牙髓再生支架材料的研究進(jìn)展

周易 趙玉鳴

北京大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科 北京100081

牙髓再生這一概念已經(jīng)存在了幾十年。1971年，Nygaard-?stby和Hjortdal[1]提出了再生牙髓組織的概念。牙髓再生治療的定義為：利用組織工程學(xué)原理，以健康的新生牙髓取代已感染或壞死的牙髓組織，從而恢復(fù)正常的牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能的治療手段。作為治療年輕恒牙牙髓壞死的新技術(shù)，牙髓再生治療可使未發(fā)育完全的根尖孔閉合，根管壁增厚，牙根增長(zhǎng)，較好地保存牙齒的生理功能。

再生技術(shù)的3個(gè)關(guān)鍵要素是干細(xì)胞、支架和信號(hào)分子[2]。牙髓再生的支架材料應(yīng)具備以下能力：為干細(xì)胞提供生物學(xué)和機(jī)械支持，創(chuàng)造允許細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化的環(huán)境，可降解且降解速率與組織形成速率一致，無毒害和易制取等[3]。

目前牙髓再生的支架可以大致分為生物提取和人工合成兩大類。生物提取的支架包括血凝塊（blood clot，BC）、富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）、富血小板纖維蛋白（platelet rich fibrin，PRF）、透明質(zhì)酸、藻酸鹽、殼聚糖（chitosan，CS）、膠原、絲、脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）等；人工合成的支架包括聚合物、生物陶瓷等；此外，還有將兩種或兩種以上材料結(jié)合在一起的復(fù)合支架。本文就這些支架材料的性能和應(yīng)用前景的研究進(jìn)展作一綜述。

1 生物提取的支架

從生物資源里提取的基質(zhì)一般具有較好的生物相容性和生物活性，但其降解速率和微觀結(jié)構(gòu)不易調(diào)控，還有免疫原性和毒性方面的顧慮。

1.1 BC

BC是目前牙髓再生治療中最傳統(tǒng)最普及的一種支架材料。BC不僅是支架，還是引入干細(xì)胞的主要手段。通過刺破根尖周組織使血液進(jìn)入根管，可簡(jiǎn)便直接地獲得BC。

牙髓再生治療應(yīng)用單純BC支架后，人牙根發(fā)育的成功率為53.3%～100%[4-7]。BC具有高成功率、簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)性和天然無害的特點(diǎn)，但其效果存在爭(zhēng)議。Altaii等[8]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較了BC支架、PRP、膠原支架進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建治療的效果，發(fā)現(xiàn)BC支架較其他支架形成硬組織的概率低。BC仍有很多不足，首先BC不能誘導(dǎo)真正的牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生，其次BC的結(jié)構(gòu)脆弱，治療時(shí)可能不能獲得足量的BC以充盈根管，從而導(dǎo)致上方封閉塌陷。學(xué)者們目前仍在研究其他新型材料作為支架，以期獲得真正的牙髓再生。

1.2 PRP和PRF

PRP是一種具有豐富生長(zhǎng)因子的自體第1代血小板濃縮物，可以說是不同生長(zhǎng)因子的濃縮懸浮液。PRP可通過自體血液加工后獲得，無免疫原性和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

Jadhav等[9]對(duì)20例患者的年輕恒前牙進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建治療，隨訪12個(gè)月，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與不應(yīng)用PRP相比較，應(yīng)用PRP的患牙在根尖周愈合、根尖孔閉合和根管壁增厚的程度方面均有明顯增加，而牙根長(zhǎng)度增加方面則無明顯差異。分析可能的機(jī)制為：在局部應(yīng)用PRP時(shí)，血小板數(shù)量增加高達(dá)338%[10]，血小板數(shù)量增加會(huì)導(dǎo)致由它們分泌的生長(zhǎng)因子數(shù)量增加；PRP中的血小板被激活后，其α脫顆粒可產(chǎn)生高濃度生長(zhǎng)因子，各種生長(zhǎng)因子之間會(huì)相互影響和作用，通過自分泌或旁分泌模式刺激周圍細(xì)胞再聚集，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化、遷移、增殖和分化，從而引發(fā)及時(shí)有效的組織修復(fù)過程[11]。然而，Alagl等[4]使用PRP和BC進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建的臨床對(duì)照研究則表明除了根長(zhǎng)顯著增加之外，PRP處理的結(jié)果與BC沒有明顯差異。Bezgin等[5]的研究也表明：使用PRP與BC在牙根發(fā)育和炎癥反應(yīng)等方面的效果均沒有明顯差異。

