系統(tǒng)性硬化病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

陳書媛，趙鋮

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南寧530021

系統(tǒng)性硬化病(SSc)是一種以局限性或彌漫性皮膚增厚和纖維化為特征的全身性自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，臨床亦缺乏行之有效的治療方式。構(gòu)建理想的動(dòng)物模型是探索SSc發(fā)病機(jī)制和檢測(cè)新治療策略重要的臨床前平臺(tái)。根據(jù)構(gòu)建方法不同，可將SSc動(dòng)物模型分為誘導(dǎo)模型和基因模型兩大類。其中，誘導(dǎo)模型包括博來(lái)霉素(BLM)誘導(dǎo)小鼠模型、慢性硬皮病樣移植物抗宿主病(Scl-cGVHD)小鼠模型、活性氧離子(ROS)誘導(dǎo)小鼠模型、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)誘導(dǎo)小鼠模型、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)小鼠模型和Ⅴ型膠原(ColⅤ)誘導(dǎo)小鼠模型等，基因模型包括基因突變模型、轉(zhuǎn)基因模型及基因敲除模型。雖然SSc動(dòng)物模型較多，但迄今為止仍無(wú)一種能夠完全模擬人類SSc疾病特征且易于推廣的動(dòng)物模型。本文結(jié)合文獻(xiàn)就SSc動(dòng)物模型的研究進(jìn)展作一綜述。

1 誘導(dǎo)模型

在誘導(dǎo)模型中，應(yīng)用最為廣泛、最為成熟的是BLM誘導(dǎo)小鼠模型和Scl-cGVHD小鼠模型。近年來(lái)，一些學(xué)者利用ROS、TopoⅠ、AngⅡ和ColⅤ等建立了新的誘導(dǎo)模型。誘導(dǎo)模型重點(diǎn)關(guān)注SSc的炎癥反應(yīng)和組織纖維化特征，而對(duì)SSc免疫反應(yīng)和血管病變的關(guān)注相對(duì)較少，但誘導(dǎo)模型操作簡(jiǎn)便、成本低、造模成功率高。

1.1 BLM誘導(dǎo)小鼠模型 1976年，ASO等[1]通過(guò)BLM氣管給藥方式構(gòu)建了小鼠肺纖維化模型。隨后有學(xué)者通過(guò)皮下注射的方式建立了同時(shí)具備炎癥反應(yīng)、局部皮膚纖維化、肺纖維化以及自身免疫反應(yīng)等特征的SSc樣改變小鼠模型[2]，并沿用至今。目前，皮下植入滲透性微泵作為皮下注射的替代策略，解決了重復(fù)皮下注射存在的注射部位損傷和藥物濃度分布不均勻等缺點(diǎn)[3]。不同品系小鼠對(duì)BLM的敏感度不同，BALB/c小鼠比C57BL/6、DBA/2小鼠更為敏感[4]。BLM誘導(dǎo)小鼠模型能夠模擬SSc早期的炎癥特征，已被廣泛用于SSc發(fā)病機(jī)制的研究以及多種抗炎和抗纖維化藥物的療效評(píng)價(jià)。但該模型不適用于SSc后期非炎癥階段的研究。另外，該模型的纖維化表現(xiàn)局限于注射部位，無(wú)全身效應(yīng)，自身抗體表達(dá)很低，并且?guī)缀醪荒苣M血管病變。

1.2 Scl-cGVHD小鼠模型 1983年，有學(xué)者將B10.D2小鼠脛骨、股骨骨髓以及脾臟制成淋巴細(xì)胞懸液，并注射至亞致死照射的BALB/c小鼠，構(gòu)建了Scl-cGVHD小鼠模型[5]。Scl-cGVHD小鼠模型早期即可觀察到嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見皮膚、肺、肝、腎以及腸道進(jìn)行性纖維化以及自身抗體ANA陽(yáng)性。該模型適用于模擬SSc早期的炎癥階段，然而由于移植技術(shù)較為復(fù)雜，并且移植后動(dòng)物處于免疫抑制狀態(tài)，易發(fā)生嚴(yán)重感染而死亡，造模成功率不高。有研究將BALB/c小鼠替換成Rag2基因敲除小鼠，這一改良使Scl-cGVHD小鼠模型更全面地模擬了人類SSc皮膚和內(nèi)臟纖維化、血管病變以及抗Scl-70抗體陽(yáng)性的特征，并且動(dòng)物死亡率明顯降低[6]。

