甘草對大鯢血液細(xì)胞及皮質(zhì)醇水平的影響

文/王文博 高靜 陳瑩 魯義善

為研究甘草對大鯢血液細(xì)胞及應(yīng)激激素水平的影響，對大鯢投喂甘草提取物后，檢測了大鯢血液指標(biāo)及皮質(zhì)醇含量。結(jié)果顯示，在各個(gè)采樣期藥物組血清殺菌活性都高于對照組。56d時(shí)，低劑量組每毫升血液淋巴細(xì)胞總數(shù)為（48.4±6.1）×106個(gè)，顯著高于對照組（28.9±7.1）×106個(gè)（P＜0.05）。結(jié)果表明，投喂甘草提取物提高了大鯢血液殺菌活性、血液淋巴細(xì)胞總數(shù)以及白細(xì)胞吞噬活性，并在一定程度上抑制了血清皮質(zhì)醇水平，增強(qiáng)了大鯢抗應(yīng)激能力。

近年來，人們致力于探索可替代抗生素和化學(xué)藥品的綠色天然藥物，中醫(yī)藥農(nóng)業(yè)成為研究熱點(diǎn)，中草藥對水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的作用日益突顯。甘草是常見中草藥，在臨床上具有多種功效，并可增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫力，而機(jī)體的非特異性免疫系統(tǒng)是抵御外來病原入侵的第一道防線，可以對病原進(jìn)行非特異性殺傷，比如免疫細(xì)胞里的單核/巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、粒細(xì)胞等及免疫分子里的溶菌酶、補(bǔ)體、C-反應(yīng)蛋白等，在機(jī)體抗病方面發(fā)揮著重要作用。因此，提取甘草有效成分并制成藥餌，在養(yǎng)殖過程中加以合理運(yùn)用，或可有效降低動物發(fā)病率。

中國大鯢（Andrias davidianus），在分類學(xué)上隸屬于兩棲綱（Amphibia），有尾目（Caudata），隱鰓鯢科（Cryptobrachidae），大鯢屬（Andrias），也被稱作娃娃魚、孩兒魚，是我國二級重點(diǎn)保護(hù)珍稀水生物種和瀕危野生動植物國際貿(mào)易公約附錄Ⅰ物種。為保護(hù)大鯢這一瀕危物種，防止其種群衰減造成野生資源枯竭，我國在20世紀(jì)80年代出臺了一系列相關(guān)政策，鼓勵(lì)人工養(yǎng)殖大鯢，因此大鯢養(yǎng)殖業(yè)得到了蓬勃發(fā)展。但是養(yǎng)殖過程中的疾病也隨之而來，給養(yǎng)殖者帶來了經(jīng)濟(jì)損失。在大鯢疾病研究方面，國內(nèi)外主要聚焦于大鯢病原及其引發(fā)的病癥。不同病原可引發(fā)不同癥狀，從癥狀上可以對病原做出基本的判斷，但有時(shí)不同病原也可以引發(fā)相同或相似癥狀，比如有些病毒和細(xì)菌均能引起大鯢肌肉或者組織出血，需要運(yùn)用病理學(xué)、分子生物學(xué)等手段來做診斷。

大鯢病癥及病原的分子生物學(xué)研究相對較多，但是血液學(xué)及應(yīng)激反應(yīng)的研究還有所欠缺。機(jī)體的神經(jīng)、內(nèi)分泌及血液循環(huán)系統(tǒng)是緊密關(guān)聯(lián)的，分別產(chǎn)生效應(yīng)物來傳遞信號，從而引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)。長期的應(yīng)激反應(yīng)也可使機(jī)體免疫力下降，誘發(fā)疾病。因此，如果能找到對血液免疫細(xì)胞有激活作用并能有效抑制應(yīng)激反應(yīng)的藥物，將大大降低大鯢的發(fā)病率。本研究在以往的工作基礎(chǔ)上，選用甘草這種天然綠色植物，對其有效成分進(jìn)行提取，投喂大鯢，研究了其對大鯢血液細(xì)胞及應(yīng)激激素皮質(zhì)醇水平的影響，將中醫(yī)藥農(nóng)業(yè)理論引入大鯢健康養(yǎng)殖實(shí)踐，對大鯢疾病的防控和研發(fā)綠色無公害漁藥具有積極意義。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

