多維度單分子成像研究進(jìn)展

李孟帆，陳劍威，石 偉，傅 爽，李昀澤，羅婷丹，陳俊帆，李依明

（南方科技大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系, 廣東 深圳518055）

1 引 言

光學(xué)顯微鏡作為人類利用光線進(jìn)行生命探索工具的歷史悠久，早在300多年前，列文虎克就用自制顯微鏡，對植物、動物細(xì)胞以及灰塵進(jìn)行觀察，證明了微生物的存在，揭開了生命最小單位的神秘面紗。隨著科學(xué)理論的發(fā)展以及技術(shù)的進(jìn)步，19世紀(jì)天文學(xué)家阿貝發(fā)現(xiàn)，限制顯微鏡成像極限的不再是透鏡的放大倍數(shù)，而是系統(tǒng)對點光源會聚成像形成的圈狀衍射光斑，這種光斑被稱為艾里斑（Airy Disk）。即使是無限小的點光源經(jīng)過透鏡后也只能形成有限大小的艾里斑，當(dāng)兩個點光源離得比較近時就難以將它們分辨開。這種判斷方法也被稱為瑞利判據(jù)，在可見光范圍內(nèi)普通物鏡的分辨能力約為200 nm。

近年來，隨著對熒光分子開關(guān)的研究不斷深入以及激光調(diào)制技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，已經(jīng)出現(xiàn)了數(shù)種能夠突破光學(xué)顯微極限達(dá)到高分辨率成像的方法，包括：結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）[1-2]、受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）[3-5]，以及單分子定位顯微鏡（SMLM）[6-11]。其中，SIM技術(shù)的成像速度快，但分辨率提升較低；STED技術(shù)在分辨率和速度上表現(xiàn)都比較好，但缺點是對樣品的光損傷較大。SMLM由于在三者中具有最高的分辨能力且不需要復(fù)雜的光路設(shè)計故被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞器以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究。但受限于其成像原理，SMLM的成像速度慢且對標(biāo)記物要求較高。針對SMLM的上述缺點，近年來許多應(yīng)對這些挑戰(zhàn)的設(shè)計思路被提出，譬如：利用上轉(zhuǎn)換熒光材料實現(xiàn)低能耗超分辨成像（STED）[12-14]，以及采用DNA互補(bǔ)特性實現(xiàn)任何染料都可成像的DNA-PAINT技術(shù)[15-16]等。

常規(guī)熒光顯微鏡在對目標(biāo)熒光激發(fā)成像時往往會因為標(biāo)記密度過大導(dǎo)致在受到激發(fā)且同時發(fā)光的情況下成像不可分辨。譬如線粒體內(nèi)脊、微管以及核孔蛋白等納米尺度下的結(jié)構(gòu)在寬場成像中模糊不清。單分子定位顯微鏡則是通過激光不同步激活、激發(fā)，單分子熒光探針短時間內(nèi)發(fā)生閃爍，保證相機(jī)的每一幀都能獲取到稀疏少量的熒光點圖像。通過計算機(jī)處理，解析獲得的每一幀單分子信息，再將這些信息重新組合在一個圖像空間上，最終獲得高分辨圖像。

光學(xué)系統(tǒng)的沖擊響應(yīng)被稱為點擴(kuò)散函數(shù)（PSF），其形態(tài)由光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)制和發(fā)光點的物理性質(zhì)決定。譬如在光路中插入柱面鏡、起偏器、相位板以及自適應(yīng)光學(xué)器件，又或是點光源本身的特性如熒光探針的發(fā)射波長、空間位置、朝向等參數(shù)都會使PSF形態(tài)產(chǎn)生變化。因此，從單分子圖像中分析出單分子點所包含的信息就是單分子成像方法的核心。點擴(kuò)散函數(shù)工程（PSF Engineering）是將單分子點信息編碼進(jìn)PSF，已成了熱門研究課題。

自單分子定位方法誕生以來，出現(xiàn)了許多的PSF工程設(shè)計與實現(xiàn)方法，也逐漸出現(xiàn)了能獲得某一參數(shù)的更精確信息或是能夠同時獲取多種信息的PSF設(shè)計。本文將闡述多維度的PSF工程技術(shù)，主要概括了目前的多維點擴(kuò)散工程在單分子定位技術(shù)中對熒光點各個信息的解析，包括三維位置、發(fā)射波長以及偶極子朝向等，并簡單介紹了單分子信息提取方法，最后討論了多維度的PSF工程目前在顯微成像中的優(yōu)缺點，并對其在未來的發(fā)展進(jìn)行展望。

