用于細胞脂滴超分辨熒光成像的有機熒光探針研究進展

周 日，王晨光，盧革宇

（吉林大學(xué) 電子科學(xué)與工程學(xué)院 集成光電子學(xué)國家重點實驗室, 吉林 長春 130012）

1 引 言

脂滴是一種球形細胞器，它的內(nèi)部是由甘油三酯和膽固醇酯等構(gòu)成的中性脂質(zhì)核，核外包覆著嵌有多種蛋白的磷脂單層膜。脂滴廣泛存在于絕大部分真核細胞中，主要位于細胞質(zhì)中；少部分類型細胞的細胞核中也存在著脂滴分布[1-2]。關(guān)于脂滴的生物起源，目前被普遍接受的假設(shè)是脂滴來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其在蛋白的調(diào)控下，以出芽的方式從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)構(gòu)中脫落，從而進入細胞質(zhì)中形成新生脂滴[3-5]。該假設(shè)的形成主要是基于脂滴生長所需的中性脂質(zhì)的合成酶都是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被發(fā)現(xiàn)的[6]。在不同類型的細胞中，脂滴尺寸差別較大，如在脂肪細胞中，脂滴直徑約10～200 μm；在棕色脂肪組織、肝臟以及心臟中，脂滴直徑約為0.1～1 μm；對于剛從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的新生脂滴，其直徑只有30～60 nm。脂滴之前一直被認為是細胞內(nèi)惰性脂肪堆積顆粒。但隨著對脂滴研究的逐漸深入，人們認識到脂滴是一種重要的細胞器，在脂質(zhì)存儲、膜合成及轉(zhuǎn)運等細胞生物學(xué)過程中起重要作用。此外，脂滴還參與細胞內(nèi)蛋白存儲、病毒復(fù)制、以及炎癥反應(yīng)等活動[7-9]。糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、肥胖癥、以及癌癥等與上述生理活動過程相關(guān)的各種代謝類疾病也都跟脂滴的功能紊亂密切相關(guān)[10-13]。因此，脂滴研究已然成為細胞生物學(xué)領(lǐng)域最受關(guān)注的研究方向之一。

為了使脂滴結(jié)構(gòu)及分布可視化，有學(xué)者研究了脂滴在細胞中的復(fù)雜生理功能，熒光成像技術(shù)因其高空間分辨率、高實時性、無輻射和無需樣品侵入等優(yōu)點而被廣泛采用[14-16]。在眾多熒光成像技術(shù)中，寬場顯微鏡和共聚焦顯微鏡是觀察研究脂滴最常用的工具。但由于光學(xué)衍射極限的限制，兩者的分辨率只能達到250 nm左右，這對于觀察小脂滴，尤其是新生脂滴來說是遠遠不夠的[14-16]。無需熒光標(biāo)記就可以實現(xiàn)對脂滴長期動態(tài)追蹤的相干反斯托克斯拉曼散射顯微鏡同樣受到光學(xué)衍射極限的限制，成像分辨率不足[17-18]。具有高分辨率的電子顯微鏡因為具有樣品侵入性，無法提供活細胞內(nèi)脂滴的實時信息。

在這種情況下，近年來新興的各種能夠打破光學(xué)衍射極限的超分辨熒光顯微鏡成為納米尺度研究活細胞小脂滴，尤其是新生脂滴最有力的工具[19-49]。目前，已成功用于細胞脂滴熒光成像的超分辨顯微鏡有受激發(fā)射損耗顯微鏡（STED）[19-26]、結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）[27-30]和光激活定位顯微鏡（PALM）[31-33]。它們根據(jù)不同的原理巧妙地繞開了光學(xué)衍射極限的限制，實現(xiàn)了脂滴的超分辨成像。本文將簡單介紹這幾種超分辨顯微鏡的工作原理，討論其對熒光探針光物理性質(zhì)的特殊要求，并進一步系統(tǒng)總結(jié)脂滴超分辨成像熒光探針的研究進展。在眾多的熒光探針材料體系中，如有機小分子、有機或無機納米粒子、熒光蛋白等，有機小分子熒光探針具有結(jié)構(gòu)組成明確、發(fā)光性質(zhì)易于精準調(diào)控、尺寸小、細胞膜通透性高、標(biāo)記靶向性好等優(yōu)勢，因此受到廣泛關(guān)注。目前用于細胞脂滴超分辨成像的熒光探針，也基本全是有機小分子。有機小分子熒光探針選擇性標(biāo)記細胞脂滴是基于物理化學(xué)領(lǐng)域的“相似相容原理”，一般具有較為疏水的特性。與此同時，本文將分析對比不同超分辨顯微鏡在脂滴熒光成像方面的優(yōu)勢與不足，并對其發(fā)展趨勢進行展望。

