免疫評分在結(jié)直腸癌預(yù)后評估中應(yīng)用的研究進展

蔡穎峰，張家偉，鐘曉剛

1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色533000；2 廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院；3 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科

結(jié)直腸癌是全球第三大常見惡性腫瘤，也是惡性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[1]。早診斷、早治療是改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后、減輕人群疾病負(fù)擔(dān)的關(guān)鍵所在。TNM分期是目前評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后最常用的手段，也是選擇治療方案的基礎(chǔ)。然而，TNM分期相同的結(jié)直腸癌患者經(jīng)歷相同或相似的治療方案后，臨床結(jié)局卻存在顯著差別[2]。如大多數(shù)處于TNM分期Ⅱ期的結(jié)直腸癌患者在不使用輔助治療的情況下，手術(shù)切除即可獲得長期無病生存，但約20%患者需要輔助治療才能獲益，甚至部分晚期患者預(yù)后好于早期患者[3]。提示TNM分期在預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后方面存在局限性，其原因是TNM分期只關(guān)注腫瘤細(xì)胞的特征，而忽略腫瘤微環(huán)境和免疫成分的影響，不能全面精確地預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后。有研究報道，腫瘤微環(huán)境內(nèi)宿主細(xì)胞的相互作用，如免疫細(xì)胞浸潤，在腫瘤進展過程中具有至關(guān)重要的作用，與患者預(yù)后密切相關(guān)[4]。近年來，有學(xué)者提出了一種名為“免疫評分(IS)”的腫瘤預(yù)后評估新方法，通過免疫組化技術(shù)將腫瘤微環(huán)境中浸潤的免疫細(xì)胞進行定量，以此來預(yù)測腫瘤患者生存期，并被證實對結(jié)直腸癌患者預(yù)后的預(yù)測效能優(yōu)于TNM分期[5]。本文結(jié)合文獻就IS在結(jié)直腸癌預(yù)后評估中應(yīng)用的研究進展作一綜述。

1 IS概述

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞代謝產(chǎn)物等構(gòu)成。免疫細(xì)胞是腫瘤病變局部主要的細(xì)胞成分，在機體對抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用[6]。免疫細(xì)胞中的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)主要存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)，是腫瘤免疫反應(yīng)的主要參與者。TILs是腫瘤微環(huán)境中最主要的免疫細(xì)胞，在免疫監(jiān)視和免疫耐受中具有重要作用。有學(xué)者通過分析獲得性免疫細(xì)胞在不同腫瘤區(qū)域的類型、功能、密度和位置，發(fā)現(xiàn)其與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，于是提出了“免疫結(jié)構(gòu)”這一概念，用來描述腫瘤微環(huán)境。免疫結(jié)構(gòu)包括腫瘤中心(CT)和侵襲邊緣(IM)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+)、記憶性T淋巴細(xì)胞(CD45RO+)，三級淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)以及一些功能分子，如Th1型細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子和細(xì)胞毒性因子[7]。隨后GALON等[8]通過免疫組化技術(shù)觀察了415例結(jié)腸癌患者CT和IM的原位適應(yīng)性免疫反應(yīng)，然后采用病理圖像分析儀器對免疫細(xì)胞CD3+、CD8+、GZMB+、CD45RO+的免疫染色進行定量，發(fā)現(xiàn)未復(fù)發(fā)患者CT和IM的免疫細(xì)胞密度(CD3+、CD8+、GZMB+和CD45RO+)均高于復(fù)發(fā)患者，并且CD3+、CD8+、CD45RO+T淋巴細(xì)胞高密度與較長的無病生存期(DFS)和總生存期(OS)密切相關(guān)。

