仿生皮膚電化學(xué)傳感器的構(gòu)建及其對雞蛋過敏原卵清蛋白的檢測

劉 兵，曹瀚文，蔣棟磊

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023）

在過去幾十年間，雖然食品安全的重視程度不斷提高，但食品安全事件卻依然層出不窮[1]。食物過敏是人體對食品中的抗原物質(zhì)產(chǎn)生的、由免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的不良反應(yīng)，可分為4種類型：IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)、II型毒性超敏反應(yīng)、III型免疫復(fù)合物超敏反應(yīng)和T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性過敏反應(yīng)[2]，其中IgE介導(dǎo)的食物過敏發(fā)病快，易觸發(fā)，是更常見的類型[3-4]。目前，食物過敏的發(fā)病率正逐年上升，且呈現(xiàn)出工業(yè)化地區(qū)人口的發(fā)病率高于其他地區(qū)、兒童發(fā)病率普遍高于成人的特點(diǎn)，約有8%的兒童和5%的成人對食物有過敏癥狀，部分地區(qū)食品過敏患者的比例已高達(dá)10%[5]。已被確定含有過敏原的食品高達(dá)170余種且因地理或個(gè)體因素而有差異，但就種類而言，日常生活中常見的食物過敏原主要有雞蛋、牛奶、花生、堅(jiān)果、魚蝦、貝類、小麥和大豆8種[6]。對于與食物過敏緊密相關(guān)的公眾來說，難以避免攝入含有過敏原的食物[7]，并且目前暫無有效的、標(biāo)準(zhǔn)化的食品過敏疾病的根治手段，盡量避免食用過敏原仍然是保護(hù)過敏人群健康的唯一途徑[8]，這就突出了過敏原檢測技術(shù)的重要地位。

常規(guī)的過敏原檢測方法有：1）免疫學(xué)檢測技術(shù)，例如酶聯(lián)免疫吸附測定、蛋白質(zhì)印跡分析等[9-10]。盡管基于免疫的檢測方法靈敏度和效率高，但需要高度純化和穩(wěn)定的蛋白樣品，同時(shí)操作復(fù)雜、檢測時(shí)間長、重復(fù)性差等缺陷限制了其應(yīng)用[11]，因此，該類方法并非快速檢測食物過敏原的最佳選擇。2）分析生物學(xué)檢測方法，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等[12-13]。此類方法檢測的目標(biāo)物主要是特定的DNA片段，而非特定的致敏蛋白質(zhì)。3）色譜檢測方法，例如高效液相色譜、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等[14]。由于其高效、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，至今仍在傳統(tǒng)檢測方法中占據(jù)主要地位，但對實(shí)驗(yàn)室的高要求（昂貴笨重的設(shè)備）限制了其在即時(shí)、現(xiàn)場檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。

作為一項(xiàng)多學(xué)科交叉的技術(shù)，電化學(xué)生物傳感技術(shù)因其具有響應(yīng)時(shí)間快、高靈敏度、高選擇性等突出特點(diǎn)，已然成為食物過敏原檢測的研究前沿和熱點(diǎn)[15]。將生物元件固定在電極表面可以識別目標(biāo)物體，并通過將生物元件的識別信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字電信號觸發(fā)化學(xué)反應(yīng)[16]，然后對檢測樣品進(jìn)行定量或半定量分析。更為重要的是，電化學(xué)檢測技術(shù)能夠滿足現(xiàn)場化、簡便化、實(shí)時(shí)監(jiān)測的需求，很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測方法的缺陷。根據(jù)固定在電極表面的生物識別分子的不同，電化學(xué)生物傳感器可分為免疫傳感器、核酸傳感器和細(xì)胞傳感器，其中細(xì)胞傳感器可以提供更全面、更復(fù)雜的信息（如凋亡、生長因子分泌、蛋白質(zhì)合成等）。許多研究也表明可將肥大細(xì)胞作為識別元件，通過不同的固定方式固定在不同電極表面進(jìn)行過敏原的檢測[17-20]。但如若能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞在三維空間的排布，便可以更加真實(shí)地反應(yīng)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞間的相互作用，模擬過敏原進(jìn)入人體后的真實(shí)反應(yīng)，從而達(dá)到仿生的水平。生物3D打印技術(shù)為這一想法提供了合適的選擇。生物3D打印特指操縱活細(xì)胞打印活性三維結(jié)構(gòu)的過程，即載細(xì)胞打印，也可稱為細(xì)胞打印[21]。將細(xì)胞作為原料混合水凝膠制備成生物墨水進(jìn)行3D打印，不僅可以精確分配負(fù)載細(xì)胞的生物材料從而用于復(fù)雜三維功能活組織或人工器官的構(gòu)建，還可以借助細(xì)胞這一有趣的生物識別元件打印組織結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)三維組織檢測和真實(shí)仿生傳感，從而拓寬仿生傳感器的應(yīng)用范圍。