2 點擴(kuò)散函數(shù)的多維度信息提取

2.1 單分子二維定位

在寬場成像中，由于所有熒光分子同時發(fā)光，納米尺度的生物結(jié)構(gòu)會被掩蓋（圖1（a）），因此只有200 nm分辨率 。而單分子成像，則利用了熒光分子的開關(guān)特性，使熒光探針不同步發(fā)光。在持續(xù)的激發(fā)光照射下，一小部分的探針被“打開”，稀疏分布的單分子圖像將會被相機(jī)收集（圖1（a），t1）。而在下一時刻已經(jīng)被“打開”的單分子可能會被關(guān)閉，同時另一部分的探針將被“打開”（圖1（a），t2）。部分單分子熒光不斷地“打開”、“關(guān)閉”，大量的稀疏單分子圖片將被采集，通過解析它們所蘊(yùn)含的信息，最終便可以重構(gòu)成一張高密度高分辨率圖像。單分子二維定位則通過計算每一幀圖像中PSF質(zhì)心[17]的位置并進(jìn)行高斯擬合[18]，從而得出熒光探針的二維坐標(biāo)信息[19-21]，最終組合為高分辨率的二維圖像（圖1（b））。理論上每一個單分子圖像都有一個唯一的坐標(biāo)位置，然而在每一次成像中，光子因遵從泊松分布而具有一定概率性，因此定位結(jié)果也具有不確定性。在這種情況下一般能獲得20 nm的二維定位精度。

圖1 單分子二維定位[21]。(a)在采集步驟中，將會獲取稀疏分布的單分子閃爍圖像；(b)分析步驟中，從單幀圖像中準(zhǔn)確定位的單分子二維位置，以及所有單分子點的合成圖像。Fig. 1 Two-dimensional localization of a single molecule [21]. (a) In the acquisition step, sparsely distributed single molecule images are recorded; (b) in the analysis step, the two-dimensional coordinates of the single molecules are precisely localized in each frame and then accumulated to reconstruct the super-resolution image

2.2 單分子三維位置信息的提取

生物研究中，對細(xì)胞器空間分布以及蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義，因此獲取單分子三維位置尤為重要。沿?zé)晒馓结槻煌S向位置單分子圖像的變化情況如圖2（a）所示。然而，在焦點附近的標(biāo)準(zhǔn)PSF隨軸向位置改變而產(chǎn)生的形態(tài)變化非常不明顯 （圖2（a））。同時，處于焦點上方的單分子點產(chǎn)生的圖像與下方的單分子圖像形態(tài)過于相似，難以區(qū)分單分子點軸向位置是處于焦平面上方還是下方。所以，標(biāo)準(zhǔn)PSF通常不能獲得較為精準(zhǔn)的定位。

在早期Huang等[22-23]通過巧妙地在物鏡后焦面插入柱面鏡來打破焦點上下難以區(qū)分的困境。通過人為引入散光像差（astigmatism）將子午面焦點與弧矢面焦點錯位，在焦點平面上下產(chǎn)生橫、縱向拉伸的PSF（圖2（b）），拉伸幅度會隨著單分子點與焦點距離的不同而有所不同。她們采用橢圓高斯擬合精準(zhǔn)定位單分子點的三維位置，焦點位置橫向和軸向的定位精度為10 nm和22 nm。由于其在焦點附近具有較高的軸向分辨率以及實現(xiàn)方式較為簡單，時至今日這都是單分子成像方法的最常用PSF工程之一。