上述研究提示PRP支架的功能具有不確定性，目前仍不能認(rèn)為PRP可取代BC獲得更好的牙根發(fā)育效果。除此之外，使用PRP支架的缺點(diǎn)有：需要患者抽血，需要特殊設(shè)備和試劑來制備，以及增加治療成本等。

PRF是具有高濃度的纖維蛋白凝塊的第2代血小板濃縮物。與PRP相比，PRF在制備過程中不需要補(bǔ)充凝血酶，含有更高濃度的細(xì)胞因子，且釋放生長(zhǎng)因子速度更為緩慢，更有利于堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達(dá)和礦化誘導(dǎo)[12]。目前PRF應(yīng)用于臨床牙髓再生治療成功的案例報(bào)道僅有數(shù)例。Ulusoy等[13]認(rèn)為：PRF可以獲得與PRP、BC類似的臨床和放射學(xué)結(jié)果。李文靜等[14]認(rèn)為：PRF有優(yōu)秀的生物誘導(dǎo)性，能較好地保存牙髓活力，誘導(dǎo)年輕恒牙牙根形成，提高治療成功率。目前尚需更多的研究來驗(yàn)證其作為牙髓再生支架的效果[15-17]。

1.3 多糖

多糖類支架也常用于牙髓再生。多糖類材料包括透明質(zhì)酸、藻酸鹽、CS和VitroGel 3D多糖水凝膠等。透明質(zhì)酸是存在于ECM中的糖胺聚糖之一，通過保留細(xì)胞外間隙在維持組織形態(tài)中起重要作用[18]。藻酸鹽是從褐藻中分離出的一類多糖[19]。CS是甲殼素脫乙?；a(chǎn)生的，甲殼素是甲殼類（如螃蟹和蝦）的外骨骼和真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)元素[3]。CS具有多種生物學(xué)特性，如抗菌性、生物相容性、生物降解性、止血能力、與蛋白質(zhì)顯著的親和力和促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化的能力，易被加工成各種結(jié)構(gòu)，具有作為牙髓再生支架的潛力[20-21]。這些材料都具有生物相容性和無毒性，但機(jī)械強(qiáng)度低，體內(nèi)降解速度不受控制。

2014年，Lambricht等[22]和Martin等[23]通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估了各種類型和組成的透明質(zhì)酸和藻酸鹽天然水凝膠，發(fā)現(xiàn)它們能夠促進(jìn)根尖牙乳頭干細(xì)胞（stem cells from apical papilla，SCAPs）增殖、礦化和分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞表型。這提示多糖類支架具有可用于牙髓再生的潛力。

透明質(zhì)酸可制成可注射凝膠或透明質(zhì)酸海綿[18,24]。Ferroni等[25]將牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）接種到透明質(zhì)酸支架上，發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸可誘導(dǎo)成骨或成牙髓樣組織。

藻酸鹽可通過增加鈣含量和交聯(lián)密度改善機(jī)械強(qiáng)度[26]。攜帶轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的藻酸鹽水凝膠可在體外誘導(dǎo)人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化并產(chǎn)生規(guī)則的管狀牙本質(zhì)基質(zhì)[27]。Verma等[28]對(duì)20只雪貂尖牙使用DPSCs+藻酸鹽水凝膠或者BC支架進(jìn)行牙髓再生治療，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)牙根發(fā)育效果并無明顯差異。

Palma等[20]使用BC和2種不同配方的CS水凝膠作為支架進(jìn)行犬的牙髓再生治療，發(fā)現(xiàn)CS支架不能改善根管內(nèi)礦化組織的形成，也不能促進(jìn)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體再生，與單獨(dú)使用BC支架相比更易導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，降解時(shí)間過長(zhǎng)。而曹春玲等[29]研究了人牙髓細(xì)胞在可注射羥乙基殼聚糖基水凝膠內(nèi)的增殖和分化狀況，發(fā)現(xiàn)在成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后，牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白（dentin matrix protein，DMP）-1、ALP表達(dá)水平較高，展現(xiàn)了良好的成牙本質(zhì)向分化潛力和礦化潛力。

Xiao等[30]認(rèn)為：已經(jīng)商品化的非動(dòng)物源的VitroGel 3D合成多糖水凝膠有作為牙髓再生支架的潛力。該研究在VitroGel 3D合成多糖水凝膠中培養(yǎng)SCAPs，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的2D單層細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D水凝膠系統(tǒng)中SCAPs生長(zhǎng)的形態(tài)和行為與自然生長(zhǎng)狀態(tài)非常相似，并且混入的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α）能夠協(xié)同骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2，促進(jìn)DMP-1和DSPP表達(dá)明顯增加，增加血管化水平和成骨水平。

