鹿作為生物醫(yī)學(xué)模型的研究進(jìn)展

孫紅梅，金美伶，路曉，李春義

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130112)

在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)發(fā)展過程中，動(dòng)物模型起到了不可磨滅的作用。尤其是哺乳動(dòng)物，在進(jìn)化關(guān)系上與人類最近，更是研究者們所青睞的。鹿為偶蹄目有角的反芻動(dòng)物，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鹿茸是名貴中藥材，鹿肉可食用，鹿皮可制革，目前，國(guó)內(nèi)、外已大量進(jìn)行人工飼養(yǎng)。此外，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，鹿所產(chǎn)的鹿茸還是非常獨(dú)特的研究模型。首先，鹿茸作為目前所知的唯一一個(gè)能夠周期性完全再生的哺乳動(dòng)物器官，可以為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了解哺乳動(dòng)物器官再生的研究模型；鹿茸成骨過程與長(zhǎng)骨形成過程相似，且含血管軟骨具有快速生長(zhǎng)、完全再生的特性，可以為長(zhǎng)骨生長(zhǎng)及關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)研究提供優(yōu)秀的研究模型；鹿角柄(著生于鹿頭部額骨的永久性骨樁，鹿茸角在其上脫落與再生)的無傷疤愈合現(xiàn)象可以為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究傷口愈合提供模型；此外，鹿茸骨化期鹿體骨骨質(zhì)疏松，但骨化后很快恢復(fù)正常水平的現(xiàn)象也為骨質(zhì)疏松的治療提供了很好的研究契機(jī)。

1 鹿茸作為再生醫(yī)學(xué)模型

近年來，再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展為機(jī)體損傷組織和器官的再生帶來了新的希望。最引人注目的器官再生莫過于割處再生(Epimorphic regeneration)[1]。至今我們對(duì)割處再生的了解主要來自于低等脊椎動(dòng)物，特別是兩棲類，如蠑螈斷肢再生的研究[2]。這些動(dòng)物之所以能夠?qū)崿F(xiàn)斷肢再生，是由于位于其肢體殘樁斷面的已完全分化的細(xì)胞有進(jìn)行反分化變成胚胎樣細(xì)胞的能力[3]。這些胚胎樣細(xì)胞隨后在愈合的表皮之下進(jìn)行分裂并積聚，在斷面上形成一個(gè)錐形體。這個(gè)錐形體被稱為胚芽(Blastema)。這個(gè)胚芽就具備了完全再生出失去那部分肢體的潛力[4]。因此，兩棲類斷肢再生被稱為基于胚芽的割處再生[5]。哺乳動(dòng)物肢體殘樁斷面的細(xì)胞是否也存在著這種反分化的潛力，如果要刺激哺乳動(dòng)物割處再生是否也要首先誘導(dǎo)胚芽的生成才能實(shí)現(xiàn)目前還不清楚。而鹿茸是目前所知的唯一一種在自然情況下能夠周期性完全再生的復(fù)雜哺乳動(dòng)物器官[6]，為我們提供了一個(gè)難得的了解自然界是怎樣解決哺乳動(dòng)物器官再生的機(jī)會(huì)。鹿茸的再生是以年為周期的[7]。每年春天，鹿茸在鹿角(完全骨化的鹿茸)脫落后由角柄(著生于鹿頭部額骨上的永久性骨樁)處開始再生；春末夏初，再生的鹿茸進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，其生長(zhǎng)速度可達(dá)2cm/d；到了秋季，鹿茸生長(zhǎng)由于茸組織的快速骨化而中止。其后茸皮干枯、剝落，露出堅(jiān)硬的骨角，這時(shí)的鹿茸就變成了鹿角；在冬季，裸露的死骨角牢牢地附著在活組織角柄上；直到第2年春天，鹿角才由角柄上脫落，這就又觸發(fā)了新一輪的鹿茸再生。