2 脂滴STED超分辨成像熒光探針

2.1 STED顯微鏡成像原理及其對熒光探針的要求

STED顯微鏡成像原理由德國S. W. Hell教授于1994年首次提出[50]，并于1999年在其搭建的STED成像系統(tǒng)中得到實驗證實[51]。STED顯微鏡成像的基本原理如圖1（彩圖見期刊電子版）所示。

圖1 STED超分辨顯微鏡原理Fig. 1 The principle of the STED super-resolution microscope

該超分辨顯微鏡是在激光掃描共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上改造所得，其采用兩束激光，一束激發(fā)光將熒光分子從基態(tài)S0激發(fā)至激發(fā)態(tài)S1，然后間隔較短的時間（ps級）再施加另外一束環(huán)形損耗光，即STED激光，照射光斑環(huán)形區(qū)域內(nèi)的熒光分子，使它們通過受激輻射方式從激發(fā)態(tài)S1返回基態(tài)S0，呈現(xiàn)在檢測器上的熒光信號就只剩位于環(huán)形損耗光中空區(qū)域的熒光分子自發(fā)輻射形成的光斑，從而實現(xiàn)超分辨成像。通過點擴散函數(shù)（PSF）的抑制作用，使得位于環(huán)形區(qū)域內(nèi)的熒光分子從熒光亮態(tài)轉(zhuǎn)換成了熒光暗態(tài)。理論上，STED環(huán)形損耗光功率越高，它的中空區(qū)域面積就越小，得到的半峰全寬分辨率就越高。STED超分辨成像的分辨率d可表示為：

式中Isat是熒光探針在一定波長的STED環(huán)形損耗光下具有的飽和強度，定義為熒光探針的信號強度被損耗到一半時所用的STED環(huán)形損耗光強度；I為成像時所施加的STED環(huán)形損耗光強度；NA為顯微鏡的數(shù)值孔徑；λ為激發(fā)光波長。STED超分辨成像技術(shù)是一個物理過程，成像速度快，時間空間分辨率高，不需要額外施加算法以及圖片后處理等復(fù)雜的步驟。為了得到較高的分辨率，通常需要使用很強的STED損耗光，其功率密度一般在101～102MW cm-2范圍內(nèi)。如此高的強度通常會對所使用的熒光探針產(chǎn)生嚴重的光漂白（即熒光信號迅速消失）[52-54]，因此該成像技術(shù)對熒光探針的光穩(wěn)定性要求非常嚴苛。除此之外，STED顯微鏡對熒光探針的吸收發(fā)射區(qū)間、損耗特性也有一定的要求。常用的STED損耗光有3種，分別位于592 nm、660 nm和775 nm處。對于熒光探針來說，所選用的STED損耗光要盡量遠離吸收光譜，這樣可以避免再激發(fā)過程。同時也要與發(fā)射光譜有較大的重疊，以保證具有較大的損耗截面。此外，熒光探針還需要具有優(yōu)異的損耗特性，即易于發(fā)生受激輻射過程。在這種情況下，具有大斯托克斯位移的有機熒光探針在STED超分辨成像中備受青睞。

2.2 用于細胞脂滴STED超分辨成像的熒光探針

STED超分辨成像要求所用熒光探針具有高光穩(wěn)定性、良好的受激輻射特性以及合適的吸收發(fā)射光譜性質(zhì)。為了增強有機小分子熒光探針的光穩(wěn)定性，常用的策略有兩種：一是通過在分子骨架上引入吸電子基團來降低LUMO能級，從而有效提升熒光分子的光穩(wěn)定性[55-56]；二是通過構(gòu)筑并環(huán)結(jié)構(gòu)抑制雙鍵異構(gòu)，從而提升光穩(wěn)定性[57-58]。Taki等人通過在梯形的雙噻吩并苯π共軛骨架上以氧化噻吩環(huán)上硫原子的方式引入強吸電子基團，基于該設(shè)計策略得到了具有高光穩(wěn)定性的脂滴熒光探針LAQ1（圖2）[19]。與脂滴商用染料BODIPY 493/503相比，LAQ1的光穩(wěn)定性得到顯著提升。將該熒光探針用于多色熒光成像，成功在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上捕獲到了小的脂滴，為脂滴的生物起源提供了直觀證據(jù)（圖3（a）～3（b），彩圖見期刊電子版）。高的光穩(wěn)定性以及給受體結(jié)構(gòu)帶來的大斯托克斯位移使得熒光探針LAQ1適用于STED超分辨成像。在STED成像中，LAQ1染色

圖2 用于脂滴STED超分辨成像的有機熒光探針Fig. 2 The organic fluorescent probes for STED super-resolution imaging of lipid droplets