甘草購自甘肅省武威市，其根部切片后提取有效成分。大鯢購自陜西省漢中市大鯢人工養(yǎng)殖場，平均體重為（248.05±3.07）g，實(shí)驗(yàn)前在持續(xù)流動的山泉水養(yǎng)殖池中馴養(yǎng)1周，投喂雜魚及配合飼料。嗜水氣單胞菌購自某生物試劑公司。

（二）藥餌的制備

采用水提醇沉法提取工藝對甘草多糖及甙類化合物進(jìn)行粗提。簡言之，甘草飲片置10倍量95%酒精中，60℃回流醇洗，除雜。酒精廢液60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，回收。藥渣經(jīng)蒸餾水浸提、過濾、棄藥渣。水提液加乙醇以4000r/min離心沉淀20min，棄上清，將離心所得浸膏蒸干，研磨成粉，4℃?zhèn)浯妗⒏什荽痔岱郯?.5%和2%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與基礎(chǔ)粉料混合，制成顆粒餌料。其中，基礎(chǔ)粉料配比（占干物質(zhì)）為：魚粉30%、魚油10%、豆粕20%、淀粉20%、麩皮15%、無機(jī)鹽預(yù)混料4.5%、維生素預(yù)混料0.5%。

（三）分組及采樣

同源同批大鯢被隨機(jī)分配到6個(gè)水泥池（每個(gè)容積約300L）中，每個(gè)池50尾大鯢，中間用隔板隔開，用于平行實(shí)驗(yàn)。其中，血液學(xué)實(shí)驗(yàn)用3個(gè)池，分別為對照組、低劑量組和高劑量組，均避光處理；皮質(zhì)醇實(shí)驗(yàn)用3個(gè)池，分別為對照組、低劑量組和高劑量組，均暴露于日光下，使大鯢處于光照脅迫狀態(tài)。血液學(xué)實(shí)驗(yàn)和皮質(zhì)醇實(shí)驗(yàn)的對照組均投喂無藥餌料，低劑量組投喂0.5%甘草餌料，高劑量組投喂2%甘草餌料。

分別在投喂后第14d、28d、35d、42d、56d采樣，每次每池取10尾。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行對照組采樣。采樣時(shí)，用一次性醫(yī)用注射器于尾靜脈抽血。

（四）血液學(xué)檢測

1.血清殺菌活性

方法參照Ainsworth，略做修改。0.5%鹽水制備嗜水氣單胞菌懸液，用分光光度計(jì)將濃度調(diào)整為106CFU/mL。50μL血清加入等量菌懸液中，22℃孵育5h之后，將混合液倍比稀釋，不同稀釋度各取10μL加于TSB上，28℃孵育過夜，計(jì)算平皿菌落數(shù)（Colony Forming Units，CFUs）。用50μL鹽水代替50μL血清加入等量菌懸液作為陽性對照。結(jié)果用殺菌百分率表示：

殺菌百分率（Percentage Killing）＝（1-實(shí)驗(yàn)組CFUs/陽性對照CFUs）×100%

2.血液淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)

將少量抗凝血用Giemsa染液做30倍稀釋，取1滴加于血球計(jì)數(shù)板（型號：XBK-25）上，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)淋巴細(xì)胞數(shù)目，將結(jié)果換算為每毫升血液中所含淋巴細(xì)胞總數(shù)。

3.血液紅細(xì)胞壓積

將抗凝血裝于壓積管中置水平離心機(jī)，以2000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，取出壓積管用標(biāo)尺量出紅細(xì)胞壓積的長度占全長的百分比，即為紅細(xì)胞壓積值。

4.血液白細(xì)胞吞噬活性

取抗凝血以600r/min離心10min，收集白細(xì)胞層，用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液將濃度調(diào)整至105個(gè)/mL備用。實(shí)驗(yàn)菌株為嗜水氣單胞菌，顯微鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞中吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)，按下式求出吞噬百分率：

吞噬百分率＝（吞噬細(xì)菌的白細(xì)胞數(shù)/100）×100%

5.血清皮質(zhì)醇水平

參照P i c k e r i n g方法用放免法（RIA）進(jìn)行測定。

二、結(jié)果

（一）血清殺菌活性測定結(jié)果

投喂甘草提取物對大鯢血清殺菌活性的影響結(jié)果見圖1。在各個(gè)采樣期藥物組殺菌活性都高于對照組，14d和56d時(shí)，高劑量組殺菌活性顯著高于同期對照組（P＜0.05），分別為（68±26）%和（62±18）%。但殺菌活性不存在劑量依賴性，在28d和35d時(shí)，低劑量組殺菌活性高于高劑量組。