基于上述理論，GALON等[9]提出了“IS”這一概念，通過量化腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的密度來預(yù)測患者預(yù)后，并最先在結(jié)直腸癌患者中展開研究。一個國際共識小組就IS的預(yù)測效能進行研究發(fā)現(xiàn)，由CD3+、CD8+、CD45RO+、GZMB+T淋巴細(xì)胞密度等組成的IS是評估患者預(yù)后最好的方法。由于CD45RO背景染色和GZMB顆粒染色技術(shù)困難，故而采用最簡單的膜染色(CD3+和CD8+)，并且這兩個標(biāo)記物在CT和IM區(qū)域的應(yīng)用已在臨床實踐中得到驗證[10]。IS的具體方法：首先對同時包含CT和IM區(qū)域的腫瘤組織進行切片，分別對切片進行CD3、CD8免疫組化染色；然后通過IS分析系統(tǒng)進行圖像分析，精確定量CT和IM區(qū)域的CD3+、CD8+TILs密度，確定最佳臨界值并劃分為高密度和低密度，高密度為1分、低密度為0分；最后將CD3+、CD8+TILs密度在CT和IM區(qū)域的評分相加，即得到IS(總分0～4分)。IS除了在結(jié)直腸癌患者預(yù)后預(yù)測中具有重要的應(yīng)用價值外，在預(yù)測治療效果方面亦同樣具有重要價值。

2 IS在結(jié)直腸癌預(yù)后評估中的應(yīng)用

2.1 IS在非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的應(yīng)用 為了促進IS在非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的應(yīng)用，一項由癌癥免疫治療協(xié)會牽頭的，由13個國家14個中心合作完成的，主要評估IS對TNM分期Ⅰ～Ⅲ期結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)時間(TTR)的預(yù)測價值。該研究2 681例結(jié)腸癌患者被隨機分配到訓(xùn)練集700例、內(nèi)部驗證集636例和外部驗證集1 345例，對每例患者CT和IM區(qū)域石蠟切片進行免疫組化處理后，定量檢測CD3+、CD8+TILs密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在訓(xùn)練集中，高、中、低IS的結(jié)腸癌患者5年復(fù)發(fā)率分別為8%、19%、32%，高IS的結(jié)腸癌患者5年復(fù)發(fā)風(fēng)險最低，并且這一結(jié)論在內(nèi)、外部驗證集中均得到驗證[11]。這一結(jié)果表明，在評估結(jié)腸癌患者TTR、DFS和OS的準(zhǔn)確性方面，IS顯著優(yōu)于TNM分期。一項關(guān)于IS在TNM分期Ⅲ期結(jié)腸癌患者預(yù)后預(yù)測價值的隊列研究，評估了來自隊列1(加拿大、美國)和隊列2(歐洲、亞洲)的763例TNM分期Ⅲ期結(jié)腸癌患者的IS，主要觀察終點是TTR，次要觀察終點為OS、DFS、微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)(MSS)患者預(yù)后以及對化療效果的預(yù)測價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中、高IS的結(jié)腸癌患者3年無復(fù)發(fā)率分別為56.9%、65.9%、76.4%，高IS與結(jié)腸癌患者較長的TTR、OS和DFS顯著相關(guān)，在MSS患者中亦發(fā)現(xiàn)高IS與較長的TTR顯著相關(guān)；接受化療的結(jié)腸癌患者5年復(fù)發(fā)率為32.3%，未接受化療患者為50.6%，并且無論是低?；颊哌€是高?；颊?，化療與高IS的結(jié)腸癌患者存活率顯著相關(guān)，就復(fù)發(fā)風(fēng)險而言，高IS的結(jié)腸癌患者在化療中獲益最大[12]。上述研究結(jié)果表明，IS不僅可預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后，還能預(yù)測患者對化療的反應(yīng)。此外，一項對TNM分期Ⅲ期結(jié)腸癌患者進行為期3、6個月的mFOLFOX(氟尿嘧啶/亞葉酸鈣+奧沙利鉑)輔助化療發(fā)現(xiàn)，6個月療程的mFOLFOX化療方案效果要優(yōu)于3個月療程的該化療方案[13]。在此基礎(chǔ)上，PAGES等[14]對1 322例TNM分期Ⅲ期結(jié)腸癌患者進行IS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中、高IS的結(jié)腸癌患者在6個月療程的mFOLFOX化療方案中獲益明顯，包括低危和高危的結(jié)腸癌患者；而低IS的結(jié)腸癌患者在3、6個月療程的mFOLFOX化療方案中均未明顯獲益。由此可見，IS可用于優(yōu)化TNM分期Ⅲ期結(jié)腸癌患者的輔助治療決策。

