人EGFL7真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞系的建立

丁 悅，黃為民，唐麗君

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院新生兒科，廣東 廣州 510515）

支氣管肺發(fā)育不良（broncho-pulmonary dysplasia，BPD）是極低出生體重兒長期氧療、機(jī)械通氣常見的肺部并發(fā)癥，有較高的致殘率及死亡率[1]，存活兒常遺留肺功能損傷及神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]，是早產(chǎn)極低體重兒并發(fā)癥中救治耗費(fèi)最高的疾病。隨著肺表面活性物質(zhì)及無創(chuàng)呼吸機(jī)等的應(yīng)用[3-4]，BPD在病理特征表現(xiàn)上，以肺泡以及肺微血管不良發(fā)育為基礎(chǔ)[5]。調(diào)控肺血管發(fā)育的生長因子紊亂可導(dǎo)致肺血管發(fā)育受阻進(jìn)而影響肺泡正常發(fā)育。人類表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7（EGFL7）是一種血管內(nèi)皮特異分泌的新型蛋白，在高氧致新生大鼠BPD中表達(dá)下調(diào)，有可能對BPD的發(fā)生發(fā)展有影響[6]?；诖耍狙芯拷⑨槍θ说恼婧吮磉_(dá)EGFL7的載體，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步評價該載體是否能穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞系，從而為探究EGFL7對BPD的影響提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料EA.hy926細(xì)胞購自廣州勵德生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gibco公司；質(zhì)粒提取試劑盒、G418購自美國invitrogen公司；DNA凝膠回收試劑盒購自美國OMEGA公司；免抗人EGFL7多克隆抗體購自美國santa cruz公司；β-actin抗體購于美國Affinity公司；實時熒光定量PCR（RT-PCR）試劑盒購于QIAGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR擴(kuò)增mTSARG3基因開放閱讀框設(shè)計EGFL7引物，擴(kuò)增含EGFL7開放閱讀框的822bp序列，瓊脂糖凝膠通過電泳儀（美國伯樂公司，型號：164-5050）進(jìn)行電泳，然后對收回后的膠進(jìn)行分析。

1.2.2 pEGFP-N1-EGFL7重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定利用HindⅢ以及BamHI對已經(jīng)純化后的PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將其轉(zhuǎn)化成為E coli DH5ɑ的感受態(tài)細(xì)菌，借助藥物篩選后以獲得顯示為陽性的克隆，通過PCR擴(kuò)增并進(jìn)一步雙酶切鑒定獲得的陽性克隆，在進(jìn)行測序后就可以具體對載體命名為pEGFP-N1-EGFL7。

1.2.3 pEGFP-N1-EGFL7在EA.hy26細(xì)胞系中的瞬時轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞融合至80%～90%時，將pEGFP-N1-EGFL7質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)儀（日本BEX公司，型號：BEX系列CUY21EDIT Ⅱ型）轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.4 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人EGFL7的EA.hy926細(xì)胞系篩選G418濃度即細(xì)胞全部死亡的最低濃度（500 μg/mL）。EA.hy926細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，改含G418的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，從中篩選出克隆物質(zhì)，為獲得單克隆的細(xì)胞系對上述克隆物進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。將pEGFP-N1空白質(zhì)粒導(dǎo)入EA.hy926細(xì)胞中，并將此細(xì)胞作為陰性對照組。

1.2.5 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中EGFL7基因使用Trizol試劑盒進(jìn)行RNA提取，利用微量分光光度法測定RNA含量及純度。利用瓊脂糖凝膠電泳的檢測方式，對18S RNA、28S RNA進(jìn)行測定，測定的內(nèi)容主要是證實RNA序列完整性。借助逆轉(zhuǎn)錄的方式，合成cDNA的第一鏈，利用這種參考模板做熒光定量RT-PCR工作。實時（Real-time）PCR數(shù)據(jù)采用2-△CT相對定量方法處理。

1.2.6 免疫印跡法（WB）鑒定EGFL7蛋白表達(dá)總蛋白加入到10 μL的5 × 樣品緩沖液（比例為4∶1），煮沸后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，50 g.L-1 BSA室溫封閉2 h后加入EGFL7抗體（稀釋濃度為l∶400），4 ℃冷庫孵育過夜，用含TwEEN20的TBST在搖床上充分洗滌PVDF膜，每次10 min，前后共3次。然后加入經(jīng)l∶10 000稀釋的二抗，將稀釋好的二抗置入22 ℃～26 ℃室溫下，搖床上持續(xù)搖晃約60 min，借助TBST洗滌PVDF膜3次，利用電化學(xué)發(fā)光法測定并且做顯色處理，之后針對結(jié)果予以吸光度的掃描檢查。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)檢驗，兩樣本間比較采用t檢驗；兩樣本以上之間的比較，則檢驗方差是否齊性，若方差齊性，則采用方差分析，組內(nèi)多重間比較行LSD檢驗，反之則用Welch檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴(kuò)增mTSARG3基因開放閱讀框結(jié)果從臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的cDNA文庫中擴(kuò)增EGFL7的開放閱讀框，電泳分析瓊脂糖凝膠發(fā)現(xiàn)：819bp為基因片段的大小，這一結(jié)果與預(yù)期的基本一致，見圖1。

圖1 泳道M：DL1kb DNA Marker

2.2 pEGFP-N1-EGFL7重組質(zhì)粒雙酶切及測序鑒定pEGFP-N1-EGFL7重組質(zhì)粒1、2借助雙酶切下7kd左右、819bp左右條帶（圖2），經(jīng)測序后證實DNA序列與GenBank中EGFL7序列一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 泳道M：1kb DNA 梯度標(biāo)志