1.3 ROS誘導(dǎo)小鼠模型 ROS是一種含有氧自由基的高活性化學(xué)物質(zhì)，包括O2-、HOCL、ONOO-、H2O2等。2009年，SERVETTAZ等[7]首次建立了ROS誘導(dǎo)的SSc小鼠模型，該模型通過(guò)皮下注射ONOO-引起小鼠局部皮膚損害以及血清抗CENP-B抗體陽(yáng)性，產(chǎn)生與人類局限性SSc相似的特征；皮下注射HOCL可引起小鼠彌漫性皮膚損害、肺纖維化、腎臟受累及血清抗Scl-70抗體陽(yáng)性，產(chǎn)生與人類彌漫性SSc相似的特征。2019年，MENG等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HOCL誘導(dǎo)小鼠模型能夠顯示全身免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、微血管損害和纖維化以及促炎和促纖維化途徑激活。ROS誘導(dǎo)小鼠模型能夠在BALB/c、C57BL/6、DBA/1、NZB等不同品系小鼠身上成功復(fù)制。與BLM誘導(dǎo)小鼠模型相比，ROS誘導(dǎo)小鼠模型在模擬血管病變方面更具優(yōu)勢(shì)，并且首次在小鼠體內(nèi)同時(shí)模擬了人類SSc不同的臨床類型，并證實(shí)抗Scl-70抗體直接參與SSc發(fā)病。目前，ROS誘導(dǎo)小鼠模型主要用于抗纖維化藥物的研究。

1.4 TopoⅠ誘導(dǎo)小鼠模型 2011年，YOSHIZAKI等[9]通過(guò)皮下注射重組人TopoⅠ和完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)SSc樣病變，C57BL/6小鼠表現(xiàn)出皮膚和肺組織炎癥、纖維化，并產(chǎn)生高水平的抗TopoⅠ抗體，炎癥因子IL-6、IL-4、TGF-β1、IL-17等水平升高，IL-10水平降低；而IL-6表達(dá)缺失的C57BL/6小鼠皮膚和肺組織纖維化明顯減輕。提示該模型可能通過(guò)IL-6誘導(dǎo)SSc樣皮膚和肺組織纖維化以及自身免疫異常。2016年，MEHTA等[10]采用負(fù)載TopoⅠA和TopoⅠB多肽的樹突狀細(xì)胞重復(fù)免疫小鼠，亦可誘導(dǎo)出類似人類彌漫性SSc樣的彌漫性皮膚纖維化和抗TopoⅠ自身抗體反應(yīng)。TopoⅠ誘導(dǎo)小鼠模型的優(yōu)點(diǎn)在于以TopoⅠ免疫為基礎(chǔ)，再現(xiàn)了彌漫性SSc的特征，可用于研究TopoⅠ抗體在SSc發(fā)病機(jī)制中的作用。但該模型的缺點(diǎn)是無(wú)法模擬血管病變。

1.5 AngⅡ誘導(dǎo)小鼠模型 2012年，STAWSKI等[11]通過(guò)皮下滲透泵連續(xù)注射AngⅡ建立了SSc模型，該模型小鼠可表現(xiàn)出顯著的真皮纖維化和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。2014年該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)小鼠模型皮膚和心臟血管內(nèi)皮血管損傷標(biāo)記物顯著增加，如vWF、TSP-1、MMP-12，而MMP-12缺失小鼠血管損傷、M2巨噬細(xì)胞聚集以及皮膚和心臟纖維化明顯減輕[12]，提示MMP-12可能是一個(gè)SSc新的潛在治療靶點(diǎn)。AngⅡ誘導(dǎo)小鼠模型能夠模擬人類SSc組織纖維化、皮膚和心臟血管損傷，但該模型無(wú)法展現(xiàn)SSc發(fā)病時(shí)的自身免疫反應(yīng)過(guò)程。