比起借助已有透鏡來調(diào)制不同形狀的PSF，使用相位板（phase plate）、空間光調(diào)制器（Spatial Light Modulator，SLM）和可變形鏡（Deformable Mirror，DM）[24]設(shè)計不同形狀的PSF更靈活。2009年，Moerner實驗室開發(fā)出了復(fù)雜的PSF并用于單分子成像領(lǐng)域，他們基于高斯-拉蓋爾模PSF調(diào)制理論[25-26]，計算出一種旋轉(zhuǎn)傳播的PSF及其所需的相位，并先后將SLM和相位板放置在物鏡后焦面上，成功將軸向位置信息編碼進(jìn)PSF中，這種方法被命名為雙螺旋（Double-Helix,D-H）PSF。圖2（c）兩個旁瓣光斑會隨著單分子點的軸向位置變化而發(fā)生旋轉(zhuǎn)[27-28]。隨后越來越多具有創(chuàng)意的PSF被應(yīng)用在單分子成像領(lǐng)域，例如在后焦面上放置相位斜坡（Phase ramp）產(chǎn)生能夠發(fā)生相對滑動的PSF[29]（圖2（d）），單點旋轉(zhuǎn)的螺旋（Corkscrew）PSF[30]（圖2（e））， 利用艾利光束的自彎曲性[31-32]開發(fā)的基于雙通道無旁瓣P(guān)SF[33]（圖2（f）），圖2（g）為SLM調(diào)制下的光路布局圖。

圖2 各PSF在不同軸向位置的變化及在SLM調(diào)制下的光路布局。（a）標(biāo)準(zhǔn)PSF；（b）散光PSF；(c)雙螺旋PSF[27-28]；(d)相位斜坡PSF[29]；(e)螺旋PSF[30]；(f)自彎曲PSF[33]；(g) SLM調(diào)制下的光路布局Fig. 2 Changes of each PSF at different axial positions and optical path layout for SLM modulation. (a) The standard PSF; (b)astigmatism PSF; (c) double helix PSF[27-28]; (d) phase ramp PSF[29]; (e) spiral PSF[30]; (f) self-bending PSF[33]; (g) optical path layout for SLM modulation

在上述PSF工程出現(xiàn)的數(shù)年間，已經(jīng)出現(xiàn)了許多能夠隨著三維位置出現(xiàn)較大變化的PSF。它們雖然能夠以各種形式解碼出單分子的三維信息，不過需要一個統(tǒng)一的指標(biāo)來衡量PSF的定位精度。相機(jī)像素上收集到的光子數(shù)量在統(tǒng)計上服從泊松分布，而克拉美羅下界（Cramér-Rao lower bound，CRLB）是統(tǒng)計學(xué)上衡量無偏估計量是否有效的重要指標(biāo)，如果一個擬合器有效，那么其擬合結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)該接近CRLB，那么也可以說CRLB是該擬合器能達(dá)到的擬合精度極限[34-35]。

2014年，Shechtman等將光瞳函數(shù)的55項澤尼克（Zernike）多項式幅值作為優(yōu)化參數(shù)[36]，以CRLB作為指標(biāo)構(gòu)建了一項損失函數(shù)：

其中i為CRLB的優(yōu)化維度，z為單分子點軸向位置。利用該損失函數(shù)，Shechtman等在1.5 μm的軸向范圍內(nèi)優(yōu)化出了一個整體三維精度最優(yōu)的鞍點（Saddle Point, SP）PSF，并用相位板實現(xiàn)了該P(yáng)SF，證明了其在三維坐標(biāo)具有更高的定位精度。利用CRLB的優(yōu)化方式具有維度選擇性，譬如只以x、y的CRLB作為優(yōu)化指標(biāo)可以得到在二維坐標(biāo)下定位精度較高的PSF或者只優(yōu)化z維度CRLB得到軸向坐標(biāo)定位精度較高的PSF等。

2015年，Shechtman等以軸向景深為優(yōu)化目標(biāo)，得出了可調(diào)節(jié)軸向定位范圍的Tetrapod PSF[37]（圖3，彩圖見期刊電子版）。與1 μm軸向定位景深的散光調(diào)制PSF相比，其景深能達(dá)到10 μm，并實現(xiàn)了在微流通道（Microfluidic channel setup）中對單分子點追蹤的應(yīng)用。將光瞳函數(shù)的Zernike多項式系數(shù)作為優(yōu)化參數(shù)的方法通常都會得到與Tetrapod類似的PSF。雖然它們能獲得較高的擬合精度，但是由于它們的光子分布較大，單個PSF可能占據(jù)幾十個像素的寬度。當(dāng)分子密度較高時，常會發(fā)生多個PSF重疊現(xiàn)象，傳統(tǒng)的PSF提取程序很難將每個PSF完整分割。因此，這一類的PSF通常應(yīng)用于密度較為稀疏的單分子追蹤（Single Particle Tracking，SPT）或是平面輪廓分析[38-41]。近年來出現(xiàn)將深度學(xué)習(xí)應(yīng)用在重疊PSF的分析方法[42-43]，使得大景深定位成像成為可能。