圖3 脂滴熒光探針LAQ1在多色共聚焦成像和STED超分辨成像中的應(yīng)用。（a）脂滴、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的三色熒光成像；（b）穿過白色箭頭的信號強度分布；（c）小脂滴的STED成像；（d）穿過同一小脂滴的共聚焦和STED成像信號強度圖[19]Fig. 3 The applications of lipid droplets fluorescent probe LAQ1 in multicolor confocal imaging and STED super-resolution imaging. (a) Three-color fluorescence imaging of lipid droplets, endoplasmic reticulum and mitochondria; (b) signal intensity profiles across the white arrow; (c) STED imaging of lipid droplets; (d) confocal and STED imaging signal intensity profiles across the same lipid droplet[19]

的細胞脂滴分辨率達166 nm，打破了光學(xué)衍射極限的限制，明顯低于共聚焦模式下的分辨率245 nm（圖3（c）～3（d））。另外，較高的光穩(wěn)定性使得熒光探針LAQ1能夠用于長時間三維成像，在7 h內(nèi)成功監(jiān)測到了脂滴內(nèi)脂質(zhì)的分解以及隨之而來的脂質(zhì)生成過程。熒光探針LAQ1的設(shè)計策略對于研制新型高光穩(wěn)定性脂滴熒光探針具有一定的指導(dǎo)意義。

Tang等人研制了具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射（AIE）特性的脂滴熒光探針DTPA-BT-M[20]，其具有較大的雙光子吸收截面（1 581 GM）和大的斯托克斯位移。該熒光探針一方面可以用于細胞脂滴STED超分辨成像，在STED成像模式下能夠?qū)崿F(xiàn)95 nm的分辨率（圖4（a），彩圖見期刊電子版）；另一方面也可以用于細胞脂滴雙光子熒光成像，組織穿透深度可達300 μm（圖4（b），彩圖見期刊電子版）。與傳統(tǒng)的共聚焦以及寬場顯微鏡相比，95 nm的分辨率已經(jīng)得到了較大的提升，但是該分辨率對于觀測脂滴尺寸在100 nm左右以及更小的新生脂滴（30～60 nm）來說[1-5]，仍然略顯不足。

圖4 脂滴熒光探針DTPA-BT-M在（a）STED超分辨和（b）雙光子成像中的應(yīng)用[20]Fig. 4 The applications of lipid droplets fluorescent probe DTPA-BT-M in (a) STED super-resolution and (b) two-photon imaging[20]

如何進一步提升細胞脂滴STED超分辨成像的分辨率，最大程度地發(fā)揮STED成像技術(shù)的潛力?首先，使用熒光探針對細胞脂滴進行高效選擇性標(biāo)記是前提。這就需要明晰熒光探針的分子結(jié)構(gòu)與細胞脂滴標(biāo)記選擇性之間的構(gòu)效關(guān)系。本課題組在這方面開展了較為系統(tǒng)的工作，明確指出與熒光探針適合的親疏水性是高效選擇性標(biāo)記脂滴的關(guān)鍵，熒光探針的分子尺寸以及細胞膜穿透性對于高效標(biāo)記脂滴也有一定影響[59]。隨后，需進一步考慮提升熒光探針的光穩(wěn)定性，因為STED超分辨成像所使用的極強損耗激光會對熒光探針造成快速光漂白。最后，在標(biāo)記選擇性和光穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，考慮如何調(diào)控?zé)晒馓结樀墓馕锢硇再|(zhì)以最大程度提升STED超分辨成像分辨率。這3個方面的遞進研究，有望實現(xiàn)納米尺度的細胞脂滴熒光成像。