因此，本研究通過導(dǎo)電水凝膠包裹細(xì)胞配制成生物墨水，利用生物3D打印技術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)新一代仿生皮膚傳感器的開發(fā)，可用于雞蛋過敏原卵清蛋白的快速檢測。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有望為食物過敏原的檢測和評價(jià)提供新思路，為進(jìn)一步開發(fā)微組織傳感器提供新的策略和理論研究，為實(shí)現(xiàn)傳感檢測機(jī)理從細(xì)胞水平向組織層面的轉(zhuǎn)變提供一定指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

30%、60%、90%接枝率的甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacryloyl，GelMA） 蘇州永沁泉智能設(shè)備公司；大鼠嗜堿性白血病（RBL-2H3）細(xì)胞、皮膚組織成纖維細(xì)胞 中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）。

卵清蛋白、卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；聚吡咯（polypyrrole，PPy） 南京先鋒納米科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素 美國Gibco實(shí)驗(yàn)室；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS） 碧云天生物科技有限公司（中國上海）；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為分析級。

1.2 儀器與設(shè)備

PalmSens4電化學(xué)工作站 荷蘭PalmSens公司；EFL-8601光固化打印機(jī) 蘇州永沁泉智能設(shè)備公司；LSM 800共聚焦顯微鏡 德國Carl Zeiss公司；Pharos G2掃描電子顯微鏡 荷蘭飛納公司；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 生物墨水的制備

用于構(gòu)建仿生皮膚微組織的3D打印生物墨水采用導(dǎo)電水凝膠包裹細(xì)胞的形式進(jìn)行制備。

GelMA導(dǎo)電水凝膠的配制：將1 g GelMA、25 mg光引發(fā)劑、5 mg光吸收劑、10 mL PBS，均放置于15 mL棕色離心管中；在50 ℃條件下水浴加熱30 min直至完全溶解。溶液經(jīng)0.22 μm無菌微孔膜過濾到一個(gè)新的棕色小瓶中，得到水凝膠前驅(qū)液。將一定濃度PPy加入水凝膠前驅(qū)液中，超聲15 min，制備得到導(dǎo)電水凝膠。

最后將消化后的細(xì)胞懸浮液接種到上述GelMA導(dǎo)電水凝膠中制備成生物墨水。

1.3.2 生物墨水的表征及優(yōu)化

1.3.2.1 流變測試

將凝膠前驅(qū)液放在流變儀的中心，選用直徑25 mm的壓板，板間距為1 mm，在掃描60 s時(shí)，固化光線照射。應(yīng)變1%，角速率5 rad/s，輻照光源405 nm，30 mW/cm2，30 s；測試溫度（25±1）℃，時(shí)間300 s。

1.3.2.2 PPy濃度優(yōu)化

對不同PPy摻雜量的水凝膠通過電化學(xué)手段差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）進(jìn)行優(yōu)化。DPV在以下條件下進(jìn)行：初始電位-0.2 V；最終電位0.5 V；掃描速率30 mV/s；脈沖電位25 mV；脈沖時(shí)間0.10 s；脈搏周期500 ms。

1.3.2.3 打印參數(shù)的確定

打印參數(shù)如下：基層層數(shù)為80；印刷層高度為100 μm；光強(qiáng)為15 mW/cm2；基底曝光時(shí)間為15 s；層片曝光時(shí)間為12 s；z軸移動速率為20 mm/min；剝離距離為3 mm；剝皮速率為25 mm/min；脫皮恢復(fù)速率為200 mm/min；印刷料槽溫度為32 ℃。

