ABO變異型B311亞型的鑒定及家系分析*

任倩 李春苗 劉興莉

ABO血型系統(tǒng)是最重要且最復(fù)雜的血型系統(tǒng)之一，與臨床輸血、器官移植等存在緊密聯(lián)系。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，ABO血型及亞型的基因序列不斷被人們認(rèn)識(shí)。目前已知的ABO亞型多由編碼區(qū)的基因變異引起，如6、7外顯子堿基突變、缺失、插入、替換等，均可影響A或B糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而導(dǎo)致ABO表型的變化[1]。除外顯子外，內(nèi)含子、5'-和3'-非編碼區(qū)等也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄效率[2]。因此，ABO基因序列變異的分析對(duì)準(zhǔn)確報(bào)告ABO表型以及為臨床輸血提供有用的信息都至關(guān)重要。本研究通過血清學(xué)方法對(duì)家系成員ABO血型進(jìn)行鑒定，然后通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)ABO基因序列進(jìn)行測定，研究其分子基礎(chǔ)并進(jìn)行家系分析。

資料與方法

1 對(duì)象 先證者，女，5歲7月，因腺樣體肥大入院，輸血前檢查發(fā)現(xiàn)ABO血型正定型A抗原反應(yīng)正常、B抗原反應(yīng)弱，術(shù)前無輸血史，同時(shí)采集其父母血液樣本進(jìn)行家系分析，家系成員均簽署了知情同意書。

2 試劑與儀器 抗-A、抗-B血型定型試劑（單克隆抗體）（批號(hào)20210913）購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司,抗A1試劑（批號(hào)20211028）和抗A，B（批號(hào)20211208）均購自江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司，抗-H試劑（批號(hào)8000258203）購自荷蘭Sanquin公司，抗D（IgM）（批號(hào)20191811）、人ABO血型反定型用紅細(xì)胞試劑盒（批號(hào)20215309）購自上海血液生物醫(yī)藥有限公司，ABO正反定型血型卡（批號(hào)20210603）購自長春博迅生物技術(shù)有限公司，人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）、全血DNA提取試劑盒均購自江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司。Hamilton全自動(dòng)血型分析儀（型號(hào)Microlab Starlet IVD）購自長春博迅生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR儀（型號(hào)FQD-96A）購自杭州博日科技股份有限公司。

3 方法

3.1 血清學(xué)分型：抽取先證者及家長各2～3mL靜脈血，EDTA抗凝，采用經(jīng)典試管法進(jìn)行正反定型。血清學(xué)血型分型方法和操作步驟參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》。

3.2 DNA提取與擴(kuò)增：用全血DNA提取試劑盒（江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司）提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增目的基因，產(chǎn)物經(jīng)回收純化用于基因分型及序列測定。

3.3 熒光PCR法基因分型：用人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）（江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司）進(jìn)行基因分型。

3.4 序列測定：測序試劑盒購自江蘇中濟(jì)萬泰生物醫(yī)藥有限公司，對(duì)ABO基因第1-7外顯子和啟動(dòng)子5'UTR區(qū)進(jìn)行序列測定。ABO基因參考序

列為ABO*A1.01.01等位基因序列（GenBank：AJ536122）。引物序列見表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

結(jié) 果

1 血清學(xué)定型結(jié)果 血型血清學(xué)結(jié)果見表2。正定型，先證者紅細(xì)胞與抗A發(fā)生強(qiáng)凝集（4+），與抗B發(fā)生混合凝集（MF），與抗A，B發(fā)生強(qiáng)凝集（4＋），與抗H發(fā)生強(qiáng)凝集（3+W）；反定型，先證者血清不與A細(xì)胞、B細(xì)胞凝集。其母親紅細(xì)胞與抗B發(fā)生強(qiáng)凝集（4+），與抗A，B發(fā)生強(qiáng)凝集（4＋），與抗H發(fā)生強(qiáng)凝集（4+）；反定型，血清與A細(xì)胞發(fā)生凝集（2+）；血清中無不規(guī)則抗體的存在。先證者父親為正常的AB型血反應(yīng)格局。