1.6 ColⅤ誘導(dǎo)小鼠模型 有研究報(bào)道，ColⅤ異常沉積與皮膚增厚和疾病活動(dòng)度有關(guān)[13]，并被證實(shí)與SSc的自身免疫特征有關(guān)[14]。有研究通過(guò)對(duì)新西蘭兔皮下注射人ColⅤ和CFA誘導(dǎo)出SSc樣病變，該病變表現(xiàn)為皮膚和肺血管重塑、纖維化，ANA和抗Scl-70抗體陽(yáng)性[15]。由于小鼠在可重復(fù)性、操作性及成本等方面較新西蘭兔更具優(yōu)勢(shì)，2019年該團(tuán)隊(duì)改用C57BL/6小鼠建立了ColⅤ誘導(dǎo)小鼠模型，并成功復(fù)制了SSc的炎癥反應(yīng)、纖維化、血管病變和自身免疫特征[16]。在誘導(dǎo)模型中，ColⅤ誘導(dǎo)小鼠模型能夠較為完整地復(fù)制SSc疾病特征，在未來(lái)的研究中具有更為廣闊的應(yīng)用前景。但ColⅤ誘導(dǎo)小鼠模型無(wú)法確定微血管疾病和炎癥反應(yīng)是否先于肺纖維化，并且觸發(fā)SSc的機(jī)制尚不完全清楚。

2 基因模型

基因模型可分為基因突變模型、轉(zhuǎn)基因模型及基因敲除模型?；蚰Ｐ驮谀MSSc組織纖維化和血管病變方面更具優(yōu)勢(shì)，能夠在一定程度上彌補(bǔ)誘導(dǎo)模型的不足，但存在靶點(diǎn)單一、技術(shù)復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。

2.1 基因突變模型

2.1.1 UCD-200小雞模型 1981年，GERSHWIN等[17]建立的UCD-200小雞模型被認(rèn)為是目前對(duì)SSc疾病特征模擬最為完整的動(dòng)物模型。該模型能夠展現(xiàn)內(nèi)皮損傷、小動(dòng)脈閉塞、皮膚和內(nèi)臟纖維化、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和自身免疫反應(yīng)等SSc疾病特征。但UCD-200小雞遺傳表型具有異質(zhì)性，目前對(duì)其遺傳信息和分子基礎(chǔ)的研究有限，并且該模型應(yīng)用技術(shù)尚不成熟，難以繁育，價(jià)格昂貴，在應(yīng)用中受到明顯限制。

2.1.2 TSK小鼠模型 TSK小鼠模型包括TSK-1、TSK-2小鼠模型，其基因突變位點(diǎn)不同但表現(xiàn)相似。TSK-1小鼠模型為原纖維蛋白基因1發(fā)生的顯性突變[18]，而TSK-2小鼠模型是由乙基亞硝基脲誘導(dǎo)1號(hào)染色體基因的顯性突變，特別是Col3a1基因PIIINP片段的功能獲得性突變[19]。TSK-1、TSK-2小鼠模型均能展現(xiàn)出皮膚纖維化和自身免疫反應(yīng)的SSc樣特征，但TSK-2小鼠模型在真皮下層和脂肪組織隔膜中可觀察到單核細(xì)胞浸潤(rùn)，較TSK-1小鼠模型模擬更為全面。目前，TSK小鼠模型主要用于人類SSc晚期纖維化方面的研究，常與BLM誘導(dǎo)小鼠模型聯(lián)合應(yīng)用。但與SSc患者臨床病理特征有所不同，TSK小鼠模型皮膚纖維化發(fā)生在皮下組織、位置深在，肺部受累以肺氣腫樣改變?yōu)橹鳎瑤缀鯚o(wú)纖維化，并且缺乏血管病變[18]。