鹿茸具有驚人的再生能力，因此，引起了廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注。近年來，通過對(duì)鹿茸的形態(tài)[8]、組織學(xué)[9]以及細(xì)胞生物學(xué)的研究，探討了鹿茸再生的機(jī)制，結(jié)果表明，鹿茸再生的生長(zhǎng)中心由有限的被激活的角柄末端骨膜細(xì)胞所形成。鹿的角柄骨膜是鹿茸再生的關(guān)鍵組織。為了揭示為什么如此有限的角柄骨膜細(xì)胞(由立體組織學(xué)得出約3.3百萬個(gè))在這么短暫的時(shí)間內(nèi)(約60d)能再生出近10kg重的復(fù)雜鹿茸組織的機(jī)制，許多研究者從不同的角度對(duì)角柄骨膜細(xì)胞進(jìn)行了深入地研究[8，10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的一些特性。例如表達(dá)關(guān)鍵的胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物Oct4、Nanog、CD9、Telomerase和Nucleostemin，這就解釋了為什么角柄骨膜細(xì)胞具有自我更新能力和巨大的分裂潛力。另外，角柄骨膜細(xì)胞能在離體條件下被誘導(dǎo)分化成成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌纖維細(xì)胞和神經(jīng)樣細(xì)胞，這就解釋了為什么能由角柄骨膜細(xì)胞再生出復(fù)雜的含有神經(jīng)、血管和不同發(fā)育階段的軟骨及骨組織的鹿茸。因此得出結(jié)論，鹿茸再生是基于干細(xì)胞的割處再生，鹿茸再生的干細(xì)胞存在于角柄的骨膜中。鹿茸再生從本質(zhì)上不同于基于胚芽再生的兩棲類斷肢再生[11]。

鹿茸的再生開始于鹿角脫落。鹿角脫落后，角柄末端留下一個(gè)碩大的傷口，角柄皮膚整層向心生長(zhǎng)，逐漸覆蓋角柄斷端，同時(shí)角柄末端的角柄骨膜細(xì)胞被激活，分化形成鹿茸的生長(zhǎng)中心，支持鹿茸的再生，最后形成鹿茸的主干和眉枝。鹿茸的再生過程與老鼠斷肢的愈合過程非常相似，老鼠長(zhǎng)骨砍斷之后，傷口處長(zhǎng)骨的斷端死掉，也是斷肢整層皮膚向傷口中心遷移，同時(shí)激活長(zhǎng)骨骨膜細(xì)胞，分化形成軟骨，軟骨向長(zhǎng)骨開口處遷移，逐漸將傷口封閉，最后變成骨質(zhì)。與鹿茸再生不同之處僅在于，老鼠長(zhǎng)骨傷口愈合后軟骨停止了生長(zhǎng)，不能再生出新的長(zhǎng)骨。因此，研究鹿茸的再生，對(duì)老鼠等哺乳動(dòng)物斷肢再生具有一定的指導(dǎo)意義。

作為雄性鹿的副性器官(馴鹿除外)，鹿茸再生受到鹿體內(nèi)雄激素水平的控制[12]。Li等的薄膜插入試驗(yàn)和裸鼠異體移植試驗(yàn)揭示[13，14]，鹿茸再生是鹿體內(nèi)雄激素水平降到一定臨界值以下時(shí)所觸發(fā)的角柄骨膜細(xì)胞和包裹角柄的皮膚細(xì)胞間相互作用的結(jié)果。角柄骨膜細(xì)胞誘導(dǎo)角柄皮膚表皮變成鹿茸表皮；反過來，鹿茸表皮細(xì)胞的反饋信號(hào)激活了角柄骨膜細(xì)胞的快速分裂繁殖，從而形成再生鹿茸的生長(zhǎng)中心。角柄骨膜和皮膚細(xì)胞間的相互作用是鹿茸再生所必須的，而這種相互作用是通過交換游離的小分子物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)的。因此，鑒別和分離出這些參與鹿茸再生過程的游離小分子物質(zhì)，不但對(duì)研究哺乳動(dòng)物器官再生的機(jī)制具有重要意義，而且也可能是實(shí)現(xiàn)除鹿茸以外其他哺乳動(dòng)物(包括人在內(nèi))器官再生的有效途徑之一。今天的再生醫(yī)學(xué)已清楚地證明哺乳動(dòng)物同樣存在著組織和器官再生的潛力，研究如何去激活這種潛力是當(dāng)代再生醫(yī)學(xué)的任務(wù)之所在[14～17]。研究認(rèn)為，使用刺激鹿茸再生的物質(zhì)可能是激活哺乳動(dòng)物器官再生潛力的有效方法之一。因此，對(duì)鹿茸再生機(jī)理的研究，有利于為哺乳動(dòng)物乃至人類斷肢的再生開辟有效途徑。