基于此，本課題組研制了一種基于均二苯乙烯骨架的脂滴熒光探針Lipi-DSB（圖5，彩圖見期刊電子版）[21]。在均二苯乙烯分子骨架的中心苯環(huán)兩側(cè)雙鍵和分子兩端分別引入吸電子的氰基和給電子的胺基，得到了具有大斯托克斯位移和高光穩(wěn)定性的給受體結(jié)構(gòu)熒光探針Lipi-DSB。氰基的引入有效提升了光穩(wěn)定性，而胺基的引入則調(diào)控了該熒光探針的脂滴染色選擇性。鑒于該探針極性敏感的發(fā)射特性，通過原位波長掃描的方式測得細胞中脂滴內(nèi)的極性介于甲苯和二氧六環(huán)之間，表明細胞脂滴內(nèi)親脂疏水的環(huán)境。將熒光探針Lipi-DSB用于STED超分辨成像，在660 nm損耗光（CW-STED）下該探針展現(xiàn)出了較高的損耗效率，飽和強度（Isat）為10.1 MW cm-2，低于STED成像黃金標(biāo)準熒光探針ATTO 647N的值（（10～20） MW cm-2）[60-62]。這與該探針較大的斯托克斯位移密不可分，因為它可以使發(fā)射光譜與損耗激光有較大的重疊，提高了損耗效率。在STED成像模式下，熒光探針Lipi-DSB染色的細胞脂滴隨著損耗光功率從0增加到40 MW cm-2，半峰全寬分辨率也從222 nm提高到了58 nm，遠低于光學(xué)衍射極限（圖5（a））。較大的斯托克斯位移使得該探針可以搭配其他具有小斯托克斯位移的熒光探針?biāo)募谆_丹明實現(xiàn)雙色STED成像，從而在納米尺度清晰地觀察脂滴與線粒體的相互作用（圖5（b））。鑒于該探針優(yōu)異的光穩(wěn)定性，將該探針用于動態(tài)STED超分辨成像跟蹤，能夠連續(xù)拍攝1 000張STED照片（圖5（c））。可見，在同一損耗激光照射下，四甲基羅丹明很快即被光漂白，而Lipi-DSB幾乎沒有光漂白。通過動態(tài)STED成像，首次觀測到了納米尺度新生脂滴的融合過程（圖5（d））。

圖5 脂滴熒光探針Lipi-DSB的STED超分辨成像。（a）損耗激光功率依賴的分辨率；（b）與線粒體熒光探針?biāo)募谆_丹明搭配的雙色STED成像；（c）連續(xù)1 000幀的STED超分辨成像動態(tài)跟蹤；（d）STED超分辨成像動態(tài)跟蹤納米尺度新生脂滴的融合過程[21]Fig. 5 STED super-resolution imaging of lipid droplets fluorescent probe Lipi-DSB. (a) STED laser power-dependent resolution; (b) two-color STED imaging of Lipi-DSB paired with mitochondria fluorescent probe tetramethylrhodamine;(c) time-lapse STED super-resolution imaging (1 000 consecutive frames); (d) dynamic tracking of nascent lipid droplet fusion processes at the nanoscale by STED super-resolution imaging[21]

鑒于脂滴熒光探針Lipi-DSB優(yōu)異的STED超分辨成像性能，本課題組對均二苯乙烯骨架進行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，通過內(nèi)嵌砜基吸電子基團來構(gòu)筑并環(huán)結(jié)構(gòu)，合成了具有高光穩(wěn)定性和大斯托克斯位移的脂滴熒光探針Lipi-BDTO[22]。該探針在660 nm損耗激光下的飽和強度為6.8 MW cm-2，比熒光探針Lipi-DSB的值（10.1 MW·cm-2）還要低，說明了其優(yōu)異的損耗效率。將該探針用于共聚焦和STED超分辨成像（圖6（a），彩圖見期刊電子版）。很多共聚焦成像無法觀察到的小脂滴在STED成像下可清晰觀察到， STED成像分辨率可以達到65 nm。在脂滴動態(tài)追蹤STED成像中，連續(xù)拍攝200張STED照片后仍能保持70%的熒光強度，說明了熒光探針Lipi-BDTO具有很高的光穩(wěn)定性。因此，將該熒光探針用于細胞脂滴的3D STED成像（圖6（b），彩圖見期刊電子版），xy平面和z軸方向分辨率分別為90 nm和110 nm，達到了較高的水平。

圖6 脂滴熒光探針Lipi-BDTO的共聚焦和STED超分辨成像。（a）共聚焦和STED成像對比；（b）3D STED成像[22]Fig. 6 Confocal and STED super-resolution imaging of the lipid droplets fluorescent probe Lipi-BDTO. (a) Comparison of confocal and STED imaging; (b) 3D STED imaging[22]

綜上所述，用于STED超分辨成像的脂滴熒光探針首先應(yīng)具有較高的脂滴染色選擇性和光穩(wěn)定性，之后可以進一步通過改變分子結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)熒光探針的光物理性質(zhì)以實現(xiàn)納米尺度的細胞脂滴熒光成像。例如，可以通過構(gòu)建給受體結(jié)構(gòu)來增大熒光探針的斯托克斯位移，在增大損耗截面（σ）以提升損耗效率的同時，還能夠避免吸收光譜與損耗激光交叉所造成的再激發(fā)過程。由式（1）可知，STED超分辨成像的分辨率d與飽和強度Isat密切相關(guān)，而Isat又取決于以下公式：