圖3 不同景深優(yōu)化下的Tetrapod PSF[37]。6 μm優(yōu)化景深下的光瞳函數(shù)（a），理論P(yáng)SF（b），實驗PSF（c），定位精度（d）。（e）～（h）與（a）～（d）相同，但是為10 μm優(yōu)化景深下的Tetrapod PSF。Fig. 3 Tetrapod PSF optimized at different depths of field[37]. (a) The pupil function, (b) theoretical PSF, (c) experimental PSF,(d) localizing accuracy of Tetrapod PSF optimized for 6 μm depth of field. (e)～(h) The same as (a)～(d), but for Tetrapod PSF optimized for 10 μm depth of field.

除了從熒光探針PSF中提取三維信息外，對激發(fā)光調(diào)制也能實現(xiàn)單分子三維定位。2017年Balzarotti等基于探測局部最小激發(fā)光，借助doughnut PSF提出了MINFLUX成像技術(shù)，其橫向分辨率能達(dá)到1 nm[44]。2020年，Klaus等采用三維空心激發(fā)光PSF，進(jìn)一步使用MINFLUX實現(xiàn)了三維定位，其各項同性的定位精度甚至達(dá)到了3 nm[45]。

2.3 單分子圖像的波長信息提取

現(xiàn)代熒光標(biāo)記技術(shù)十分靈活，使用不同發(fā)射波長的熒光探針標(biāo)記不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行多色成像可以研究各細(xì)胞器的空間結(jié)構(gòu)及相互作用。一般的實現(xiàn)手段是在光路上放置二向色鏡，將物鏡接收到的發(fā)射光分為兩路并分別成像在相機(jī)的兩個區(qū)域，根據(jù)兩區(qū)域?qū)?yīng)位置上的PSF強(qiáng)度比值即可推斷出該點的發(fā)射波長。Ilaria等根據(jù)這種方法實現(xiàn)了PtK2 細(xì)胞的三色成像[46]。

雖然多通道分色能夠區(qū)分發(fā)射波長十分接近的熒光探針，但是這也意味著單一通道接收到的光子數(shù)降低，與此同時，其擬合精度就會下降，而且采用不同發(fā)射波長的探針可能都要重新挑選二向色鏡的分光波長，適用性并不普遍。2016年，Broeken等借助衍射原理，通過SLM調(diào)制的稀疏光柵，令原本只有一個光點的PSF衍射為+1、-1和0級衍射亮點，測量1級極大值間隔獲取其波長大小。在1 000光子數(shù)時其波長擬合精度可達(dá)到10 nm，實現(xiàn)了二維位置和熒光波長的同時測量[47]。2016年，Smith等借助SLM更進(jìn)一步設(shè)計了彎曲光柵的后焦面調(diào)制，如圖4（a）～4（b）所示，開發(fā)出了能夠同時擬合三維位置信息和波長信息的PSF[48]。該設(shè)計同樣是利用1級衍射距離判斷波長，同時在不同的深度會發(fā)生顯著變化（圖4（c）），在平均光子數(shù)為800時其擬合光譜精度達(dá)10～20 nm，軸向精度達(dá)25～50 nm。

圖4 同時測量單分子的發(fā)射波長與三維位置 [48] 。（a）光路設(shè)計圖，SLM放置在后焦面上；（b）彎曲光柵的光瞳函數(shù)；（c）3種波長在不同位置下的PSF分布，波長越長2個旁瓣的距離越遠(yuǎn)Fig. 4 Simultaneous measurement of emission wavelength and 3D position of single molecules[48]. (a) Optical path design with an SLM placed on the back focal plane; (b) pupil function of curved grating; (c) PSF distributions of three different wavelengths at different localizations. The longer the wavelength, the farther the distance between the two side lobes