圖1 投喂甘草提取物對大鯢血清殺菌活性的影響

（二）血液淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

血液淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。56d時(shí)，低劑量組每毫升血液淋巴細(xì)胞總數(shù)為（48.4±6.1）×106個(gè)，顯著高于對照組（28.9±7.1）×106個(gè)（P＜0.05），35d時(shí)，高劑量組為（47.2±7.7）×106個(gè)，顯著高于對照組（26.4±7.3）×106個(gè)（P＜0.05）。

表1 投喂甘草提取物對大鯢血液淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響

（三）血液紅細(xì)胞壓積實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，藥物組和對照組紅細(xì)胞比容值沒有顯著性差異，均超過40%，各組隨時(shí)間變化不大。

表2 投喂甘草提取物對大鯢紅細(xì)胞比容的影響

（四）血液白細(xì)胞吞噬活性結(jié)果

由表3可知，藥物組血液白細(xì)胞吞噬活性都高于同期對照組，其中，高劑量組在35d和42d兩次結(jié)果都顯著高于對照組（P＜0.05），分別為（65.9±9.5）%和（66.9±8.1）%。

表3 投喂甘草提取物對大鯢血液白細(xì)胞吞噬活性的影響

（五）血清皮質(zhì)醇水平結(jié)果

由圖2可見，藥物組和對照組皮質(zhì)醇水平均有小幅波動，低劑量組后三次略高于對照組，但無顯著差異。高劑量組曲線在對照組和低劑量組下方，每次采樣期都是同期最低，其中，在28d高劑量組皮質(zhì)醇濃度為（173.5±25.2）ng/mL，顯著低于對照組（235.7±24.8）ng/mL（P＜0.05）。

圖2 投喂甘草提取物對大鯢血清皮質(zhì)醇水平的影響

三、分析與討論

血液是動物體內(nèi)循環(huán)最重要的組成部分，負(fù)責(zé)為機(jī)體運(yùn)輸養(yǎng)分和氧氣，并且構(gòu)成抵抗病原入侵機(jī)體的天然屏障，能反映出機(jī)體的生理性狀和受環(huán)境變化的響應(yīng)情況。因此，血液學(xué)參數(shù)是評估機(jī)體健康和營養(yǎng)狀況及應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo)。血清是血液自然沉淀后形成的上清液，里面富含各種免疫因子，如溶菌酶、補(bǔ)體、堿性磷酸酶、血清蛋白、超氧化物歧化酶等，它們在對殺傷外來入侵病原體方面發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)中，在各個(gè)采樣期藥物組血清殺菌活性都高于對照組，其中在14d和56d時(shí)，高劑量組殺菌活性顯著高于同期對照組（P＜0.05），說明投喂甘草提取物對大鯢血清殺菌活性具有一定的增強(qiáng)作用。由于血清中含有多種免疫因子，因此殺菌活性是一個(gè)綜合效應(yīng)，可能是血清中一種或幾種免疫因子被激活。有實(shí)驗(yàn)顯示，甘草促進(jìn)了尖吻鱸（Lates calcarifer）幼魚血清過氧化氫酶（CAT）活性和血清溶菌酶（LZM）含量（P＜0.05），提高了尖吻鱸幼魚免疫力和低溫脅迫后的存活率。其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)甘草具有顯著的抗菌特性，對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等都有殺傷作用。甘草的殺菌作用可能歸因于其含有的多糖、皂苷、生物堿、蒽、精油、有機(jī)酸等有效成分。