式中，h為普朗克常量，c為光速，σ為損耗截面，τ為探針的熒光壽命，λSTED為損耗光波長。由于h，c和λSTED均為定值，因此可以考慮通過增大σ或τ以降低Isat，從而提高STED成像分辨率。本課題組已經(jīng)通過增大損耗截面σ的方式成功地提升了STED超分辨成像分辨率，要想在現(xiàn)有研究成果的基礎(chǔ)上進一步提升分辨率，可以考慮研制長熒光壽命的新型有機熒光探針。長的熒光壽命一方面能夠降低飽和強度Isat，另一方面還能通過時間門控檢測方式進一步提升分辨率。

3 脂滴SIM超分辨成像熒光探針

3.1 SIM成像原理及對其對熒光探針的要求

SIM超分辨顯微鏡是由M. Gustafsson教授于2000年首次提出的[63-64]。其成像原理是通過具有精細條紋圖案的光源照射樣品，利用條紋形狀入射光與物體不同角度之間的混頻生成摩爾條紋（圖7），從而在低頻區(qū)域收集到物鏡無法分辨的樣品復(fù)雜結(jié)構(gòu)細節(jié)對應(yīng)的高頻信息[65-66]。通過持續(xù)改變結(jié)構(gòu)照明的方向以及相位，在成像過程中得到多張具有摩爾條紋的樣品照片，分析處理這些照片后即可得到清晰的樣品復(fù)雜結(jié)構(gòu)圖像。與STED成像相比，SIM成像對所使用熒光探針的光物理性質(zhì)沒有特別需求。從成像原理來說，與傳統(tǒng)寬場顯微鏡相比，SIM超分辨顯微鏡的分辨能力僅能提升一倍，即100 nm左右。

圖7 SIM超分辨成像原理[64]Fig. 7 The principle of SIM super-resolution microscope[64]

3.2 用于細胞脂滴SIM超分辨成像的熒光探針

SIM超分辨顯微鏡對所使用熒光探針的光物理性質(zhì)無特別需求，通常用于脂滴共聚焦成像的熒光探針一般也可以用于脂滴的SIM超分辨成像。但為了研究脂滴在細胞內(nèi)的動態(tài)過程，高的光穩(wěn)定性對于SIM超分辨成像來說十分重要。對于提升熒光探針的光穩(wěn)定性，如上文所述，可以通過調(diào)節(jié)熒光探針的分子結(jié)構(gòu)來增強光穩(wěn)定性。此外，通過使用具有熒光開關(guān)特性的熒光探針構(gòu)建緩沖體系，也是提升光穩(wěn)定性的有效策略[27-67]。Xu等人研制了一種具有熒光開關(guān)特性的細胞脂滴熒光探針LD-FG（圖8）[27]，該探針具有氫鍵敏感特性。在脂滴內(nèi)部的中性脂質(zhì)環(huán)境下，不存在氫鍵作用，展現(xiàn)出熒光亮態(tài)。在細胞質(zhì)等極性條件下，由于氫鍵作用展現(xiàn)出熒光暗態(tài)（圖9（a）～（b），彩圖見期刊電子版）。因此，使用該探針進行脂滴熒光成像，可以在免洗的條件下實現(xiàn)較高的信噪比。培養(yǎng)基以及細胞質(zhì)中儲存的完整熒光探針可以高效替換脂滴中被光漂白的熒光探針，從而通過這種緩沖液策略實現(xiàn)了高的光穩(wěn)定性。當(dāng)然，這種高的光穩(wěn)定性是熒光成像表觀上的，不是說熒光探針沒有被光漂白。將熒光探針LD-FG用于細胞脂滴SIM超分辨成像，成功地追蹤到了多種脂滴動態(tài)過程，如脂滴的生長、收縮、快速運動和相互融合等。其中，脂滴融合包括相鄰脂滴間的融合（圖9（c），彩圖見期刊電子版）和不相鄰脂滴間的融合（圖9（d），彩圖見期刊電子版）。這些結(jié)果充分說明了緩沖液策略可以有效提高熒光探針表觀的光穩(wěn)定性，為研制新型用于脂滴SIM超分辨成像的熒光探針提供了一種獨特的設(shè)計思路。

圖8 用于脂滴SIM超分辨成像的有機熒光探針Fig. 8 The organic fluorescent probes for SIM super-resolution imaging of lipid droplets

圖9 脂滴熒光探針LD-FG的SIM超分辨成像。（a）緩沖策略提升光穩(wěn)定性；（b）熒光探針的光開關(guān)特性；（c）相鄰脂滴間的融合；（d）不相鄰脂滴間的融合[27]Fig. 9 SIM super-resolution imaging of the lipid droplets fluorescent probe LD-FG. (a) Buffer strategy enables stable imaging of lipid droplets; (b) fluorescence switching property of the fluorescent probe; (c) coalescence between adjacent lipid droplets; (d) coalescence between non-adjacent lipid droplets[27]