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定

2.3.1 RT-PCR檢測EGFL7mRNA設(shè)對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的EA.hy926細(xì)胞EGFL7mRNA相對表達(dá)量（relativequantity，RQ）為l，N1-EA.hy926和hEGFL7-EA.hy926兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.975，P=0.028），見表1。

表1 不同細(xì)胞組間EGFL7mRNA的比較( ±s)

表1 不同細(xì)胞組間EGFL7mRNA的比較( ±s)

組別 例數(shù) 2△△CT值 t值 P值N1-EA.hy926 3 1.0124±0.0472 -5.975 0.028 hEGFL7-EA.hy926 3 8.6167±2.2337

2.3.2 WB檢測EGFL7蛋白量hEGFL7-EA.hy926組EGFL7蛋白量明顯高于空白對照組和N1-EA.hy926組，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)方法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖3、表2。

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的EA.hy926蛋白表達(dá)

表2 不同細(xì)胞組間EGFL7蛋白表達(dá)量的比較( ±s)

表2 不同細(xì)胞組間EGFL7蛋白表達(dá)量的比較( ±s)

注：方差齊（P=0.107），故采用方差分析，組內(nèi)多重比較采用LSD法，EA.hy926與N1-EA.hy926兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.051）；hEGFL7-EA.hy926組明顯高于EA.hy926組和N1-EA.hy926組（P＜0.001）。

組別 例數(shù) Density ratio F值 P值EA.hy926 3 0.6961±0.095 409.578＜0.001 N1-EA.hy926 3 0.8467±0.0181 hEGFL7-EA.hy926 3 2.2980±0.0878

3 討論

BPD是早產(chǎn)兒比較嚴(yán)重的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，可導(dǎo)致患兒長時間脫氧困難，對肺部及氣道造成持續(xù)的慢性損傷，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺動脈高壓甚至死亡[1]。即使存活，后期可能因感染或哮喘等原因反復(fù)住院從而導(dǎo)致預(yù)防不良。BPD的確切病因及機(jī)制尚未明確。因此，迫切需了解BPD的發(fā)生機(jī)制從而尋求有效的防治措施減少早產(chǎn)兒BPD發(fā)生率。肺血管發(fā)育紊亂及肺泡化阻滯是BPD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件。既往學(xué)者們關(guān)注的主要領(lǐng)域是肺泡化損傷，但對BPD的預(yù)防及治療并未取得明顯成效。近年來認(rèn)為BPD是由于肺微血管發(fā)育不良導(dǎo)致肺泡發(fā)育異常的“血管發(fā)育障礙假說”[7]。因此，目前認(rèn)為肺血管分泌的多種因子在肺微血管和肺泡正常發(fā)育中起重要作用。探索血管生長因子在BPD中的作用可望為BPD的防治開辟新的途徑。EGFL7是新近發(fā)現(xiàn)的在肺血管形成和生成的過程中均起重要作用的蛋白，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，通過自主分泌或者旁邊組織分泌刺激血管生成[8]。EGFL7可以抑制平滑肌細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、黏附、增殖在正常血管管腔形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9]。EGFL7敲除小鼠會出現(xiàn)外周出血、循環(huán)發(fā)育缺陷[10]。EGFL7過表達(dá)則導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)異常及血管穩(wěn)態(tài)受損[9]。這提示EGFL7是血管發(fā)育中的關(guān)鍵蛋白，其是否參與了BPD的發(fā)病過程，國內(nèi)外報道較少。

我們從人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中獲得擴(kuò)增EGFL7的ORF，經(jīng)過雙酶切將其克隆到pEGFP-N1中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-EGFL7。利用電穿孔法最終建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的EA.hy926細(xì)胞系。使用RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測EGFL7在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EA.hy926細(xì)胞系中的基因及蛋白水平。這一結(jié)果顯示：研究成功地建立了穩(wěn)定整合pEGFP-N1-EGFL7載體的EA.hy926細(xì)胞系。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：新生鼠在60%的氧氣中持續(xù)暴露14 d可以模擬BPD的發(fā)生發(fā)展過程，通過建立此模型我們觀察到肺部EGFL7基因和蛋白表達(dá)水平明顯低于正常組，下調(diào)值同肺部微血管的密度降低有緊密相關(guān)性，這一結(jié)果則提示EGFL7可能同肺部的微血管發(fā)育存在障礙有較大聯(lián)系[6]。此外，在高氧的暴露下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的EGFL7蛋白表達(dá)量明顯低于正常組并且高氧組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加，EGFL7蛋白表達(dá)增加可避免血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。高表達(dá)EGFL7是否可減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)血管發(fā)育，需深入研究明確。EGFL7在多種炎癥及血管生成中也扮演了重要的角色。在EGFL7敲除的體外血管模型中，EGFL7敲除后會抑制血管生成，同時血管屏障功能受損并導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[12]。EGFL7敲除鼠可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)，重組EGFL7蛋白治療則可減輕上述炎癥反應(yīng)[13]。在脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，鼠肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中的EGFL7表達(dá)減少，上調(diào)EGFL7可減少白細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞的黏附[14]。這表明EGFL7有可能通過減輕炎癥反應(yīng)增加血管生成。肺部高表達(dá)EGFL7是否能減輕炎癥反應(yīng)促進(jìn)血管及肺泡發(fā)育進(jìn)而發(fā)揮對BPD的保護(hù)作用，國內(nèi)外尚未見報道。

綜上所述，本研究通過建立能高表達(dá)EGFL7蛋白的EA.hy926細(xì)胞系，為下一步在體內(nèi)外實驗中探討EGFL7在BPD中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。