2.2 IS在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中的應(yīng)用 約50%結(jié)直腸癌患者在就診時已發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,并且肝切除術(shù)后超過一半患者在兩年內(nèi)復(fù)發(fā)，這些復(fù)發(fā)患者的5年存活率只有37%～58%[15]。目前，臨床風(fēng)險評分(CRS)、IS等評分系統(tǒng)已被廣泛用于預(yù)測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移(CRLM)患者預(yù)后。在可切除的CRLM患者中，腫瘤細(xì)胞與周圍肝實質(zhì)交界面的組織病理學(xué)生長模式(HGP)主要有3種：促結(jié)締組織增生型HGP(dHGP)、替換型HGP(rHGP)、推進型HGP(pHGP)。其中，dHGP在促結(jié)締組織增生邊緣和正常肝臟的交界處通常可觀察到密集的淋巴細(xì)胞浸潤，肝切除術(shù)后患者預(yù)后良好[16]。LIANG等[17]對166例CRLM患者HE染色切片中的HGP進行評估后發(fā)現(xiàn)，dHGP患者CT和IM區(qū)域中浸潤的CD3+、CD8+TILs密度高于非dHGP，并且dHGP患者無復(fù)發(fā)生存期(RFS)、OS較非dHGP患者明顯延長，dHGP是獨立于IS和CRS的CRLM患者有利預(yù)后因素。聯(lián)合HGP、IS和CRS的風(fēng)險評分能夠?qū)Ω吻谐g(shù)后CRLM患者的生存狀況進行分層，可作為一種預(yù)測CRLM患者預(yù)后的指標(biāo)。BALDIN等[18]對221例不同術(shù)前治療的CRLM患者臨床病理特征和IS進行評估，在多變量分析中發(fā)現(xiàn)，IS和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、手術(shù)切緣、HGP和脂肪性肝炎等臨床病理特征與患者術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。低病理學(xué)評分(PS)和高IS的CRLM患者復(fù)發(fā)風(fēng)險最低，而高PS和低IS的CRLM患者預(yù)后最差。無論PS如何，高IS的CRLM患者較低IS的CRLM患者生存期明顯延長。結(jié)合PS和IS可以對TNM分期Ⅳ期結(jié)直腸癌患者預(yù)后進行分層，并識別復(fù)發(fā)風(fēng)險較高的患者。WANG等[19]對249例CRLM患者進行IS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IS>2分的CRLM患者RFS和OS較IS≤2分的CRLM患者明顯延長。利用ROC曲線評估CRS和IS對預(yù)后預(yù)測的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IS在預(yù)測OS方面較CRS顯示出更高的價值。IS可作為CRS的補充，用于預(yù)測肝切除術(shù)后CRLM患者預(yù)后。VAN DEN EYNDE等[20]對轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤的免疫細(xì)胞類型進行量化發(fā)現(xiàn)，小的轉(zhuǎn)移瘤通常IS較低，而IS高的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量較少；較高的IS與患者較長的生存期和較低的復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的另一個組成部分，對腫瘤微環(huán)境形成具有重要作用[21]。當(dāng)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中被激活時，被極化成M1、M2型。M2型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生血管生成因子和細(xì)胞生長因子，形成有利于腫瘤生長的環(huán)境[22]。KWAK等[23]采用免疫組化技術(shù)和數(shù)字圖像分析儀對196例晚期結(jié)直腸癌患者石蠟包埋組織的原發(fā)灶CT、IM和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶(DM)進行檢測，通過量化結(jié)直腸癌原發(fā)灶CT和IM中CD3+、CD8+TILs密度獲得IS，分別在IS中加入DM的CD3+、CD8+TILs評分以及原發(fā)灶CT和IM的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163評分，得到IS-轉(zhuǎn)移性模型(IS-M)和IS-巨噬細(xì)胞—附加性IS模型(IS-ma)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IS、IS-M和IS-ma評分越高，晚期結(jié)直腸癌患者生存率越高，預(yù)后越好；多因素分析顯示，只有IS-M是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立預(yù)測指標(biāo)。包含DM CD3+、CD8+TILs密度的IS-M預(yù)測晚期結(jié)直腸癌患者預(yù)后的效能要優(yōu)于IS或IS-ma。對于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，RAS突變通常被用作抗EGFR治療效果的重要預(yù)測因子。LIU等[24]檢測了60例接受姑息性手術(shù)的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的RAS突變、IS和PD-L1表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高IS患者中，RAS野生型患者預(yù)后相對較好；Kaplan-Meier生存分析顯示，RAS野生型患者OS長于RAS突變型患者，PD-L1高表達的RAS野生型患者預(yù)后更好。對于接受姑息性手術(shù)且PD-L1陰性表達的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，RAS突變是預(yù)后不良的一個重要因素。聯(lián)合IS、PD-L1表達和RAS突變狀態(tài)可作為接受姑息性手術(shù)后轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。因此，IS可作為預(yù)測轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