1.4 膠原

膠原是一種天然蛋白質(zhì)，是ECM的主要成分，可從動(dòng)物的皮膚、骨骼、韌帶等組織中提取，來源廣泛且種類繁多。目前已鑒定的膠原就有19種，而支架材料主要由Ⅰ型膠原制備[19]。膠原可加工成各種形式，包括多孔海綿、凝膠和膜，并可與化學(xué)物質(zhì)交聯(lián)以改變其降解速率和收縮率[31]。

1.4.1 膠原膜 在臨床上牙髓再生治療時(shí)，如果不能獲得足夠的血液作為支架，密封材料易塌陷，使用可吸收膠原膜能防止密封材料塌陷，在血液不足的情況下作為支架允許新的組織生長(zhǎng)進(jìn)入髓腔。Bio-Gide是一種可吸收的純膠原膜，廣泛用作牙周組織再生的支架材料[32-33]。Jiang等[6]和Fahmy等[34]通過臨床研究發(fā)現(xiàn)：是否使用膠原膜在治療成功率和其他臨床指標(biāo)方面沒有明顯差異，牙根繼續(xù)發(fā)育參數(shù)，如根長(zhǎng)、根尖1/3牙本質(zhì)壁厚度、根尖孔寬度并沒有明顯差異，但能夠促進(jìn)牙根中1/3牙本質(zhì)形成，這有利于避免根折。膠原膜還增加了操作的便利性，并可確保密封材料的定位，特別適用于根管粗大的牙齒。

1.4.2 明膠海綿 有學(xué)者[35]對(duì)犬的根尖周炎年輕恒牙進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建，結(jié)果與僅使用BC相比，明膠海綿和BC作為組合支架使用時(shí)能夠形成更多的新生組織。Yamauchi等[36]進(jìn)行了類似的研究，同樣發(fā)現(xiàn)使用交聯(lián)的膠原蛋白支架增加了管腔中的礦化組織形成。

1.4.3 膠原水凝膠 膠原水凝膠可攜帶BMP-4或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），與牙髓細(xì)胞混合并移植到大鼠體內(nèi)后能夠檢測(cè)到DSPP的產(chǎn)生[37]。膠原水凝膠還可攜帶血管原性生長(zhǎng)因子（angiogenic growth factors，AGF）與牙髓細(xì)胞，促進(jìn)根管中結(jié)締組織的形成[38]。交聯(lián)肉桂醛后的膠原水凝膠可以促進(jìn)人DPSCs的增殖和牙源性分化，抗壓強(qiáng)度和表面粗糙度增加，凝結(jié)時(shí)間明顯縮短[39]。

由上述研究可知，膠原類支架材料可誘導(dǎo)根管內(nèi)產(chǎn)生更多的新生組織，且其組分和結(jié)構(gòu)多樣，在牙髓再生治療中具有非常有益的特征；但也有研究[40]表明使用膠原支架會(huì)比不使用導(dǎo)致更明顯的炎癥反應(yīng)、更多的牙根和骨吸收。

1.5 絲

絲作為支架可用于軟硬組織工程。絲的成分為絲素蛋白（silk fibroin，SF），而SF是一種酶促可降解材料，可以加工成不溶于水的植入物，如可注射水凝膠和多孔海綿。SF還具有良好的抗凝血活性和促進(jìn)再生作用的能力，良好的機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透氣性、滲水性以及緩慢的降解速率[41]。

Meinel等[42]通過大鼠進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：絲與聚乳酸（polylactic acid，PLA）或膠原相比，炎癥反應(yīng)和免疫原性更低，生物相容性更高。Yang等[43]發(fā)現(xiàn)：使用復(fù)合bFGF的SF支架，通過體外誘導(dǎo)DPSCs，生成具有良好的血管分布、新的基質(zhì)沉積和牙質(zhì)樣組織形成的類牙髓樣組織。

目前SF應(yīng)用于牙髓再生方面的研究仍比較缺乏，還需要更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證SF是否具有較其他支架更好的性能。

1.6 脫細(xì)胞ECM

除血細(xì)胞之外，人體組織中的大部分正常細(xì)胞是錨定的，位于稱為ECM的固體基質(zhì)中。組織工程的最佳支架應(yīng)該是天然狀態(tài)下的ECM，微環(huán)境是非常重要的[44-45]。脫細(xì)胞ECM基本保存了微環(huán)境和纖維蛋白，提供了細(xì)胞定位并有利于調(diào)節(jié)未來的細(xì)胞活性，可能是組織再生的理想支架[46]。已有研究[47-48]成功實(shí)現(xiàn)了人牙髓的脫細(xì)胞處理，所產(chǎn)生的支架支持干細(xì)胞增殖和分化成礦化組織。脫細(xì)胞ECM可以說是一種自/異體移植物，可從拔除的健康第三磨牙中提取，來源廣泛、容易獲取是其優(yōu)勢(shì)。