1.3.3 三維多層皮膚組織模型構(gòu)建

模擬人體皮膚組織的尺寸和結(jié)構(gòu)，采用三維建模軟件3D Bulider設(shè)計(jì)體外多層皮膚組織模型。首先，皮膚模型由不同細(xì)胞在不同組織結(jié)構(gòu)構(gòu)成，致密的上層結(jié)構(gòu)充當(dāng)皮膚的表皮層，包含成纖維細(xì)胞。網(wǎng)格狀的雙層結(jié)構(gòu)充當(dāng)皮膚的皮下組織，包含肥大細(xì)胞。為了結(jié)合電化學(xué)傳感平臺，皮膚模型設(shè)計(jì)為可與工作電極區(qū)域面積相匹配的尺寸。模型的總尺寸為（7.48×4.84×1.8） mm3，表皮層高度為0.6 mm，皮下組織的高度為1.2 mm，孔徑440 μm。

1.3.4 生物3D打印制備皮膚模型

仿生皮膚模型的構(gòu)建工作主要有以下3 個(gè)方面：仿生皮膚建模、打印材料合成、工藝參數(shù)優(yōu)化。簡單來說，仿生皮膚結(jié)構(gòu)通過基于DLP的3D打印機(jī)制造，特定設(shè)計(jì)程序遵循以下步驟，并以STL文件保存，打印是通過重復(fù)的過程，將圖像投射到水凝膠中，然后抬高z軸。打印過程：首先，2種類型生物墨水的細(xì)胞（RBL和皮膚組織成纖維細(xì)胞）在同一個(gè)細(xì)胞密度1×106cells/mL，分別均勻混合在生物墨水中。一旦上層完成，就會有一個(gè)停頓，使用另一個(gè)含有生物墨水的容器（RBL-2H3），在空間上排布打印槽內(nèi)裝載的不同細(xì)胞以產(chǎn)生信號級聯(lián)，然后完成打印過程。

1.3.5 仿生皮膚電化學(xué)傳感系統(tǒng)的建立

將制備的含有細(xì)胞的生物墨水置于光固化3D打印機(jī)的打印槽中。導(dǎo)入建模文件并根據(jù)調(diào)試后的打印參數(shù)對皮膚模型進(jìn)行切片和打印，打印工作時(shí)間為9 min，可同時(shí)打印數(shù)十個(gè)傳感元件。然后以生物打印皮膚組織為識別元件，采用柔性叉指電極作為傳感接口承載仿生皮膚模型，相比較于傳統(tǒng)絲網(wǎng)印刷電極，該柔性電極具有較大的工作電極區(qū)域且能與皮膚組織較好地匹配。在暴露的工作電極區(qū)域覆蓋仿生皮膚結(jié)構(gòu)后，連接PalmSens4便攜式電化學(xué)工作站，基于皮膚模型的電化學(xué)傳感器已被制備。

1.3.6 電化學(xué)傳感系統(tǒng)的表征

接通PalmSens4電化學(xué)工作站，采用循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）、DPV對仿生皮膚傳感的電化學(xué)行為測試。CV在以下條件進(jìn)行：初始電位-0.3 V；最終電位0.6 V；掃描速率100 mV/s。DPV條件：初始電位-0.2 V；最終電位0.5 V；掃描速率100 mV/s；脈沖電位25 mV；脈沖時(shí)間0.10 s。

電化學(xué)測試均在室溫中進(jìn)行，采用Ps trace模擬軟件進(jìn)行分析，電解液為含有3.0 mmol/L鐵氰化鉀電解液。

1.3.7 雞蛋過敏原卵清蛋白的電化學(xué)檢測

首先將打印好的皮膚結(jié)構(gòu)用0.1 mol/L PBS（pH 7.4）沖洗3 次以去除未交聯(lián)的水凝膠。然后，精準(zhǔn)放置皮膚結(jié)構(gòu)于電極上，滴入卵清蛋白引誘RBL細(xì)胞脫粒（37 ℃孵育30 min）。在0.1～106Hz頻率范圍內(nèi)，利用電化學(xué)阻抗法測定不同濃度卵清蛋白的阻抗圖譜。電化學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