2.3 IS在結(jié)直腸癌生物標(biāo)記物中的應(yīng)用 伴微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)的結(jié)直腸癌有較高的免疫細(xì)胞浸潤，可預(yù)示患者預(yù)后較好。有研究發(fā)現(xiàn)，IS在預(yù)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)和生存方面要優(yōu)于MSI。通過IS對免疫狀態(tài)的評估提供了一個超越MSI預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)的有效指標(biāo)，這可能對免疫治療選擇具有重要的指導(dǎo)意義[5]。MSI通常是由一組微衛(wèi)星標(biāo)記決定，其本質(zhì)一般是單核苷酸，而在四核苷酸的微衛(wèi)星中發(fā)現(xiàn)了另一種MSI形式，并命名為EMAST[25]。EMAST在體外與錯配修復(fù)(MMR)特異性成員MSH3表達下調(diào)有關(guān)，而MSH3能夠參與MMR中長內(nèi)陷的修復(fù)[26]。WATSON等[27]篩選了149例接受手術(shù)治療的TNM分期Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，通過免疫組化技術(shù)和PCR技術(shù)分析這些患者PD-L1、EMAST表達并結(jié)合IS進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EMAST陽性患者擁有較高的IS和PD-L1表達，并且EMAST陽性患者DFS、疾病特異性生存期(DSS)、OS明顯延長。IS和PD-L1表達均較低的腫瘤在腫瘤微環(huán)境中缺乏免疫反應(yīng)，并且復(fù)發(fā)率更高，復(fù)發(fā)時間更早。在MSI中結(jié)合IS能夠更好地預(yù)測結(jié)直腸癌患者生存期。Claudins是參與緊密連接形成的完整膜蛋白，具有調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖、分化和遷移等作用，其在各種惡性上皮性腫瘤中表達上調(diào)[28]。有研究發(fā)現(xiàn)，高IS的結(jié)直腸癌患者Claudin-1表達缺失率明顯降低，Claudin-1表達缺失的結(jié)直腸癌患者比存在Claudin-1表達的結(jié)直腸癌患者預(yù)后更差，故Claudin-1表達缺失可用于預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后[29]。腫瘤微環(huán)境能夠影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。腫瘤進展位點2(TPL2)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠通過激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等[30]。TPL2可能通過與腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。PYO等[31]對262例結(jié)直腸癌患者構(gòu)建組織芯片，檢測TPL2表達并評估IS，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TPL2高表達者比TPL2低表達者更易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，TPL2高表達與結(jié)直腸癌患者較差的生存期和低IS有關(guān)。結(jié)果表明，TPL2表達可作為判斷結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一，并有可能成為免疫治療的一個重要靶點。一項分析程序性死亡蛋白配體2(PD-L2)在結(jié)直腸癌組織表達和預(yù)后作用中的研究，通過IS來評估TILs對PD-L2表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在免疫細(xì)胞中PD-L2表達與良好的腫瘤生物學(xué)行為和較高的生存率顯著相關(guān)；免疫細(xì)胞PD-L2表達和PD-L1表達呈正相關(guān)關(guān)系；高IS的結(jié)直腸癌患者免疫細(xì)胞PD-L2表達明顯高于低IS的結(jié)直腸癌患者，但高IS的結(jié)直腸癌患者腫瘤細(xì)胞PD-L2表達并不高于低IS的結(jié)直腸癌患者[32]。免疫細(xì)胞存在PD-L2表達的結(jié)直腸癌患者，無論是低pTNM分期還是高pTNM分期，預(yù)后均較好。免疫細(xì)胞PD-L2表達是結(jié)直腸癌患者預(yù)后較好的獨立預(yù)測因子，是一個潛在的治療靶點。以上研究表明，評估免疫狀態(tài)的IS能夠協(xié)助發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物以及挖掘潛在的治療靶點。