除了采用干涉、衍射方法區(qū)分波長外，還有基于色散原理設(shè)計PSF。Zhang等[49]通過在雙通道分別插入柱面鏡和分光棱鏡的方法，實現(xiàn)了三維位置和熒光光譜的同時定位，并用該方法對差別為10 nm的4種染料進(jìn)行無串?dāng)_三維成像。在SLM中，即使施加電壓相同，不同波長的光經(jīng)過后相位改變也略有差別，針對這一問題，Shechtman等通過最小二乘法計算出一種波長適應(yīng)的SLM電壓[50]，在同一個SLM調(diào)制下，實現(xiàn)了紅光和綠光具有45°角度差的Tetrapod PSF，并進(jìn)行了微管-線粒體的雙色成像。2019年，Hershko等基于上述思路，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在仿真系統(tǒng)中優(yōu)化出一組具有特定波長響應(yīng)SLM電壓[51]，實現(xiàn)了同一視場分辨4種波長的單分子。

隨著深度學(xué)習(xí)在成像領(lǐng)域的發(fā)展，許多以往不被注意的細(xì)節(jié)都能被機(jī)器學(xué)習(xí)解析出來。2019年，Kim等將兩份由不同染料單獨標(biāo)記的原始圖片放入神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行訓(xùn)練[52]，讓網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)到各PSF的軸向和顏色細(xì)節(jié)特征，然后應(yīng)用在未知樣品的三維位置定位及顏色分辨上（圖5）。Kim的報告進(jìn)一步證明了即使對于標(biāo)準(zhǔn)PSF，也能解析出更多的信息，展現(xiàn)了計算科學(xué)的發(fā)展對顯微成像領(lǐng)域的推動作用。

圖5 基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的信息提取方法[52]Fig. 5 Information extraction method based on artificial neural network [52]

2.4 基于單分子圖像的偶極子朝向的參數(shù)提取

在大部分的PSF建模過程中，通常假設(shè)單分子點發(fā)射都是各向同性的。然而在許多情況下單分子點會表現(xiàn)出各向異性，物理層面上表現(xiàn)為具有方向指向的偶極子。對于自由旋轉(zhuǎn)的單分子點來說，由于其朝向每時每刻都在改變，故在相機(jī)曝光時間內(nèi)能夠收集到的光在各個方向的光強(qiáng)比例大致相同。但是如果單分子點被限制在某個方向上時偏振光強(qiáng)分布會發(fā)生偏移，對應(yīng)的PSF的中心會出現(xiàn)大約100 nm的偏差[53-54]。在如圖6（e）所示偶極子模型中，其在xy面的偏轉(zhuǎn)角稱為方位角(azimuthal angle)，表示為φ,與光軸之間的夾角稱為極角(polar angle)，表示為θ，同時由于偶極子可能并未完全固定，自身也會發(fā)生旋轉(zhuǎn)振動，轉(zhuǎn)動角度稱為轉(zhuǎn)動角α。當(dāng)轉(zhuǎn)動角較小時，偶極子光強(qiáng)分布較不均勻，反之，則更偏向于各向同性，如圖6（a）～6（c）（彩圖見期刊電子版）。此外，極角大小也會影響PSF偏移量的大?。▓D6（d））。因此，獲取偶極子朝向可以補(bǔ)償PSF的橫向偏移，提高定位精度；而偶極子朝向在研究膜蛋白相互作用以及排列方式上也具有非常重要的指示作用[55-57]。

圖6 偶極子方向引起的定位偏差[53]。（a） 轉(zhuǎn)動角、極角、方位角分別為15°、45°、0°時單分子點的PSF xz切面（左圖），xy切面（右圖），以及其定位偏差；（b）極角、方位角與（a）相同的情況下轉(zhuǎn)動角為60°的PSF；（c）和（d）分別為不同轉(zhuǎn)動角，極角產(chǎn)生的橫向偏移值；（e）轉(zhuǎn)動角、極角、方位角在偶極子中的物理意義Fig. 6 Localization deviation caused by the dipole’s direction[53]. (a) PSF xz section (left) and xy section (right) of single molecule with a rotation angle, polar angle and azimuth angle of 15°, 45° and 0° respectively, and corresponding localization deviations; (b) PSF with the same polar angle and azimuth angle as (a) and rotation angle of 60°. (c) and (d) are the lateral offsets generated by different rotation angles and polar angles, respectively; (e) physical meaning of rotation angle, polar angle and azimuth angle of the dipole