1.3.8 電化學(xué)傳感器的特異性、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為了評估該傳感器的特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性，采用制備的傳感器檢測含有一些共存的物種，將傳感器對卵清蛋白的響應(yīng)信號與其他共存物種的信號進(jìn)行比較，以確定仿生皮膚微組織電化學(xué)傳感器的特異性。選取每組3 個(gè)、共5 組仿生界面，在37 ℃、RPMI 1640培養(yǎng)基條件下分別存儲0、3、6、9、12 h后檢測峰值電流。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和Origin 8.0進(jìn)行作圖，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次以上平行，數(shù)據(jù)表示為。差異顯著水平采用t檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著，P＜0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳感器的結(jié)構(gòu)和工作原理

圖1 仿生皮膚電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過程Fig. 1 Schematic diagram of the preparation of the bionic skin electrochemical sensor

引入生物3D打印技術(shù)可升級改造傳統(tǒng)的凝膠包裹細(xì)胞方法[22]。模擬食物過敏靶器官或組織，通過調(diào)整皮膚模型的尺寸和結(jié)構(gòu)，利用生物3D打印技術(shù)制備仿生皮膚結(jié)構(gòu)。在使用免疫細(xì)胞（肥大細(xì)胞）的基礎(chǔ)上，添加成纖維細(xì)胞，共同構(gòu)建皮膚組織，從關(guān)注結(jié)構(gòu)成形的“形似”，過渡到注重生物功能形成的“神似”。內(nèi)因：肥大細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的相互作用較重要，成纖維細(xì)胞可支持肥大細(xì)胞成熟表型；外因：單純細(xì)胞系模型雖然簡單易用，但單層分散的細(xì)胞缺乏細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，且在體外培養(yǎng)中容易丟失細(xì)胞的異質(zhì)性和內(nèi)在特征，從而無法真正反映機(jī)體內(nèi)復(fù)雜的三維環(huán)境及重現(xiàn)組織功能[23]。如圖1所示，為了提高傳感器的靈敏度，在GelMA凝膠的基礎(chǔ)上，使用PPy制備導(dǎo)電水凝膠。導(dǎo)電生物墨水用于高通量打印皮膚模型結(jié)構(gòu)，并將其固定在叉指工作電極區(qū)。皮膚結(jié)構(gòu)用作識別元件識別卵清蛋白，使肥大細(xì)胞脫粒，然后利用電化學(xué)工作站將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為電信號（如電流、阻抗等）。

2.2 導(dǎo)電水凝膠的制備及其表征優(yōu)化

2.2.1 GelMA水凝膠固化過程中的模量分析

圖2 30%、60%、90%接枝率的GelMA流變測試Fig. 2 Rheological test of GelMA with graft rates of 30%, 60% and 90%

為了成功構(gòu)建仿生皮膚微組織，需要選擇合適接枝率的水凝膠用于3D打印，已有研究證實(shí)生物墨水的流變行為對打印性能起至關(guān)重要的作用[24]，特別是水凝膠的黏彈性，低黏度的水凝膠會導(dǎo)致凝膠前驅(qū)液擴(kuò)散，從而降低形狀的保真度和力學(xué)性能[25]。此外，封裝在低黏度生物墨水中的細(xì)胞有快速沉積傾向，在印刷材料中無法做到均勻分布。也就是說，凝膠的剛度和彈性已被證明對3D仿生組織中的細(xì)胞行為有深遠(yuǎn)影響，而正確地調(diào)整這些力學(xué)性能對培養(yǎng)的成功至關(guān)重要[26]。選用10 g/100 mL不同接枝率（30%、60%、90%）的GelMA，進(jìn)行凝膠固化分析。如圖2所示，剛開始，前驅(qū)液的損耗模量（G’’）遠(yuǎn)大于儲能模量（G’）時(shí)，材料主要發(fā)生黏性形變，呈液態(tài)。在1 min后開啟405 nm光源照射后，儲能模量逐漸增大，官能團(tuán)單體聚合，開始交聯(lián)，黏度突增。在90 s時(shí)儲能模量和損耗模量趨于穩(wěn)定，且儲能模量均高于損耗模量，流體表現(xiàn)為固體?？紤]到后續(xù)皮膚模型的構(gòu)建，在外界光照條件下可以更好地實(shí)現(xiàn)凝膠化，有利于微組織的成形，篩選60%、90%接枝率的GelMA水凝膠進(jìn)行下一步的優(yōu)化及后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 GelMA水凝膠的電化學(xué)性能分析及PPy濃度優(yōu)化