2 鹿茸作為骨發(fā)育及軟骨損傷修復(fù)模型

鹿茸是一個(gè)骨質(zhì)性器官，生長(zhǎng)于體外，易于觀察，成對(duì)出現(xiàn)呈鏡像對(duì)稱，具備作為研究模型的主要特性，而且其組織的發(fā)生與骨骼骨質(zhì)的發(fā)生是相同的，包括膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨2種成骨形式，但茸骨組織的形成是膜內(nèi)成骨還是軟骨內(nèi)成骨，許多專家觀點(diǎn)不一。有些人認(rèn)為是由膜內(nèi)成骨而來；有些人認(rèn)為是由軟骨內(nèi)成骨而來；還有的人認(rèn)為是既有膜內(nèi)成骨，又有軟骨內(nèi)成骨[18，19]。Banks等[20]通過組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)此做了詳盡的研究，得出鹿茸組織是由不同于典型軟骨內(nèi)成骨的特殊的軟骨內(nèi)成骨而來，其標(biāo)志是角柄頂端軟骨膜下出現(xiàn)連續(xù)的骨小梁。在整個(gè)生茸期內(nèi)，軟骨膜持續(xù)存在，通過附加增生來實(shí)現(xiàn)鹿茸的生長(zhǎng)。發(fā)育到一定程度的肥大軟骨細(xì)胞向細(xì)胞間質(zhì)中分泌X型膠原纖維等，引起間質(zhì)的鈣化，進(jìn)而骨組織替換軟骨組織。與長(zhǎng)骨的形成相比，鹿茸的組織結(jié)構(gòu)分化非常細(xì)致，既包括成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，又包括前成軟骨細(xì)胞和前成骨細(xì)胞。研究鹿茸軟骨內(nèi)成骨的發(fā)生機(jī)制可為研究長(zhǎng)骨的骨化機(jī)制、骨質(zhì)疏松病發(fā)病機(jī)理提供一些重要的理論依據(jù)。

眾所周知，軟骨是唯一沒有血管分布且細(xì)胞組成很單一的一種獨(dú)特組織[21]，具有很強(qiáng)的抗壓、抗撞擊能力。也正因?yàn)槿绱耍浌墙M織幾乎喪失了自我修復(fù)能力[22]。因此，臨床上修復(fù)軟骨損傷的途徑和方法以導(dǎo)入脈管系統(tǒng)或移植細(xì)胞到受損部位為核心[23]。為了獲得脈管系統(tǒng)，許多研究者通過軟骨下骨鉆孔來使軟骨暴露給血管，驅(qū)動(dòng)內(nèi)部軟骨修復(fù)，然而這種途徑驅(qū)動(dòng)軟骨形成只能提供暫時(shí)的纖維軟骨環(huán)，而不具備持久的生物學(xué)功能[24]；一些研究者也曾嘗試著采用多種方法移植細(xì)胞到受損關(guān)節(jié)軟骨，然而，這些修復(fù)過程缺乏移植組織與宿主組織之間的完全融合，愈后結(jié)果都不理想[25，26]。目前為止，仍然沒有一個(gè)已證明的令人信服的通用方法能將損傷的軟骨修復(fù)到正常功能水平[27]。