2012年，Mikael等嘗試通過雙螺旋PSF來獲得偶極子朝向[58]，他們運(yùn)用偏振分束棱鏡將兩正交偏振光分開實現(xiàn)雙通道成像（圖7，彩圖見期刊電子版）。雖然利用各通道的光子比例LD（Linear Dichroism）可以大致推斷出方位角φ的朝向，但偶極子極角θ還未確定。接著，他們根據(jù)雙螺旋PSF特征引入了旁瓣不對稱性LA（Lobe Asymmetry）用以描述極角大小。LA指標(biāo)的引入，解決了只考慮光子比率LD時定位結(jié)果簡并的問題。當(dāng)兩參數(shù)確定時能夠得到唯一的偶極子朝向結(jié)果。

圖7 基于雙螺旋PSF的偶極子方向定位方法[58]。（a）光路布局；（b）和（c）分別為兩個偏振方向的成像通道，它們的光瞳函數(shù)分別為（i）、（ii）；（d）上下圖分別為水平和垂直通道的PSF；（e）和（f）分別為LA、LD指標(biāo)，只考慮LA指標(biāo)時會出現(xiàn)4種可能的朝向結(jié)果。紅色和藍(lán)色分別代表透射通道和反射通道的LD指標(biāo)Fig. 7 Dipole orientation localization method based on double helix PSF[58] . (a) Optical path layout; (b) and (c) are imaging channels in two polarization directions, respectively, and their pupil functions are (i) and (ii) respectively; (d) the upper and lower figures are PSF of horizontal and vertical channels, respectively; (e) and (f) are LA and LD indicators respectively. There are four possible orientations when only the LA indicator is considered. Red and blue represent LD indexes of transmission channel and reflection channel respectively

渦旋相位板(Vortex phase plate)是一種能將高斯光束調(diào)制為空心圓環(huán)的螺旋遞增相位板，通常應(yīng)用在STED顯微鏡[59]的激發(fā)光整形中。2021年，Hulleman 等將渦旋相位板放置在成像光路的傅立葉面上[60]，調(diào)制出Vortex PSF，如圖8（a）（彩圖見期刊電子版）所示。Vortex PSF與標(biāo)準(zhǔn)PSF相比，其偶極子朝向擬合精度有所提高，如圖8（b）～8（c）所示，由于PSF較為緊湊，單分子圖像的信噪比得到提高。他們利用這種方法實現(xiàn)了λ-DNA的偶極子朝向和三維位置的同時定位（圖8（d）（彩圖見期刊電子版））。

圖8 基于vortex PSF的朝向與三維位置同時定位[60]。（a）Vortex PSF光路；在4 000個光子10個背景光子的單分子圖像中，（b）方位角φ和（c）極角θ的CRLB；（d）λ-DNA的二維位置及方位角，偽色代表該點方位角，大小如左下角Fig. 8 Simultaneous localization of the single-molecule orientation and three-dimensional location based on vortex PSF[60] .(a) Vortex PSF’s optical path; CRLB of azimuth angle (b) and polar angle (c) in single molecule imaging with 4 000 photons and 10 background photons; (d) 2D position and azimuthal angle of the λ -DNA. The false color represents the azimuthal angle, as shown in the lower left corner

2.5 4Pi顯微鏡的相位提取

20世紀(jì)90年代，Hell等提出了一種雙物鏡成像系統(tǒng)架構(gòu)[61]。與單物鏡系統(tǒng)相比，其幾乎接收了全立體角（4π）的熒光并發(fā)生自干涉，因此被稱為4Pi顯微鏡。其軸向分辨率比寬場時提高了數(shù)倍。將單分子定位成像法與4Pi顯微鏡的結(jié)合可使軸向分辨率達(dá)到納米級別[62]，這種成像方式被稱為4Pi-SMLM。利用分束器將上下物鏡的光重疊并進(jìn)行干涉成像是4Pi-SMLM的光路設(shè)計特點[63-64]。將上下通道分別延遲不同的相位并在多個通道成像，各個通道的單分子圖像相對光強(qiáng)反映了其干涉相位。由于各通道光強(qiáng)對于相位變化十分敏感，軸向分辨率能達(dá)到單物鏡系統(tǒng)的6～10倍，實現(xiàn)亞10 nm精度的軸向定位[10]。

