃圾處理。造成了極大的資源浪費(fèi)，同時(shí)污染生態(tài)環(huán)境。因此，對(duì)葡萄皮渣的綜合開發(fā)利用具有重要的意義。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，皂苷為糖的衍生物，具有祛痰止咳、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫能力、降血糖、降血脂、抗結(jié)石等多種功效。目前，天然產(chǎn)物的提取方法包括蒸餾、超聲、微波輔助提取、超臨界流體萃取及雙水相萃取等。水蒸氣蒸餾方法操作簡(jiǎn)便，但提取率低、耗時(shí)較長(zhǎng)且操作溫度高；超聲、微波輔助提取方法對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求較高；超臨界流體萃取具有高效、產(chǎn)生雜質(zhì)少等優(yōu)勢(shì)，但該方法操作復(fù)雜且成本較高［44-45］。雙水相萃取操作條件溫和，可在常溫常壓下進(jìn)行，且設(shè)備簡(jiǎn)單。萃取兩相易分散，傳質(zhì)速度快，不存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題，綠色環(huán)保，適用于萃取生物活性物質(zhì)［46］。王婉麗等［19］對(duì)倒心盾翅藤總皂苷進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，評(píng)價(jià)了乙醇體積、料液比、提取時(shí)間及提取溫度對(duì)皂苷得率的影響，同時(shí)證實(shí)了提取工藝的可行性。但雙水相萃取葡萄皮皂苷的相關(guān)研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)選用雙水相萃取方法，根據(jù)單因素試驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面法考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值等對(duì)皂苷萃取率的影響，確定最佳的提取工藝，證明模型和提取工藝的穩(wěn)定性及可行性。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)采用雙水相法萃取葡萄皮中的皂苷，根據(jù)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面分析法考察粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)皂苷萃取率的影響，確定了萃取葡萄皮中皂苷的最佳條件：無(wú)水乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%，pH值6，萃取率為90.3%。并對(duì)優(yōu)化后的皂苷進(jìn)行穩(wěn)定性研究，結(jié)果表明，45℃時(shí)皂苷穩(wěn)定性最好，金屬離子Mg2+、K+、Ca2+的作用下都對(duì)皂苷的穩(wěn)定性有影響。