表2 先證者及其家族成員ABO血型血清學(xué)結(jié)果

2 血型基因熒光分型 根據(jù)ABO基因分型結(jié)果，先證者熒光分型為A/B，先證者父親熒光分型為A/B，先證者母親熒光分型為B/O。熒光PCR分型結(jié)果見圖1。

圖1 先證者及其父母熒光分型結(jié)果

3 基因測序結(jié)果及變異分析 先證者基因型為ABO*A1.02/B311，先證者母親基因型為B311/ABO*O.01.01。DNA序列分析顯示，與ABO*B.01相比，B311存在啟動(dòng)子5'UTR區(qū)-35到-18缺失（圖2）；先證者的父親基因分型的測序結(jié)果顯示具有ABO*A1.02和ABO*B.01的堿基特征。先證者及其家族成員ABO基因克隆測序結(jié)果見表3。

表3 先證者及其家族成員ABO基因測序結(jié)果

4 家系分析 根據(jù)ABO血型基因第1-7外顯子及啟動(dòng)子5'UTR區(qū)測序結(jié)果顯示，先證者基因型為ABO*A1.02/B311，先證者母親基因型為B311/ABO*O.01.01，先證者父親基因型為ABO*A1.02/ABO*B.01。（圖3）。

圖2 啟動(dòng)子5'UTR區(qū)克隆測序結(jié)果

圖3 先證者及其家族成員家系分析

討 論

ABO血型系統(tǒng)與臨床輸血有著密切的聯(lián)系，血型鑒定的正確與否是臨床安全輸血的關(guān)鍵所在，實(shí)際工作中，經(jīng)常會(huì)遇到血型正反定型不符或者抗原、抗體減弱等情況，除年齡、疾病等因素外，多數(shù)為ABO基因變異導(dǎo)致的亞型或變異型。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，ABO血型及亞型的基因序列不斷為我們所認(rèn)識(shí)[3]。本研究中先證者血型正定型A抗原反應(yīng)正常、B抗原反應(yīng)弱，為進(jìn)一步確定患者血型及抗原減弱原因測定了ABO基因序列并進(jìn)行了家系分析。

根據(jù)ABO血型血清學(xué)特征將A亞型分為A2、A3、Ax、Am、Ael、Aend、Ay等，Salmon依照A亞型的分類標(biāo)準(zhǔn)將B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel、Bw[1]。WIENER等于1972年報(bào)道了首例非分泌B3，被認(rèn)為是最稀少的一種B亞型[4]，在中國漢族人中的比例約為1/900（B型），AB3型在中國漢族人中比例為1/1 800（AB型）[5]。目前NCBI中登記的B3亞型有16種[6]，其中，B311亞型最早于2013年在中國上海發(fā)現(xiàn)[2]，迄今共有4例AB311和5例B311報(bào)告[7-9]。B3亞型最主要的血清學(xué)表現(xiàn)是正定型抗B抗體呈現(xiàn)混合視野外觀（MF），抗H抗體呈現(xiàn)強(qiáng)凝集；反定型多數(shù)沒有抗B，僅少數(shù)存在冷反應(yīng)性抗B[10]。