鹿茸軟骨是非常獨(dú)特的軟骨組織，它不僅在自然條件下能夠修復(fù)、再生，而且每年以一種驚人的速度(可達(dá)2cm/d)再生[4，5]。研究表明，鹿茸具有這種能力主要原因就是鹿茸軟骨結(jié)構(gòu)比較獨(dú)特，軟骨組織內(nèi)分布著大量的血管網(wǎng)[28，29]。與體骨的軟骨內(nèi)骨化過程不同，鹿茸軟骨形成與血管形成是一體的，間充質(zhì)細(xì)胞分化首先形成含有血管的前骨質(zhì)，然后被骨所替代，不經(jīng)歷血管侵入的過程。由于鹿茸軟骨含有血管的特性，鹿茸的前骨質(zhì)組織是否為真正的軟骨這一問題在20世紀(jì)中期一直存在爭(zhēng)議。為了弄清楚這一問題，Banks和Frasier[30]分別進(jìn)行了鹿茸超微結(jié)構(gòu)和鹿茸軟骨基質(zhì)的免疫化學(xué)研究，確定了鹿茸前骨質(zhì)組織具有軟骨的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，得出鹿茸的含血管前骨組織為真正的軟骨結(jié)論[20，31，32]。鹿茸含血管軟骨的形成是鹿茸快速生長(zhǎng)期高代謝水平的需要。鹿在進(jìn)化的過程中，以鹿茸作為第二性征，為了在發(fā)情季節(jié)使用鹿茸作為爭(zhēng)奪配偶的武器，鹿必須在有限的時(shí)間內(nèi)完成大量的(對(duì)馬鹿來說，鹿茸將近1m高)骨質(zhì)器官——鹿茸的快速生長(zhǎng)[33]。形成骨組織最快的方式莫過于軟骨內(nèi)骨化(先形成軟骨，然后通過軟骨重塑被骨所替換)，但是軟骨組織有它的缺點(diǎn)，即無血管特性，只能通過擴(kuò)散獲得營(yíng)養(yǎng)，而擴(kuò)散距離終究是有限的。按常規(guī)理論，為了按時(shí)完成鹿茸的快速生長(zhǎng)，間充質(zhì)細(xì)胞必須以絕對(duì)快的速度增殖，然后分化成軟骨，這樣就需要軟骨重塑和成骨替換過程與之保持相同的速度，以保證深層細(xì)胞獲得充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。然而，鹿茸的形成并不完全遵循這樣的過程，在鹿茸生長(zhǎng)中心保留著大量的軟骨，鹿茸創(chuàng)造了一種允許間充質(zhì)細(xì)胞在低氧環(huán)境的軟骨中心分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成血管系統(tǒng)的途徑，這樣不僅保持了軟骨的快速形成，也不會(huì)因滯后的軟骨重塑和骨替換而抑制鹿茸的快速生長(zhǎng)。如果將鹿茸再生來源的骨膜組織移植到裸鼠體內(nèi)或者彌散腔中，限制鹿茸干細(xì)胞的分裂分化速度，結(jié)果這些細(xì)胞可以分化成無血管的常規(guī)軟骨[34，35]。因此，鹿茸含血管軟骨的形成是鹿茸完成快速生長(zhǎng)的需要。鹿茸生長(zhǎng)速度越快，血管形成也就越多。因此，對(duì)鹿茸軟骨及軟骨內(nèi)血管形成機(jī)制的研究，可以為軟骨損傷修復(fù)打開一個(gè)新的通路。