除此之外，目前關(guān)于有機熒光探針的脂滴SIM超分辨成像的報道仍非常有限。例如，Chen等人研制了一種近紅外脂滴熒光探針DTZ-TPADCN[28]（圖8）。該探針不僅可以染色細胞質(zhì)中的脂滴，還可以染色細胞核內(nèi)的核脂滴（圖10（a），彩圖見期刊電子版）。與細胞質(zhì)中脂滴不同的是，核脂滴是由具有代謝活性的內(nèi)核膜產(chǎn)生，可以調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，局部調(diào)節(jié)信號脂質(zhì)的可用性，并能夠在脂滴和細胞核之間交換蛋白。將該探針用于SIM超分辨成像，在觀察細胞質(zhì)中脂滴的同時，還能追蹤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)下細胞核內(nèi)脂滴的形成，并且首次觀察到了信號脂質(zhì)（甘油二酯）可以促進核脂滴的生成。Yang等人研制了一種脂滴熒光探針NIM-3A[29]，該探針具有較高的脂滴染色選擇性，適用于活細胞中脂滴的超分辨成像。在SIM超分辨顯微鏡下，使用該探針染色細胞脂滴后允許在單細胞水平定量測量脂滴的數(shù)量和尺寸（圖10（b），彩圖見期刊電子版），并且該探針還能用于細胞脂滴的動態(tài)過程監(jiān)測。此外，Yang等人還研制了一種基于萘二甲酰亞胺的脂滴熒光探針NIM-7[30]。該探針在染色細胞脂滴的同時，還能染色細胞內(nèi)的溶酶體。將該探針用于SIM超分辨成像，通過在不同的激發(fā)波長下檢測不同的熒光通道，可以同時實時地追蹤細胞內(nèi)脂滴和溶酶體的動態(tài)過程（圖10（c），彩圖見期刊電子版）。熒光探針NIM-7允許通過三維成像定量觀察細胞中的脂滴和溶酶體，還能用于不同的細胞線以及斑馬魚胚胎中。

圖10 有機熒光探針在脂滴SIM超分辨成像中的應(yīng)用。（a）熒光探針DTZ-TPA-DCN用于染色核脂滴[28]；（b）熒光探針NIM-3A用于分析細胞內(nèi)脂滴數(shù)量和尺寸[29]；（c）熒光探針NIM-7用于追蹤脂滴和溶酶體的動態(tài)過程[30]Fig. 10 Applications of organic fluorescent probes in SIM super-resolution imaging of lipid droplets. (a) Fluorescent probe DTZ-TPA-DCN used for staining nuclear lipid droplets[28]; (b) fluorescent probe NIM-3A used for analyzing the number and size of lipid droplets[29]; (c) fluorescent probe NIM-7 used for tracking dynamic processes of lipid droplets and lysosomes[30]

與共聚焦成像相比，SIM超分辨成像可以提供更高的分辨率，以便更清晰地觀察脂滴的空間分布以及追蹤脂滴的動態(tài)過程。雖然成像分辨率不及STED超分辨顯微鏡，但SIM超分辨顯微鏡適用性更廣。從理論上講，大部分的脂滴共聚焦成像熒光探針都能應(yīng)用于脂滴SIM超分辨成像。而且，SIM超分辨成像技術(shù)的進步，如SSIM（飽和結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡）、Hessian-SIM（海森結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡）、GI-SIM（掠入射結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡）、JSFR-SIM（空頻重建結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡）等[39-45]，可以進一步提升成像空間時間分辨率。

4 脂滴PALM超分辨成像熒光探針

4.1 PALM成像原理及其對熒光探針的要求

與STED超分辨成像的點擴散函數(shù)抑制和SIM超分辨成像的結(jié)構(gòu)光調(diào)制不同，PALM超分辨成像通過單分子定位的原理打破衍射極限的限制從而實現(xiàn)超分辨成像[68]。對于傳統(tǒng)的寬場顯微成像，樣品中每個熒光分子都是同時點亮的，這樣會引起每個熒光分子的艾里斑疊加在一起從而無法清晰分辨。當(dāng)僅有部分相互間距離較大的熒光分子是點亮狀態(tài)時，它們的艾里斑就可以相互區(qū)分開，每個熒光分子的發(fā)光中心就能夠定位，并且定位精度可以很高。之后再通過對每個熒光分子位置進行疊加處理，就可以重構(gòu)出分辨率超越衍射極限的熒光照片。這就是單分子定位的成像原理（圖11，彩圖見期刊電子版）。PALM超分辨顯微鏡采用的即是該原理，它的成像分辨率d為：

圖11 分子定位技術(shù)原理示意圖[68]Fig. 11 Schematic diagram of molecular localization technology[68]