血液中除了血清外，還有紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，由于紅細(xì)胞可以攜氧和運(yùn)輸養(yǎng)分，因此紅細(xì)胞數(shù)量的多少可以反映出機(jī)體的營養(yǎng)健康狀況。白細(xì)胞又包括淋巴細(xì)胞和各種粒細(xì)胞等，它們都參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此白細(xì)胞的數(shù)量和活性直接影響機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。血小板的功能主要在于止血。本實(shí)驗(yàn)中，56d時(shí)，低劑量組每毫升血液淋巴細(xì)胞總數(shù)為（48.4±6.1）×106個(gè)，顯著高于對照組（28.9±7.1）×106個(gè)（P＜0.05），35d時(shí)，高劑量組為（47.2±7.7）×106個(gè)，顯著高于對照組（26.4±7.3）×106個(gè)（P＜0.05），說明甘草有效促進(jìn)了淋巴細(xì)胞的增殖。而藥物組和對照組紅細(xì)胞比容值沒有顯著性差異，各組隨時(shí)間變化不大。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，有研究用18β-甘草次酸長期對大鼠（Rattus norvegicus）進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鼠的紅細(xì)胞數(shù)量有所增加，這可能是實(shí)驗(yàn)動物和實(shí)驗(yàn)方法不同導(dǎo)致的結(jié)果不一致。

除了白細(xì)胞數(shù)量外，白細(xì)胞的活性，尤其是吞噬活性，也是反映機(jī)體免疫應(yīng)答水平的重要參數(shù)，因?yàn)樗芡淌蓜游矬w內(nèi)衰老和死亡的細(xì)胞以及大量的病原微生物。本實(shí)驗(yàn)中藥物組血液白細(xì)胞吞噬活性都高于同期對照組。其中，高劑量組在35d和42d兩次結(jié)果都顯著高于對照組（P＜0.05），分別為（65.9±9.5）%和（66.9±8.1）%，說明甘草促進(jìn)了白細(xì)胞的吞噬活性，提高了殺傷入侵病原體的效力。

大鯢適宜在避光安靜的環(huán)境下生活，在皮質(zhì)醇實(shí)驗(yàn)中，將大鯢暴露于光照下，使其長期處于脅迫狀態(tài)，然后檢測其血液皮質(zhì)醇水平，用于評估其對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。它的理論依據(jù)是，環(huán)境脅迫和機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)有著十分廣泛的聯(lián)系，而機(jī)體的丘腦下部-垂體-腎間組織軸（HPI軸）則在這種聯(lián)系中占有主導(dǎo)地位，機(jī)體受脅迫后會發(fā)生一系列的級聯(lián)反應(yīng)，由腎間組織產(chǎn)生最終效應(yīng)物——皮質(zhì)醇，并釋放到血液中去。因此，血液皮質(zhì)醇水平被認(rèn)為是確認(rèn)機(jī)體應(yīng)激的十分靈敏信號。

皮質(zhì)醇短期升高是機(jī)體的自然生理反應(yīng)，對機(jī)體有正面作用，但是如果皮質(zhì)醇長期處于高水平，則會對機(jī)體產(chǎn)生不良作用，比如免疫力下降、發(fā)育不良、內(nèi)分泌紊亂、對病原敏感性升高等。本實(shí)驗(yàn)中，高劑量組皮質(zhì)醇曲線在對照組和低劑量組下方，每次采樣期都是同期最低，說明高劑量甘草有效抑制了大鯢受脅迫后血液皮質(zhì)醇的升高。類似的，有研究表明，用發(fā)酵甘草投喂斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）后，在亞硝酸鹽脅迫下，魚體血液皮質(zhì)醇的含量低于對照組，表明餌料中添加發(fā)酵甘草可有效緩解石斑魚的應(yīng)激反應(yīng)。有關(guān)甘草抑制皮質(zhì)醇升高的報(bào)道較多，且結(jié)論一致。

綜上，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，甘草能較好地促進(jìn)大鯢血液殺菌活性、白細(xì)胞吞噬活性等，對免疫調(diào)控具有一定的促進(jìn)作用。同時(shí)，甘草能有效降低大鯢脅迫后的應(yīng)激反應(yīng)，揭示其作為抗應(yīng)激劑使用的可能性。然而，中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用還存在一些實(shí)際問題。比如，藥理研究還比較薄弱，中草藥成分復(fù)雜，具體是哪種成分發(fā)揮著功效，以及其內(nèi)在機(jī)制是什么，都有待深入研究。另外，本實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn)，在甘草的最佳使用劑量和療程方面，也有待進(jìn)一步探索。最后，由于中草藥的產(chǎn)地、品種、采摘季節(jié)、入藥部位以及提取方法等方面異同，也可能極大地影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此在進(jìn)行引用和比較時(shí)這些因素應(yīng)該考慮到。