飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔生產(chǎn)性能和毛囊發(fā)育的影響

李玉娟 張?jiān)?張北育 王 斌 劉傳華 李福昌 劉 磊*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安271018；2.蒙陰縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心，蒙陰276200)

安哥拉兔是一種毛用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其產(chǎn)毛量的高低決定其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。兔毛的主要成分是氨基酸，飼糧中各類氨基酸含量對(duì)毛囊的發(fā)育至關(guān)重要。通過(guò)調(diào)節(jié)飼糧中關(guān)鍵氨基酸含量來(lái)促進(jìn)家兔毛囊發(fā)育，對(duì)提高產(chǎn)毛量具有重要意義。毛囊的發(fā)育經(jīng)歷生長(zhǎng)期、退行期和靜止期3個(gè)階段，是一個(gè)復(fù)雜又精密的過(guò)程，受到多種因素的制約。遺傳因素、營(yíng)養(yǎng)因素、年齡因素和季節(jié)因素等都會(huì)影響到毛囊的發(fā)育[1]。而毛囊生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，會(huì)受到眾多信號(hào)因子的調(diào)控，如Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、成纖維生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、角蛋白相關(guān)蛋白(Kap)等。Wnt/β-catenin和IGF-Ⅰ信號(hào)通路正調(diào)節(jié)毛囊細(xì)胞的增殖分化，而B(niǎo)MP信號(hào)通路和FGF5信號(hào)通路是控制毛囊從生長(zhǎng)期向休止期轉(zhuǎn)化的因子[2-3]。Kap作為兔毛的基本組成成分，已被證實(shí)與羊毛的直徑有關(guān)[4]。谷氨酰胺作為一種條件性必需氨基酸，具有促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)免疫系統(tǒng)提高等作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在谷氨酰胺代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒膺^(guò)程中，增加了外根鞘祖細(xì)胞向毛囊干細(xì)胞轉(zhuǎn)化[6]。谷氨酰胺可直接給毛囊細(xì)胞供給能量[7]，這為通過(guò)調(diào)節(jié)飼糧中谷氨酰胺水平來(lái)促進(jìn)毛囊發(fā)育提供了方向。因此，本試驗(yàn)擬通過(guò)在飼糧中添加不同水平谷氨酰胺，研究其對(duì)安哥拉兔毛囊發(fā)育、生產(chǎn)性能和毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，探究谷氨酰胺調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育有關(guān)的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

選取初始體重、初始產(chǎn)毛量差異不顯著(P>0.05)的安哥拉兔200只，隨機(jī)分為5組，每組40個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)飼糧中分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%的谷氨酰胺?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

試驗(yàn)自2021年4月開(kāi)始至2021年7月結(jié)束，預(yù)試期3 d，正試期65 d。飼養(yǎng)期間，所有兔單籠飼養(yǎng)，自由飲水，常規(guī)免疫程序免疫接種，兔舍自然采光和通風(fēng)，定期對(duì)兔舍進(jìn)行消毒。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集與制備

飼養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)所有試驗(yàn)兔剪毛處理，試驗(yàn)結(jié)束后，再次將所有試驗(yàn)兔剪毛，用于統(tǒng)計(jì)產(chǎn)毛量。每組隨機(jī)選取8只試驗(yàn)兔，采集肩部、背部、臀部兔毛樣品，置于密封袋中常溫密封保存，用于兔毛品質(zhì)的檢測(cè)；然后再采集2 cm×2 cm皮膚樣品2份，1份保存于多聚甲醛中用于皮膚毛囊切片的制作，1份保存于凍存管中-80 ℃保存，用于毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)。

1.3 生產(chǎn)性能的測(cè)定

飼養(yǎng)試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)所有試驗(yàn)兔剪毛，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后再次對(duì)所有試驗(yàn)兔剪毛，測(cè)定剪毛前后體重，根據(jù)差值計(jì)算產(chǎn)毛量(結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐，本試驗(yàn)中產(chǎn)毛量測(cè)定選取的兔毛為污毛)。根據(jù)整個(gè)試驗(yàn)期間的采食量計(jì)算平均日采食(ADFI)和料毛比，計(jì)算公式如下：

ADFI(g/d)=飼養(yǎng)試驗(yàn)期間每只
試驗(yàn)兔的總采食量/試驗(yàn)天數(shù)；料毛比=飼養(yǎng)試驗(yàn)期間每只試驗(yàn)兔的總采食量/
飼養(yǎng)試驗(yàn)期間每只試驗(yàn)兔的產(chǎn)毛量。