式中λ為激發(fā)波長，NA為顯微鏡的數(shù)值孔徑，N指的是每個熒光團包含的光子個數(shù)（一般在幾百到幾千）。因此，PALM超分辨顯微鏡的空間分辨率可以達到很高（約20 nm）。但與STED和SIM成像技術(shù)相比，復(fù)雜的數(shù)據(jù)和圖像后處理步驟致使PALM成像速度較慢，時間分辨率不高。根據(jù)上述成像原理，PALM超分辨成像對熒光探針的要求就是需要熒光探針在組合激光（激活光和激發(fā)光）的照射下能夠?qū)崿F(xiàn)光開關(guān)，這樣利用熒光探針在熒光亮態(tài)和熒光暗態(tài)之間隨機切換的特性就可以實現(xiàn)單分子定位，進而實現(xiàn)PALM超分辨成像。

4.2 用于細胞脂滴PALM超分辨成像的熒光探針

在PALM超分辨成像中，最常用的熒光探針是熒光蛋白和有機分子，一個熒光蛋白通常包含幾百個光子，而一個有機分子通常包含幾千個光子。由式（3）可知，光子數(shù)越多實現(xiàn)的分辨率就越高。因此，從分辨率的角度來說，有機分子熒光探針比熒光蛋白更具優(yōu)勢。應(yīng)用于PALM超分辨成像的有機分子熒光探針為了具有光開關(guān)特性，通常需要在分子結(jié)構(gòu)上修飾鄰硝基芐醇、苯甲酰甲基和疊氮苯基等基團[69-72]。然而，由于需要使用具有較強光毒性的紫外光激活，嚴重限制了這些熒光探針在生物體系中的應(yīng)用。為了解決該問題，Xiao等人提出了一種通過單原子替換實現(xiàn)光開關(guān)的通用策略，即將硫代羰基中的硫原子在空氣中通過光誘導(dǎo)氧化作用替換成氧原子，從而實現(xiàn)熒光探針從熒光暗態(tài)到熒光亮態(tài)的轉(zhuǎn)變[31]（圖12（a），彩圖見期刊電子版）。

圖12 光開關(guān)熒光探針在脂滴PALM超分辨成像中的應(yīng)用。（a）具有熒光開關(guān)特性的有機熒光探針；（b）脂肪細胞中脂滴在寬場和PALM顯微鏡下的明場和雙色成像[31]Fig. 12 Applications of light-switchable fluorescent probes in PALM super-resolution imaging of lipid droplets. (a) The organic fluorescent probes with fluorescence ON/OFF characteristics; (b) bright field and two-color imaging of lipid droplets in adipocyte under wide-field and PALM microscopes[31]

利用這種策略得到的熒光探針可以通過可見光激活，避免了紫外光激活造成的光毒性。將熒光探針SNile Red用于寬場、微分干涉（DIC）以及PALM超分辨顯微鏡，如圖12（b）所示，在明場通道下，寬場顯微鏡不能清晰分辨脂肪細胞中的脂滴，微分干涉顯微鏡可以分辨出脂滴輪廓，PALM超分辨顯微鏡在此基礎(chǔ)上能給出更多的結(jié)構(gòu)細節(jié)，定位精度可達13 nm。搭配另外一種商用染料，還可以實現(xiàn)脂滴的雙色PALM超分辨成像。與寬場顯微鏡下的熒光圖像相比，分辨率實現(xiàn)了大幅度提升，熒光圖像更加清晰。

Xiao等人還提出了另一種實現(xiàn)熒光探針光開關(guān)的策略，即將熒光探針結(jié)構(gòu)中的肟基團通過光脫肟氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其羰基衍生物，從而實現(xiàn)熒光暗態(tài)到熒光亮態(tài)的轉(zhuǎn)變[32]。通過這種策略得到的熒光探針可以在活細胞共聚焦成像中靶向不同細胞器。在沒有細胞毒性添加劑的生理條件下，利用這些探針可以在較低的激活光功率下實現(xiàn)PALM超分辨成像。其中，細胞脂滴的PALM超分辨成像與傳統(tǒng)的寬場熒光成像相比，分辨率有顯著提升，定位精度可達55.7 nm。Xiao等人提出的上述兩種實現(xiàn)熒光探針光開關(guān)的策略為細胞脂滴PALM超分辨成像熒光探針的研制提供了獨特思路。