在4Pi PSF中存在4個相互獨立的維度，即x、y、z和兩物鏡接收到單分子熒光的相位延遲φ。因此，建立4Pi PSF模型就需要獲取各個軸向位置和干涉相位下的4Pi PSF，然而這需要精確的相位延遲方法，這在操作上是難以實現(xiàn)的。2020年Li等在相同光路中（圖9（a）），通過IAB模型從軸向位置中解耦出干涉相位項，從實驗采集的PSF中建立更真實的4Pi PSF模型[65]，如圖9（c）所示。IAB模型可以將四通道實驗PSF分成3個與相位φ無關(guān)的矩陣Ι、Α、Β，只需要校準(zhǔn)3個三維矩陣就可以完整表達(dá)一個實驗型的四維的4Pi-PSF，避免了對四維4Pi-PSF的直接校準(zhǔn)。解決了由于溫度變化對光程的改變所引起的定位偏移，結(jié)果證明了IAB模型能夠達(dá)到理論定位精度，如圖9（b）（彩圖見期刊電子版）所示。

此外，IAB模型還克服了光度法（photometry）在高數(shù)值孔徑物鏡產(chǎn)生定位偏差的問題。由于4Pi實驗裝置是一個多通道光路，天然適合進(jìn)行多色單分子成像。2022年，Chen等提出只需在原有4Pi實驗裝置中π/2和3π/2光路插入濾光片，就能實現(xiàn)目前最簡潔的多色4Pi成像系統(tǒng)[66]，并且相比傳統(tǒng)的多色4Pi方法[67]提升了光子利用率。

3 點擴(kuò)散函數(shù)模型和分析方法

3.1 點擴(kuò)散函數(shù)建模

3.1.1 高斯模型擬合

雖然從光學(xué)計算角度出發(fā)，點光源在像平面的光強(qiáng)分布并非是高斯分布，但是因為艾瑞（Airy）光斑與高斯的形狀相似，且高斯模型的計算更為簡單而被廣泛使用[68]。二維高斯計算模型為：

式（2）中，x0,y0為 高斯中心位置，σ為二維高斯寬度。

不過高斯擬合結(jié)構(gòu)簡單，對于存在由像差、特定偏振等導(dǎo)致的不對稱的PSF并不適用。隨著單分子點遠(yuǎn)離焦點位置，艾瑞光斑會顯示出明顯的衍射環(huán)圖案，高斯模型已不足以描述其變化?？偟膩碚f，高斯模型擬合在單分子點處于焦點附近百納米的對稱PSF時，能夠?qū)崿F(xiàn)理論的二維定位精度。然而在復(fù)雜的光學(xué)調(diào)制情況下，還需要更為真實的PSF模型。

3.1.2 三次樣條插值的實驗點擴(kuò)散函數(shù)模型擬合

為了還原PSF的精細(xì)結(jié)構(gòu)，通常根據(jù)光場分布建立PSF模型，對于大數(shù)值孔徑物鏡的成像系統(tǒng)，還需要使用考慮電場偏振的矢量模型[69-70]。然而它們的計算較為復(fù)雜，并且光學(xué)系統(tǒng)與理想系統(tǒng)存在偏差，通常需要進(jìn)一步校準(zhǔn)。采用圖形處理將離散模型連續(xù)化的樣條插值建模則可以避免這樣的問題[71-72]:

其中Δx、Δy、Δz分別為x、y方向像素大小和軸向步長，m,n,p為各維度階數(shù)，ai,j,k,m,n,p為插值系數(shù)。每一個位置的PSF強(qiáng)度至多需要64個多項式參與計算。

通過在載玻片上放置熒光珠，移動z軸位移臺，可以獲得三維實驗PSF圖像。隨后采用插值算法將其連續(xù)化，便可建立更真實的插值PSF模型。通過將實驗采集圖像與插值PSF進(jìn)行極大似然估計或是最小二乘法，找出最為相似的PSF模型，從而解析單分子圖像中的信息。由于插值算法形式固定，因此可以便捷地采用硬件輔助，Li等利用GPU加速計算實現(xiàn)了每秒擬合十萬個單分子點的高速擬合[72]。