2.2 轉(zhuǎn)基因模型

2.2.1 Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型 Fra-2是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白酶1家族成員之一，與炎癥反應(yīng)和膠原生成等密切相關(guān)。在SSc患者中可觀察到Fra-2基因啟動(dòng)子的表觀遺傳學(xué)改變[20]。有研究在MHC-Ⅰ類抗原H2Kb啟動(dòng)子介導(dǎo)的Fra-2過(guò)表達(dá)小鼠中觀察到肺纖維化，隨后又在Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)進(jìn)行性加重的皮膚纖維化和毛細(xì)血管減少、微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和肺動(dòng)脈血管閉塞及肺動(dòng)脈高壓(PAH)等典型血管病變，非常類似于SSc的肺動(dòng)脈血管重塑和非特異性間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)[21]。2015年，VENALIS等[22]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠模擬SSc相關(guān)心肌病的所有特征。Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠高度模擬SSc的血管病變和纖維化這兩大特征，可作為研究SSc血管病變和心肌損害的臨床前模型，但該模型缺乏自身免疫病表現(xiàn)，并且PAH能夠極大程度地降低小鼠壽命。

2.2.2 TGF-β相關(guān)轉(zhuǎn)基因小鼠模型 TGF-β通路是參與SSc組織纖維化的重要通路之一。TBRICA；Cre-ER轉(zhuǎn)基因小鼠是在TGFβRⅠ基因上游引入原α2(Ⅰ)膠原基因的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和他莫昔芬誘導(dǎo)Cre/loxP系統(tǒng)，小鼠出生后2周給予4-羥基他莫昔芬可激活組成性活性TGFβRⅠ表達(dá)，小鼠會(huì)逐漸出現(xiàn)全身性進(jìn)行性真皮纖維化，但不會(huì)出現(xiàn)肺纖維化，并可見腎、肺和腎上腺動(dòng)脈血管壁增厚[23]。另一種TGFβRⅡΔK轉(zhuǎn)基因小鼠成纖維細(xì)胞中表達(dá)激酶缺陷型人Ⅱ型TGF-β受體，表現(xiàn)為真皮、肺、心臟和腸道纖維化，還能觀察到血管纖維化[24]。這兩種模型對(duì)研究TGF-β介導(dǎo)的組織纖維化具有重要價(jià)值，但這兩種模型缺少自身免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)特征，并且模型建立需要條件性成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方面的特殊技術(shù)支持。

2.2.3 其他轉(zhuǎn)基因模型 2011年，WEI等[25]建立的Wnt-10b轉(zhuǎn)基因小鼠模型，能夠表現(xiàn)出顯著的纖維化和皮下脂肪萎縮，與典型的SSc皮膚病變特征相似。Wnt-10b轉(zhuǎn)基因小鼠模型特別適合研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其下游靶點(diǎn)以及脂肪細(xì)胞與真皮成纖維細(xì)胞的相互作用。2014年，MAURER等[26]構(gòu)建的VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型，能夠展現(xiàn)出明顯的皮膚纖維化和增殖性血管病變。VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于研究SSc發(fā)病機(jī)制中血管病變與纖維化的關(guān)系。

2.3 基因敲除模型

2.3.1 uPAR-/-小鼠模型 uPAR是參與ECM重構(gòu)和血管生成的纖溶系統(tǒng)中的關(guān)鍵成分，可表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞以及免疫細(xì)胞等。2014年，MANETTI等[27]建立了uPAR-/-小鼠模型，該模型能夠表現(xiàn)出真皮增厚、非特異性間質(zhì)性肺炎和血管病變；隨后有研究在該模型中發(fā)現(xiàn)了類似SSc相關(guān)心肌病特征的心臟受累[28]。但該模型缺乏免疫學(xué)異常相關(guān)的證據(jù)。