3 無傷疤傷口愈合模型

鹿茸的再生是由角柄末端傷口愈合開始的。大型鹿種(如赤鹿和馬鹿)的角柄末端傷口直徑可達(dá)60mm～70mm(最大的可達(dá)10cm)。形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明[31]，鹿角脫落后，角柄末端周圍的皮膚開始在斷面上向心生長(zhǎng)。與角柄的皮膚(典型的頭皮)相比，新生皮膚具有被毛稀疏并具光澤的明顯不同特性，即為包裹未來鹿茸的茸皮。鹿角脫落2d～3d后，角柄傷口愈合已接近中期，中央為新生茸皮圍繞的結(jié)痂；3d～4d后，傷口愈合接近晚期，中央部的結(jié)痂進(jìn)一步縮小；4d～5d后，傷口愈合達(dá)到末期，中央部的結(jié)痂幾乎全部消失。這種巨型傷口不僅能在5d左右的時(shí)間完全愈合，而且?guī)缀跏菬o傷疤的完美愈合。角柄的傷口愈合現(xiàn)象令人吃驚。對(duì)茸皮和角柄皮膚所進(jìn)行的組織學(xué)比較研究[36，37]表明，茸皮具有比角柄皮膚更厚的表皮層和更大且多葉的皮脂腺，具有不同發(fā)育階段的毛囊組織，但不具汗腺和豎毛肌。另外，茸皮血管的管壁更厚，管腔更小，神經(jīng)纖維與角柄的基本相同。因此，雖然茸皮與角柄皮膚存在明顯差異，但茸皮應(yīng)當(dāng)屬于一種正常有序的生理皮膚，而不是一種傷疤(以Ⅰ型膠原纖維為主的無序組織)。所以，鹿茸再生早期的傷口愈合應(yīng)該是名副其實(shí)的無傷疤傷口愈合。研究表明，鹿茸再生早期之所以能夠?qū)崿F(xiàn)快速無傷疤傷口愈合是由于角柄骨膜的存在[37]。如果在傷口愈合開始前將角柄骨膜剔除，角柄皮膚會(huì)沿著角柄骨干向近心端收縮，暴露出末端無骨膜的角柄骨質(zhì)突，導(dǎo)致角柄末端傷口愈合失?。蝗绻每p合線收緊角柄末端皮膚以阻止角柄皮膚收縮，可促進(jìn)該傷口愈合，但愈合的最終結(jié)果是傷疤；如果只切開角柄皮膚，但不剔除角柄骨膜，不但完成了無傷疤傷口愈合，而且再生出了一個(gè)多分支的鹿茸。這個(gè)結(jié)果證明了角柄骨膜是導(dǎo)致無傷疤傷口愈合的關(guān)鍵組織。要想使角柄傷口無傷疤愈合模型有效地應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，必須清楚無傷疤傷口愈合是角柄皮膚的固有特性還是后天獲得的屬性。為此，Li等進(jìn)行了角柄骨膜移植試驗(yàn)，結(jié)果移植的骨膜使異位正常皮膚(不具備無傷疤傷口愈合的能力)獲得了無傷疤傷口愈合的能力。因此證明，角柄皮膚無傷疤愈合的能力是由角柄骨膜誘導(dǎo)后獲得的，而不是先天固有的。同時(shí)，研究還證明了角柄骨膜分泌的誘導(dǎo)物質(zhì)不具有種的特異性，其不僅對(duì)鹿的皮膚有效，對(duì)大鼠的傷口愈合速度和愈合質(zhì)量也有明顯改善。給藥12d后，處理組傷口愈合已達(dá)96%且無明顯傷疤，而對(duì)照組愈合面積僅為76%并具有明顯傷疤。這一發(fā)現(xiàn)有可能為治療如糖尿病人的傷口等慢性難愈合的傷口開辟新的候選藥物。

4 鹿體骨骨質(zhì)疏松/礦物質(zhì)沉積模型

鹿茸在快速生長(zhǎng)過程中，骨組織的生長(zhǎng)需要大量的礦物質(zhì)。在生茸骨化期，鹿體骨主要骨骼中的礦物質(zhì)會(huì)發(fā)生劇烈地變化，在7月份馴鹿鹿茸快速生長(zhǎng)階段，其肋骨是多孔的、活躍的，并有高的流通率，經(jīng)歷著骨損失，這些損失最后在鹿茸生長(zhǎng)停止時(shí)得到補(bǔ)償。鹿體內(nèi)發(fā)生脫礦作用越大的骨骼，在茸角骨化后恢復(fù)過程亦發(fā)生得越強(qiáng)烈。Banks研究發(fā)現(xiàn)，黑尾鹿在鹿茸生長(zhǎng)季節(jié)出現(xiàn)相似的情形，并將其描述為生理性骨質(zhì)疏松[20]。黑尾鹿在鹿茸生長(zhǎng)和骨化期內(nèi)，無論飼料中礦物質(zhì)多么豐富，其肋骨、掌骨和脛骨的外層密質(zhì)骨都經(jīng)歷一次周期性地疏松變化，這些骨骼的重吸收點(diǎn)均隨茸角骨化的加快而明顯增多，骨質(zhì)密度顯著下降。茸角完全骨化后，黑尾鹿體骨骼又會(huì)重新沉積礦物質(zhì)，使已變得疏松的密質(zhì)骨重新恢復(fù)到正常狀態(tài)，說明茸角中沉積的礦物質(zhì)除了部分來源于飼料外，主要來源于鹿體的骨骼，在茸角骨化結(jié)束后能很快從飼料中得到補(bǔ)償。因此，對(duì)鹿周期性體骨骨質(zhì)疏松及礦物質(zhì)沉積機(jī)制的研究，有利于為人類骨質(zhì)疏松疾病的治療開辟新的突破口。

除此之外，鹿還有很多生物學(xué)特性可以作為研究模型來開發(fā)利用。如鹿的遠(yuǎn)緣雜交后代可育特性；鹿角脫落后，如此大的傷口在完全開放的鹿場(chǎng)條件下不感染發(fā)炎等特性。可見，鹿作為研究模型具有廣闊的應(yīng)用前景。

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