3.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的信息提取

深度學(xué)習(xí)算法的出現(xiàn)解決了密集且復(fù)雜的PSF無法進(jìn)行單分子定位成像的問題。2018年，Nehme等開發(fā)出一套基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法的單分子定位工具Deep-STORM[42]。通過提前設(shè)置單分子點密度和信噪比生成單分子圖片，訓(xùn)練出能夠從重疊的單分子圖片中還原二維位置的網(wǎng)絡(luò)。他們演示了通過這種方法解析信噪比較低的仿真圖像以及實驗成像的微管二維定位。

2020年Nehme等進(jìn)一步開發(fā)出能夠進(jìn)行三維定位的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)Deep STORM3D[43]。他們隨機(jī)生成大量不同軸向位置的高密度單分子仿真圖像，不斷優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)直到能夠有效還原單分子點的真實位置，訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)對重疊PSF的三維定位能力，從而實現(xiàn)高密度單分子定位（如圖10所示）。通過這種方法他們實現(xiàn)了使用Tetrapod PSF對COS-7細(xì)胞上高標(biāo)記密度線粒體的三維成像。由于訓(xùn)練模型的可選擇性，他們也實現(xiàn)了該系統(tǒng)對多種PSF的三維定位。

圖10 基于卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的單分子定位流程圖。（a）網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練步驟；（b）定位步驟Fig. 10 Flowchart of single molecule localization based on convolutional neural network. (a) Network training steps; (b) localizing steps

2021年，Artur等基于上述定位方法，考慮了跨鄰幀中所蘊(yùn)含的信息的相關(guān)性(Temporal Context)，開發(fā)出下文依賴的深度學(xué)習(xí)定位方法DECODE[73]。與Deep STORM3D相比，其高密度PSF的定位速度提高了10倍，準(zhǔn)確率提高了2倍，在達(dá)到理論定位精度的同時對定位結(jié)果還可做出不確定度預(yù)測。雖然基于深度學(xué)習(xí)的單分子定位能夠?qū)崿F(xiàn)快速計算，但是每當(dāng)光學(xué)系統(tǒng)發(fā)生變化時，都需要花費數(shù)小時重新訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)，不過遷移學(xué)習(xí)能夠縮短新網(wǎng)絡(luò)建立成本，隨著算法的進(jìn)一步發(fā)展，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可能將會被廣泛應(yīng)用于單分子成像中。

4 結(jié)束語

在成像技術(shù)中，PSF一直都被視為解析單分子點信息的窗口之一。本文介紹了二維單分子定位，多種三維PSF工程設(shè)計，以及從PSF提取出的多維度信息，包括熒光發(fā)射波長、偶極子朝向、自干涉相位，最后介紹了常用的定位方法。

需要指出的是，對PSF進(jìn)行改造雖然提高了其對于某一維度的定位精度，但是同時也常需要對另外一些性能做出取舍，譬如增大了PSF面積，或是降低了其他維度的定位精度、縮短了定位范圍等。因此，常常需要結(jié)合應(yīng)用場景以及需要解析的單分子信息，挑選合適的PSF進(jìn)行單分子成像。

由于單分子定位成像涉及到成像原理、材料特性、數(shù)據(jù)處理等多領(lǐng)域，因此進(jìn)一步探索多維度信息可以從以下幾個方面出發(fā)：通過添加額外的光學(xué)設(shè)備以增加研究維度，譬如通過檢偏器測量單分子朝向[48]；通過熒光材料特征反映細(xì)胞微環(huán)境，解析熒光壽命分辨標(biāo)記的染料類型[74]；從需要探究的問題中尋找定位維度，譬如單分子追蹤中的運(yùn)動模型參數(shù)[75]；從具有誤差的圖像中還原單分子信息，如校準(zhǔn)由于折射率不匹配導(dǎo)致的定位誤差[76]；通過高效的算法提升成像質(zhì)量，譬如多通道全局?jǐn)M合定位[77]等。總的來說，多維度單分子成像研究是一個多領(lǐng)域、多方向的課題，隨著更多學(xué)科的加入，已經(jīng)展現(xiàn)出了巨大的研究潛能和寬廣的應(yīng)用前景。