圖3 不同接枝率GelMA的電化學(xué)性能表征Fig. 3 Electrochemical properties of GelMA with different grafting rates

水凝膠的電化學(xué)性能對傳感器的檢測性能尤為重要，因此利用穩(wěn)定的三電極電化學(xué)系統(tǒng)對不同接枝率的GelMA進(jìn)行電化學(xué)性能分析。如圖3A、B所示，不同接枝率的GelMA均表現(xiàn)了微弱的氧化還原峰，且從DPV圖看，凝膠具有可忽略的導(dǎo)電能力，導(dǎo)電性GelMA 30＞GelMA 60＞GelMA 90，GelMA 60相比較于GelMA 90，導(dǎo)電性能有了明顯的增加。因此，結(jié)合2.2.1節(jié)水凝膠的固化模量，在保證微組織成形的基礎(chǔ)上同時(shí)兼顧傳感器電化學(xué)檢測的靈敏性，最終選取60%接枝率的GelMA 用于后續(xù)導(dǎo)電水凝膠的制備。

為了提高傳感器的靈敏度，需要在60%接枝率的GelMA中添加導(dǎo)電材料以增強(qiáng)其導(dǎo)電性，但導(dǎo)電材料的添加濃度嚴(yán)重影響著電化學(xué)傳感器的分析性能。為確定PPy材料的最佳添加量，采用電化學(xué)方法（DPV）進(jìn)行優(yōu)化。如圖3C所示，PPy質(zhì)量濃度在2.0～3.5 mg/mL，電流峰值從7.87 μA增加到21.18 μA，表明PPy具有顯著的電信號放大功能，摻雜較高質(zhì)量濃度的PPy能有效提高生物墨水的導(dǎo)電性，工作電極表面的活性位點(diǎn)數(shù)量增加，加速了電子轉(zhuǎn)移。但3.5 mg/mL的PPy/GelMA會在一定程度上干擾皮膚模型的打印，會造成同批次之間樣品的形狀形成較大的殘次。因此，確定PPy質(zhì)量濃度3.0 mg/mL適用于之后的生物墨水制備工作。

2.2.3 PPy/GelMA導(dǎo)電凝膠及生物墨水的微觀形態(tài)

圖4 GelMA、PPy、GelMA/PPy和生物墨水電鏡圖Fig. 4 SEM images of GelMA hydrogel, polypyrrole,GelMA/PPy, and bio-ink

采用掃描電鏡、冷凍電鏡分別對單純GelMA、PPy和兩者復(fù)合物的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。圖4A顯示了GelMA凝膠的微觀表觀形態(tài)，大小不一的孔洞狀結(jié)構(gòu)共同組成凝膠形態(tài)，且凝膠孔徑內(nèi)表面較為光滑。圖4B顯示，由于微納米孔的存在使水凝膠具備三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有利于與外界的氣質(zhì)交換和保持溶液的進(jìn)出通道，且這些孔增加了凝膠的表面積并允許其捕獲更多的水，使材料對所施加的電荷快速反應(yīng)。由圖4C所示，PPy的大小約為600 nm，由此制備的導(dǎo)電水凝膠提供了良好的物理組合，有助于皮膚模型的構(gòu)建。圖4D顯示了摻雜PPy的GelMA，GelMA/PPy內(nèi)表面被PPy成功覆蓋，表面呈現(xiàn)出PPy所具有的粗糙狀態(tài)，這可能是因?yàn)樾纬傻腉elMA/PPy比GelMA具有更高機(jī)械強(qiáng)度，PPy形成互穿網(wǎng)絡(luò)嵌入水凝膠中而提高導(dǎo)電能力[27]。