除此之外，BODIPY衍生物也可以用于基于單分子定位的超分辨成像。Adhikari等人利用BODIPY衍生物可以在基態(tài)瞬時形成二聚體導(dǎo)致發(fā)光紅移從而實現(xiàn)光開關(guān)的特性。通過單分子定位超分辨成像技術(shù)，在納米尺度實現(xiàn)了活細胞中脂滴、脂肪酸和溶酶體的超分辨成像[33]。熒光成像結(jié)果說明了在喂養(yǎng)和禁食狀態(tài)下酵母細胞中脂肪酸和中性脂質(zhì)不同的空間分布和流動性。這種BODIPY衍生物熒光探針還可以與其他熒光探針聯(lián)用實現(xiàn)多色熒光成像。

總之，PALM超分辨成像能夠?qū)崿F(xiàn)較高的空間分辨率和定位精度，尤其是使用有機小分子熒光探針時。但復(fù)雜的后處理過程使得PALM超分辨成像時間分辨率較低，在實時動態(tài)成像方面還有較大的提升空間。PALM超分辨成像的單分子定位原理還可以進一步與STED超分辨成像原理相結(jié)合，由此制得的MINFLUX超分辨顯微鏡能夠?qū)崿F(xiàn)1～3 nm分辨率的細胞結(jié)構(gòu)成像[73]，有望實現(xiàn)超分辨熒光顯微鏡應(yīng)用在生物成像領(lǐng)域的終極目標(biāo)。

2014年，3位物理學(xué)家之所以能夠獲得諾貝爾化學(xué)獎，是由于他們采取不同的光學(xué)成像方法結(jié)合與之相匹配的具有獨特?zé)晒庑再|(zhì)的化學(xué)熒光探針巧妙地繞過了衍射極限，用光學(xué)顯微鏡獲得了納米量級的成像分辨率。這些超分辨成像技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進了生命科學(xué)研究的發(fā)展，允許人們從微觀層次去尋找生命現(xiàn)象的本質(zhì)規(guī)律。表1總結(jié)了幾種不同成像方法的細胞脂滴的超分辨成像結(jié)果。

表1 文獻中報道的細胞脂滴超分辨成像結(jié)果總結(jié)Tab. 1 Summary of super-resolution imaging of cell lipid droplets reported in the literatures

5 總結(jié)與展望

STED、SIM和PALM技術(shù)允許人們在納米尺度上觀察脂滴分布，追蹤脂滴的生長、分解、運動和相互融合等動態(tài)過程，以及觀察脂滴與其它細胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和細胞核等的相互作用。這些研究極大地促進了脂滴細胞生物學(xué)的研究，讓人們對脂滴這一細胞器有了更深刻的認識。在這些超分辨成像技術(shù)中，STED超分辨成像可以提供較高的空間時間分辨率，但所使用的強損耗激光通常會對熒光探針造成嚴重的光漂白，因此需要熒光探針具有較高的光穩(wěn)定性。另外，STED超分辨成像還需要熒光探針在損耗激光波長處具有良好的受激發(fā)射損耗特性，且不會被損耗激光直接激發(fā)。SIM超分辨成像適用性較廣，對熒光探針沒有特殊要求，理論上普通熒光成像所使用的熒光探針即可用于SIM超分辨成像。但由于成像原理的限制，成像分辨率相比于傳統(tǒng)寬場顯微鏡只能提升一倍，達到100 nm左右。不過隨著SIM超分辨成像技術(shù)的不斷發(fā)展，SSIM、Hessian-SIM、GI-SIM以 及JSFR-SIM等新技術(shù)的出現(xiàn)可以進一步提升成像分辨率。PALM超分辨成像通過單分子定位原理，利用具有光開關(guān)特性的熒光探針可以實現(xiàn)很高的空間分辨率和定位精度，但復(fù)雜的成像后處理過程使得時間分辨率較低，在實時動態(tài)成像方面還具有較大的提升空間。為了實現(xiàn)高質(zhì)量的熒光成像，除了先進的熒光顯微鏡外，還離不開與之相匹配的光物理性質(zhì)獨特的熒光探針?？傮w來說，現(xiàn)有用于超分辨成像的脂滴熒光探針非常有限，且成像性能如分辨率、成像幀數(shù)等急需進一步提升。STED超分辨成像還面臨損耗激光過強導(dǎo)致的高光毒性問題；另外，還需要研制具有不同波段吸收和發(fā)射特性的熒光探針以滿足多色成像需求等。通過長時間、高分辨率觀測活細胞脂滴，有望解決細胞脂滴生物學(xué)的系列關(guān)鍵問題，如脂滴從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫落的過程、脂滴與線粒體之間的相互作用及能量代謝等。希望通過本文關(guān)于超分辨成像脂滴熒光探針的介紹與討論，吸引相關(guān)研究者們研制更多的新型熒光探針，早日揭開關(guān)于細胞脂滴的眾多謎團，促進脂滴細胞生物學(xué)走向更深層次的研究。