1.4 毛品質(zhì)的測(cè)定

將采集到的被毛樣品進(jìn)行兔毛品質(zhì)的測(cè)定，每個(gè)樣品隨機(jī)選取300根兔毛進(jìn)行測(cè)定。斷裂強(qiáng)力、伸長(zhǎng)、斷裂強(qiáng)度、伸長(zhǎng)率和斷裂功使用南通宏大YG005N+型電子單纖維強(qiáng)力儀測(cè)定。設(shè)置隔距10 mm，拉伸速度20 mm/min，每個(gè)樣品隨機(jī)測(cè)定20次。纖維細(xì)度和粗毛率(根數(shù)比)使用BEIONF6纖維細(xì)度儀測(cè)定，每個(gè)兔毛樣品隨機(jī)測(cè)定300根。毛叢長(zhǎng)度使用軟尺測(cè)量(精確到0.1 cm)測(cè)定，結(jié)束后打印結(jié)果。

1.5 毛囊密度的測(cè)定

試驗(yàn)兔皮膚樣品在多聚甲醛中固定24 h后，經(jīng)過(guò)沖水、梯度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包埋處理后，以5 μm的厚度切片，使用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色，具體方法參照王童童[8]。使用顯微鏡觀察，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)面積和初級(jí)毛囊個(gè)數(shù)及次級(jí)毛囊個(gè)數(shù)，并拍照記錄。

1.6 基因表達(dá)的測(cè)定

使用Trizol法提取皮膚組織樣品中的總RNA，然后在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定其濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR的測(cè)定，具體方法參照Roche反轉(zhuǎn)錄和諾唯贊熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，相關(guān)的引物序列參照Liu等[9]。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，得出目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以Duncan氏法進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有變化趨勢(shì)，P>0.05為無(wú)顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔生產(chǎn)性能的影響

由表2可以看出，在初始體重及產(chǎn)毛量無(wú)顯著差異(P>0.05)的情況下，與對(duì)照組相比，飼糧中添加0.9%的谷氨酰胺能顯著提高產(chǎn)毛量和產(chǎn)毛率(P<0.05)，顯著降低料毛比(P<0.05)；飼糧中添加不同水平谷氨酰胺對(duì)ADFI無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔生產(chǎn)性能的影響

2.2 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛品質(zhì)的影響

由表3可以看出，飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)兔毛的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度、伸長(zhǎng)率、纖維細(xì)度和粗毛率都有顯著影響(P<0.05)，與對(duì)照組相比，其中飼糧中添加0.6%和1.2%谷氨酰胺可顯著降低兔毛伸長(zhǎng)長(zhǎng)度(P<0.05)；飼糧中添加0.6%和1.2%谷氨酰胺可顯著降低兔毛伸長(zhǎng)率(P<0.05)；與對(duì)照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)兔毛纖維細(xì)度無(wú)顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加0.6%和0.9%谷氨酰胺可顯著提高粗毛率(P<0.05)。與對(duì)照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺可顯著降低兔毛叢長(zhǎng)度(P<0.05)；但飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)兔毛斷裂強(qiáng)力、斷裂強(qiáng)度以及斷裂功均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.3 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛囊密度的影響

由表4可以看出，與對(duì)照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺具有提高初級(jí)毛囊密度的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)；飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)次級(jí)毛囊密度和總毛囊密度沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛品質(zhì)的影響

表4 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛囊密度的影響

2.4 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表5可以看出，與對(duì)照組相比，飼糧中添加谷氨酰胺能夠顯著提高皮膚IGF-ⅠR基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)皮膚IGF-Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量具有降低的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)；飼糧中添加谷氨酰胺可顯著降低皮膚BMP2和BMP4基因相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

表5 飼糧中添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛囊發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items谷氨酰胺添加水平 Gln supplemental levels/%0(對(duì)照 Control)0.30.60.91.2P值P-value轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2 TGF-β21.00±0.260.86±0.191.56±1.080.33±0.061.73±0.910.592 5表皮生長(zhǎng)因子 EGF1.00±0.210.71±0.181.55±1.350.46±0.200.27±0.110.577 9角蛋白相關(guān)蛋白3.1 Kap 3.11.00±0.300.29±0.110.50±0.330.34±0.170.54±0.380.409 0角蛋白相關(guān)蛋白6.1 Kap 6.11.00±0.220.11±0.032.35±1.201.16±0.410.83±0.540.141 6哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 mTOR1.00±0.271.65±0.861.25±0.850.30±0.081.22±0.450.604 8p70核糖體蛋白S6激酶 p70s6k1.00±0.440.48±0.290.29±0.200.44±0.190.40±0.220.466 2Noggin1.00±0.201.40±0.500.90±0.720.33±0.152.15±0.780.201 2