圖4E可以看到，這種獨(dú)特的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使水凝膠柔軟而濕潤，并且水凝膠內(nèi)部的大量水可以為細(xì)胞提供生物相容且適宜的環(huán)境[28]。如圖4F所示，由于使用的GelMA分子含有利于細(xì)胞黏附的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，可以看到細(xì)胞被黏附在明膠材料上，有助于細(xì)胞在培養(yǎng)中保持較好的功能性。有序的孔隙結(jié)構(gòu)保證了內(nèi)部的營養(yǎng)物質(zhì)傳輸及細(xì)胞代謝廢物的排除。

2.3 生物3D打印仿生皮膚結(jié)構(gòu)及其表征

圖5 皮膚模型建模圖和生物3D打印實(shí)際產(chǎn)品及其液體交換能力測試Fig. 5 Modeling diagram of the skin model, 3D bioprinted products and liquid exchange capacity test

圖5A顯示，該仿生皮膚結(jié)構(gòu)可分為2 個(gè)部分，致密的上層結(jié)構(gòu)（600 μm）可充當(dāng)皮膚的表皮層，有利于保護(hù)傷口免受外界的機(jī)械沖擊和壓力。相比之下，下層的皮下組織（1.2 mm）設(shè)計(jì)成懸臂梁結(jié)構(gòu)，管狀的網(wǎng)絡(luò)的真皮結(jié)構(gòu)在液面下培養(yǎng)時(shí)促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的輸送和代謝產(chǎn)物排出，從而促進(jìn)新生血管形成[29-30]。在顯微鏡下進(jìn)一步觀察微通道為440 μm的微觀結(jié)構(gòu)，確認(rèn)與設(shè)計(jì)一致。

為了進(jìn)一步確認(rèn)下層的互聯(lián)結(jié)構(gòu)，使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了懸臂梁結(jié)構(gòu)，如圖5B所示，三維懸臂梁結(jié)構(gòu)以高保真度清晰可見。將打印完成的皮膚組織用培養(yǎng)基輕輕沖洗3 遍后加入含有10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基浸沒培養(yǎng)30 min后，皮膚組織變成紅色，說明該組織具有優(yōu)異的液體交換能力（圖5C）。

2.4 仿生皮膚傳感器的電化學(xué)表征

圖6 傳感器的電化學(xué)表征Fig. 6 Electrochemical characterization of the sensor

采用CV和DPV對仿生皮膚傳感器的不同修飾步驟進(jìn)行電化學(xué)表征，如圖6所示，CV圖中插圖顯示了在裸叉指電極表面上的典型和可逆的氧化還原峰。當(dāng)工作電極上放置純GelMA打印的皮膚結(jié)構(gòu)時(shí)，氧化還原峰值變小，這說明此結(jié)構(gòu)對電化學(xué)過程形成了屏障，阻止氧化還原探針進(jìn)入電極表面。隨著PPy的添加，氧化還原峰值有一定程度的恢復(fù)，顯示出導(dǎo)電水凝膠具備一定的導(dǎo)電性。當(dāng)測量仿生皮膚組織的電信號時(shí)，可以看到峰值電流明顯下降，細(xì)胞的添加影響皮膚本身的電阻，該結(jié)果可能是由細(xì)胞黏附引起，進(jìn)而阻礙電子傳遞，導(dǎo)致電子傳輸速率變低，增加了電極的電阻。類似的信號變化如圖6B所示，沒有添加導(dǎo)電的材料的峰值電流為5.61 μA，在添加了PPy納米復(fù)合材料之后，峰值明顯增加，為19.40 μA，這表明填加了PPy納米材料可以顯著提高該皮膚組織的導(dǎo)電性能，有利于提高靈敏度。當(dāng)添加細(xì)胞后，峰值電流降低，Ip值大約為14.94 μA。當(dāng)細(xì)胞固定在以GelMA為主，添加了PPy納米材料的生物墨水打印的仿生皮膚時(shí)，可以為此提供生物相容、三維微納米環(huán)境，電化學(xué)表征結(jié)果表明，該皮膚模型具備優(yōu)異的電化學(xué)響應(yīng)。