本研究中先證者及其母親，試管法與抗H血清凝集分別為3+W、4+，呈現(xiàn)出與報(bào)道中B311亞型抗H強(qiáng)凝集相同的表現(xiàn)[9]。先證者基因測序結(jié)果為AB311，其紅細(xì)胞與抗A血清凝集為4+，與抗B血清呈混合凝集外觀；但其母親測序結(jié)果為B311，紅細(xì)胞與抗B血清為強(qiáng)凝集4+，與報(bào)道的B311抗B抗體呈現(xiàn)混合視野外觀的血清學(xué)表現(xiàn)（MF）描述不符[10]。 這可能與年齡和生長發(fā)育特點(diǎn)相關(guān)，研究顯示，由于2型前體物質(zhì)不成熟，臍帶血紅細(xì)胞ABO抗原數(shù)量比成人低[11]，新生兒紅細(xì)胞所帶的抗原數(shù)目只有成人的25%～50%，且抗原發(fā)育不成熟[12]，隨著年齡增長，更多的A抗原或B抗原得以表達(dá)[13]，2～4歲時(shí)表達(dá)水平與成人相同[11]。丹尼爾在《人類血型》[14]論著里提到，由于等位基因的競爭作用，兩種不同的糖基轉(zhuǎn)移酶會(huì)競爭共同受體物質(zhì)，使得A2B細(xì)胞上的A抗原比A2細(xì)胞上的A抗原弱，A1B細(xì)胞上的A抗原比A1細(xì)胞上的A抗原弱，這可能是導(dǎo)致本研究中先證者與其母親雖同時(shí)具有B311等位基因，但血清學(xué)表現(xiàn)并不一致的原因。張韋等[15]的研究中指出，日常使用的單克隆抗體效價(jià)很高，增加了與細(xì)胞的反應(yīng)強(qiáng)度，使得部分凝集強(qiáng)度稍弱的亞型標(biāo)本漏檢，而與人源血清反應(yīng)明顯減弱，本研究使用的血清抗體為單克隆抗體，也可能是引起母親血清學(xué)表現(xiàn)正常的原因。同時(shí)也提示我們，今后的工作中，對(duì)于疑難血型，應(yīng)增加人源血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，以提高亞型檢出率。

已知ABO亞型多由編碼區(qū)的基因突變引起，如發(fā)生在第6、7外顯子的堿基突變、替換、插入、缺失和雜交等位基因等，可能影響A或B糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而引起ABO表型的變化[16]。除了外顯子的變化，第一個(gè)內(nèi)含子及5'-和3'-非編碼區(qū)的ABO基因的特異性調(diào)控元也被發(fā)現(xiàn)能影響轉(zhuǎn)錄效率，從而影響ABO基因產(chǎn)物，導(dǎo)致ABO亞型的產(chǎn)生[17-18]。本研究中B311亞型即發(fā)生在基因啟動(dòng)子上游5'UTR區(qū)，在該區(qū)域檢測出-35到-18堿基的缺失，與2013年上海報(bào)道的首例B311亞型堿基序列一致。研究證明，啟動(dòng)子的突變可能會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，從而影響啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[19-20]。蔡曉紅等研究發(fā)現(xiàn)，-35到-18堿基的缺失，導(dǎo)致了啟動(dòng)子活性降低了50%以上，可能影響了RNA聚合酶Ⅱ或其他轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合的能力[9]，從而導(dǎo)致了B311亞型紅細(xì)胞表面抗原的弱表達(dá)，與本研究先證者的血清學(xué)結(jié)果相符。

有研究提出，先心病等疾病可能會(huì)導(dǎo)致ABO血型抗原的弱表達(dá)[21]。為了探究先證者抗原表達(dá)弱是否與疾病相關(guān)，我們對(duì)其父母ABO血型基因第1-7外顯子及啟動(dòng)子5'UTR區(qū)進(jìn)行了序列測定，通過家系分析發(fā)現(xiàn)，先證者B311等位基因應(yīng)來自于其母親，其抗原表達(dá)弱可能與B311等位基因相關(guān)，與本身所患腺樣體肥大可能沒有關(guān)系。

ABO亞型患者很難找到同型血液，一般輸注時(shí)紅細(xì)胞盡量選擇O型洗滌紅細(xì)胞，血漿或冷沉淀選擇AB型或亞型對(duì)應(yīng)的正常血型，血小板選擇亞型對(duì)應(yīng)的正常血型。由于B3型血漿中通常不含抗-B，輸血也可采用B型相容性輸血。因此，一般情況下為保證臨床用血安全可采用O型洗滌紅細(xì)胞；如若患者病情危重且無抗B抗體存在，也可考慮B型紅細(xì)胞。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突