2.4 IS結(jié)合其他技術(shù)在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用 由于IS只計算CD3+、CD8+TILs密度，并不能全面反映腫瘤局部免疫狀況，需要結(jié)合其他技術(shù)來完善IS。越來越多研究者采用CIBERSORT算法來評估免疫微環(huán)境，通過從組織樣本中提取RNA測序數(shù)據(jù)來分析免疫細(xì)胞組分[33]。WANG等[34]應(yīng)用CIBERSORT算法最終選取了13種免疫細(xì)胞來構(gòu)建新型IS模型，將875例結(jié)直腸癌患者按7∶3分配到訓(xùn)練集和測試集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在訓(xùn)練集和測試集中高新型IS的結(jié)直腸癌患者RFS明顯低于低新型IS的結(jié)直腸癌患者；多變量Cox回歸分析顯示，新型IS是結(jié)直腸癌患者RFS的獨立預(yù)測因子。該新型IS為結(jié)直腸癌患者無復(fù)發(fā)評估和風(fēng)險分層提供了新的見解。人工智能可用于分析虛擬顯微圖像，并以較高的準(zhǔn)確性來判斷患者預(yù)后和腫瘤分子特征[35]。REICHLING等[36]研發(fā)了一個人工智能軟件，對1 018例PETACC08隊列TNM分期Ⅲ期結(jié)腸癌患者CD3、CD8染色玻片上的CT和IM區(qū)域T淋巴細(xì)胞密度和表面積自動定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CT區(qū)域CD3+T淋巴細(xì)胞密度對患者預(yù)后的預(yù)測價值與經(jīng)典的IS相似。將IM區(qū)域間質(zhì)面積、DGMate(數(shù)字腫瘤參數(shù))和CT區(qū)域CD3+T淋巴細(xì)胞密度組合，并命名為DGMuneS，其在評估患者預(yù)后效能方面優(yōu)于IS。結(jié)果表明，在結(jié)直腸癌患者預(yù)后中，腫瘤基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在變量以及與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)的因素均應(yīng)被考慮在內(nèi)。DAWSON等[37]定義了一種新的評分方法——腫瘤出芽/T淋巴細(xì)胞評分(BTS)，即腫瘤出芽數(shù)除以T淋巴細(xì)胞數(shù)量，對345例TNM分期Ⅰ～Ⅳ期結(jié)直腸癌患者腫瘤組織芯片進行全細(xì)胞角蛋白及分別與CD3、CD8、CD45RO雙重免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，較高的BTS比腫瘤出芽或CD8/CD3單獨預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效果更好。因此，在IS基礎(chǔ)上結(jié)合其他技術(shù)有望提高結(jié)直腸癌患者預(yù)后評估的準(zhǔn)確性。

綜上所述，IS是一種方便、快捷、穩(wěn)定、經(jīng)濟的結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測方法，其預(yù)后預(yù)測效能優(yōu)于TNM分期。IS不僅可用于預(yù)測非轉(zhuǎn)移性或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者預(yù)后，還可用于預(yù)測免疫治療或輔助化療效果，指導(dǎo)個體化精準(zhǔn)治療策略。此外，IS還能協(xié)助發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物以及挖掘潛在的治療靶點。不斷地探索IS結(jié)合其他新技術(shù)，能夠彌補IS的不足，未來期望能夠優(yōu)化出一個綜合考慮腫瘤內(nèi)環(huán)境各項因素的預(yù)后評分系統(tǒng)。目前，IS已被引入歐洲腫瘤內(nèi)科學(xué)會結(jié)腸癌臨床實踐指南和世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類，這為IS在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用鋪平了道路。