2.3.2 SIRT3基因敲除小鼠模型 SIRT3是一種線粒體定位的脫乙酰酶。有研究表明，SIRT3基因敲除小鼠隨著年齡增長(zhǎng)而自發(fā)出現(xiàn)多個(gè)器官纖維化，如心、肺、肝、腎[29]。PAULIN等[30]研究報(bào)道，SIRT3基因敲除小鼠模型能夠發(fā)生PAH，表現(xiàn)為動(dòng)脈壁增厚、總肺動(dòng)脈阻力增加和右心室肥厚。該模型類似于SSc樣組織纖維化和PAH，這為探討炎癥非依賴性纖維化和肺血管病變的發(fā)病機(jī)制提供了有利條件，但該模型缺乏自身免疫特征。

2.3.3 FLI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型 FLI1是Ⅰ型膠原基因的有效抑制因子。由于FLI1在SSc患者成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞等表達(dá)均顯著降低，已建立了多種細(xì)胞特異性條件的FLI1基因敲除小鼠模型。如上皮細(xì)胞特異性FLI1缺陷(K14Cre；fl/fl)小鼠模型具有多種SSc特征，包括自身免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和組織纖維化，但沒有血管病變特征[31]。此外，有學(xué)者將FLIfiox/flox小鼠與在內(nèi)皮特異性Tie2(Tek)受體啟動(dòng)子控制下表達(dá)Cre重組酶的小鼠雜交，從而獲得內(nèi)皮細(xì)胞特異性FLI1基因敲除小鼠，該小鼠可表現(xiàn)出明顯的血管病變特征[32]，并且參與維持血管穩(wěn)態(tài)的分子表達(dá)下調(diào)[33-34]。但該模型缺乏SSc典型的組織纖維化和自身免疫特征。

KLF5是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SP/KLF家族成員，在腎臟和心臟纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。FLI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型具備SSc的三個(gè)特征：皮膚和肺纖維化、血管病變、B細(xì)胞激活和自身抗體產(chǎn)生[35]。該模型小鼠在1月齡時(shí)可出現(xiàn)小動(dòng)脈狹窄，2月齡時(shí)出現(xiàn)皮膚血管密度減少，3月齡時(shí)出現(xiàn)顯著的真皮纖維化，8月齡時(shí)肺部表現(xiàn)為非特異性間質(zhì)性肺炎、PAH和肺靜脈閉塞性疾病的典型組織學(xué)特征。除了UCD-200小雞模型外，F(xiàn)LI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型是迄今為止模擬人類SSc疾病特征較為全面的動(dòng)物模型。

綜上所述，SSc動(dòng)物模型種類較多，研究者應(yīng)根據(jù)實(shí)際需求選用合適的單一或組合模型，以尋求最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如BLM誘導(dǎo)小鼠模型、Scl-cGVHD小鼠模型主要用于研究SSc早期的炎性反應(yīng)；ROS誘導(dǎo)小鼠模型和TopoⅠ誘導(dǎo)小鼠模型可用于復(fù)制人類彌漫性SSc；幾乎所有模型能夠模擬人類SSc的組織纖維化特征，但以TSK小鼠模型應(yīng)用最廣泛；UCD-200小雞模型、uPAR-/-小鼠模型、SIRT3基因敲除小鼠模型、Fra-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠模型等主要用于SSc血管病變的研究。UCD-200小雞模型和FLI1+/-KLF5+/-雙雜合小鼠模型是目前能夠較為全面地模擬人類SSc疾病特征的模型，但UCD-200小雞為禽類，與人類基因相差甚遠(yuǎn)，且基因模型普遍存在造模技術(shù)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、不宜推廣等弊端。此外，常用的嚙齒類動(dòng)物與人類種屬和免疫學(xué)存在較大差異。因此，仍需進(jìn)一步尋求一種遺傳背景、免疫學(xué)等與人類更為接近、盡可能全面地模擬人類SSc疾病特征且易于推廣的動(dòng)物模型。