3 討 論

3.1 飼糧添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔生產(chǎn)性能的影響

研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加谷氨酰胺可顯著提高仔豬和肉仔雞的平均日增重，降低其料重比[10]。0.4%～2.0%谷氨酰胺可顯著提高斷奶獺兔的平均日增重，顯著降低料重比，0.9%時(shí)達(dá)到效果最佳[11]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加0.9%的谷氨酰胺能顯著提高安哥拉兔的產(chǎn)毛量、產(chǎn)毛率，并降低料毛比，提示谷氨酰胺能調(diào)節(jié)腸道功能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收效率。谷氨酰胺作為一種條件性必需氨基酸，在斷奶、免疫等應(yīng)激條件下機(jī)體需要量增加，需從外界攝取。谷氨酰胺不僅能為免疫細(xì)胞提供能量，還在機(jī)體抗氧化方面發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.6%～0.9%谷氨酰胺提高安哥拉兔的成活率，表明谷氨酰胺在調(diào)節(jié)家兔機(jī)體健康上同樣發(fā)揮重要作用。

3.2 飼糧添加谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔毛囊發(fā)育的影響

兔毛產(chǎn)量和兔毛品質(zhì)決定了安哥拉兔的經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加1.2%谷氨酰胺可顯著降低安哥拉兔兔毛的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度和伸長(zhǎng)率，提示高劑量添加谷氨酰胺能抑制毛囊細(xì)胞的增殖和分化。此外，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺有增加皮下毛囊細(xì)胞中初級(jí)毛囊密度的趨勢(shì)，這與飼糧中添加含硫氨基酸的效果一樣，飼糧中添加0.4%蛋氨酸和0.45%半胱氨酸均能提高家兔的被毛密度[12]。這表明谷氨酰胺對(duì)毛囊的影響與含硫氨基酸有相似之處，都能夠提高毛囊密度。初級(jí)毛囊主要發(fā)育成粗毛，谷氨酰胺添加誘導(dǎo)初級(jí)毛囊發(fā)育導(dǎo)致粗毛含量的增加，進(jìn)而提高了兔毛產(chǎn)量。

在毛囊發(fā)育的生長(zhǎng)期，IGF-Ⅰ可刺激毛基質(zhì)角化細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)一步加快毛囊的發(fā)育。IGF-Ⅰ與胰島素的作用具有同源性，能夠促進(jìn)有絲分裂和蛋白質(zhì)的合成[13]。對(duì)上皮細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞的增殖分化同樣也具有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加谷氨酰胺雖然對(duì)安哥拉兔皮膚中IGF-Ⅰ基因相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響，但卻顯著提高了皮膚中IGF-ⅠR的基因相對(duì)表達(dá)量，提示谷氨酰胺可通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-ⅠR基因表達(dá)來(lái)激活I(lǐng)GF-Ⅰ信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育過(guò)程。

BMP信號(hào)通路能夠通過(guò)調(diào)控毛發(fā)基質(zhì)細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞中與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)調(diào)控生長(zhǎng)期毛囊毛乳頭的大小[2]，能抑制毛囊發(fā)育，是毛囊發(fā)育的抑制劑。有研究表明，BMP2在毛囊密度低的獺兔中的表達(dá)量顯著高于毛囊密度高的獺兔[14]。本試驗(yàn)中，皮膚BMP2和BMP4基因相對(duì)表達(dá)量都有顯著降低，提示谷氨酰胺能通過(guò)抑制BMP2/4信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)毛囊的發(fā)育。

毛囊發(fā)育過(guò)程還受到其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，如成纖維生長(zhǎng)因子5(FGF5)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)等信號(hào)通路在調(diào)控毛囊細(xì)胞增殖和周期性循環(huán)中都發(fā)揮作用，這些信號(hào)通路都能促使毛囊細(xì)胞提前結(jié)束生長(zhǎng)期，向其他時(shí)期進(jìn)行[15-16]。mTOR信號(hào)通路可以整合各種營(yíng)養(yǎng)和能量信號(hào)，從而促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)[17]。在本試驗(yàn)中，谷氨酰胺對(duì)安哥拉兔皮膚中FGF5、TGF、Kap和mTOR基因相對(duì)表達(dá)量都無(wú)顯著影響，提示這些基因可能在谷氨酰胺調(diào)節(jié)安哥拉兔毛囊發(fā)育過(guò)程中不是關(guān)鍵的靶基因。

4 結(jié) 論

飼糧中添加谷氨酰胺提高了安哥拉兔產(chǎn)毛量，IGF-Ⅰ和BMP信號(hào)通路參與谷氨酰胺調(diào)節(jié)毛囊發(fā)育過(guò)程；本試驗(yàn)建議安哥拉兔飼糧中谷氨酰胺的適宜添加水平為0.9%。