2.5 仿生皮膚電化學(xué)傳感器對卵清蛋白的檢測

如圖7A所示，隨著卵清蛋白質(zhì)量濃度的上升（0.5～2.5 μg/mL），工作電極表面的阻抗值（Ret）迅速增加，Nyqusit曲線半圓的直徑增大，這說明較低質(zhì)量濃度卵清蛋白刺激細(xì)胞發(fā)生脫顆粒，釋放胞內(nèi)各種介質(zhì)如組胺、類胰蛋白酶和β-己糖胺酶等，這些因子會阻礙電子轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致Ret增加。圖7B顯示了通過實(shí)驗(yàn)獲得的卵清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢钥吹诫娀瘜W(xué)阻抗Ret對卵清蛋白的質(zhì)量濃度良好響應(yīng)，線性范圍為0.5～2.5 μg/mL，線性方程為y=4.45C+14.24，相關(guān)系數(shù)為0.998，根據(jù)公式檢出限=3s/k計(jì)算出檢出限為0.19 μg/mL，其中s表示空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差（k=3），k表示卵清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，所構(gòu)建的電化學(xué)細(xì)胞傳感器能夠準(zhǔn)確靈敏地檢測卵清蛋白質(zhì)量濃度。

圖7 不同質(zhì)量濃度卵清蛋白的電化學(xué)檢測Fig. 7 Electrochemical detection of different concentrations of ovalbumin

2.6 仿生皮膚傳感器的特異性、重復(fù)性及穩(wěn)定性

表1 1.0 μg/mL卵清蛋白分別在1.0 μg/mL干擾物下對傳感器的相對響應(yīng)Table 1 Response of the sensor to 1.0 μg/mL ovalbumin in the presence of interferences (1.0 μg/mL)

特異性是構(gòu)建傳感器的關(guān)鍵指標(biāo)。以花生過敏原Ara h 1、醇溶蛋白、大豆球蛋白、蝦原肌球蛋白和牛血清白蛋白為干擾物，分別比較電化學(xué)傳感器的響應(yīng)來評價(jià)細(xì)胞傳感器的特異性。如表1所示，相同濃度物種的阻抗比（Ret樣品/Ret對照）無明顯變化，說明本研究所構(gòu)建的電化學(xué)細(xì)胞傳感器具有良好的特異性。

圖8 電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性及重復(fù)性Fig. 8 Stability and repeatability of the electrochemical sensor

穩(wěn)定性和重復(fù)性是評價(jià)細(xì)胞傳感器性能的重要指標(biāo)。但細(xì)胞保存的條件較為苛刻，難以在外部環(huán)境長期保持良好的細(xì)胞活性，這對細(xì)胞傳感器的穩(wěn)定性是一個(gè)挑戰(zhàn)。而利用生物3D打印技術(shù)可以達(dá)到仿生微組織的快速、規(guī)?；a(chǎn)，在檢測前短時(shí)間內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)仿生微組織傳感器的構(gòu)建，從而達(dá)到快速、現(xiàn)場檢測的要求，這就縮短了細(xì)胞傳感器需要保存的時(shí)間，降低了對貨架期的要求。因此，選取5 組仿生界面貯存在37 ℃、RPMI 1640培養(yǎng)基條件下，時(shí)間間隔為3 h檢測峰值電流。如圖8所示，峰值電流在18.8～19.2 μA范圍內(nèi)（低于5%），說明該傳感器具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

利用生物3D打印技術(shù)進(jìn)行含有表皮層和皮下組織的仿生皮膚結(jié)構(gòu)的制備，成功開發(fā)一種仿生皮膚傳感界面，并將其應(yīng)用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建。使用3D Builder軟件對仿生皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維建模，致密上層結(jié)構(gòu)充當(dāng)表皮層，管狀的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)充當(dāng)皮下組織。模型的總尺寸為（7.48×4.84×1.8）mm3，表皮層高度為0.6 mm，皮下組織的高度為1.2 mm，孔徑440 μm。同時(shí)選取3.0 mg/mL PPy修飾GelMA以提高仿生皮膚導(dǎo)電性，結(jié)合叉指電極組建傳感器對雞蛋卵清蛋白進(jìn)行電化學(xué)分析。檢測結(jié)果表明，在卵清蛋白質(zhì)量濃度在0.5～2.5 μg/mL范圍內(nèi)，Ret與蛋白質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，驗(yàn)證了該仿生皮膚傳感器檢測卵清蛋白的可行性。使用3D生物打印技術(shù)可以縮短細(xì)胞傳感器的構(gòu)建時(shí)間，降低制備成本，可滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的需求。