2 人工合成的支架

人工合成的支架常具有更可控的降解率和物理機(jī)械性能，但生物相容性較差。

2.1 聚合物

許多人工合成的聚合物，如PLA、聚-L-乳酸（poly-L-lactic acid，PLLA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物（polylactic-co-glycolic，PLGA）、聚ε-己 內(nèi) 酯（polyepsiloncaprolactone，PCL）、聚二氧環(huán)己酮（polydioxanone scaffold，PDS）和聚乙二醇聚乳酸（polyethylene glycol polylactic，PEG）等可用作牙髓再生的支架。這些聚合物無毒害，可達(dá)到生物降解，并能對(duì)物理化學(xué)性質(zhì)，如機(jī)械強(qiáng)度、降解速率、孔隙率和微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確控制[49]。

Gotlieb等[50]將人脫落乳牙干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）接種在合成的PLLA等支架上，植入人前磨牙根管中，通過掃描電子顯微鏡觀察添加或不添加BMP-2、TGF-β2的PLLA支架或膠原支架的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同支架類型和支架是否添加生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞附著的影響幾乎沒有差異。El-Backly等[51]將兔DPSCs接種于PLGA上，并植入家兔皮下，12 d后觀察到牙骨質(zhì)及管狀牙本質(zhì)形成。Cordeiro等[52]將人脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）接種到PLLA上，置于牙本質(zhì)薄片上并移植入裸鼠皮下，14～28 d后觀察到血管化的牙髓樣組織和成牙本質(zhì)細(xì)胞形成。

聚合物支架的生物相容性較天然支架可能差一些。Leong等[53]將釋放甲硝唑和克林霉素的彈性凍干膠原支架與PLGA進(jìn)行比較，接種人DPSCs 7 d后，釋放甲硝唑和克林霉素的彈性凍干膠原支架接觸的細(xì)胞更健康，而與PLGA接觸的細(xì)胞顯示出退化和凋亡跡象。

抗生素聯(lián)合聚合物支架，如二聯(lián)抗生素糊劑（doubleantibiotic paste，DAP）-PDS支架、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）-PDS支架、三聯(lián)抗生素糊劑（tripleantibiotic paste，TAP）-模擬PDS聚合物納米纖維支架等，均具有明顯的抗菌效果。將來如果抗生素聯(lián)合聚合物支架能取代根管內(nèi)化學(xué)消毒的步驟，將大大縮短牙髓再生治療的就診頻次和療程，但同時(shí)要考慮到抗生素對(duì)干細(xì)胞增殖的抑制作用[54-60]。

2.2 生物陶瓷

生物陶瓷支架是指鈣-磷酸鹽類材料（calcium phosphate-based，Ca-P）、生物活性玻璃和玻璃陶瓷等[61]。最常用的是Ca-P生物陶瓷[3]。Ca-P支架包括β磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）和羥磷灰石（hydroxyapatite，HA），目前已經(jīng)廣泛用于骨再生。TCP和HA的鈣磷比例不同。HA具有骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，是骨組織的優(yōu)良替代材料，但在體內(nèi)幾乎不降解；與HA相比，TCP可降解并且能通過釋放鈣、磷離子促進(jìn)組織礦化。

Miura等[62]將SHEDs與HA-TCP混合后移植到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有牙本質(zhì)、骨和牙髓樣組織的形成。Goudouri等[63]發(fā)現(xiàn)鎂基玻璃陶瓷具有較高的機(jī)械性能和生物活性。Kushwaha等[64]成功地在添加鈮的氟磷灰石玻璃陶瓷表面上培養(yǎng)出人類間充質(zhì)干細(xì)胞。Lim等[65]在摻入地塞米松和生物活性玻璃納米顆粒的納米纖維基質(zhì)上培養(yǎng)出人牙髓細(xì)胞（human dental pulp cells，hDPCs），并發(fā)現(xiàn)該基質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

生物陶瓷類材料的缺點(diǎn)是成形困難，機(jī)械強(qiáng)度差，脆性大，降解速率緩慢以及密度高。這些特性可以通過改變其成分和結(jié)構(gòu)而加以修改。比如向純TCP支架中添加SiO2和ZnO，可增加其機(jī)械強(qiáng)度以及細(xì)胞增殖活性；改變支架的孔徑和體積，也會(huì)影響其機(jī)械強(qiáng)度。

總之，生物陶瓷支架在單獨(dú)使用時(shí)缺點(diǎn)十分明顯，因此目前常與其他材料復(fù)合應(yīng)用。

2.3 復(fù)合支架

為了克服單一支架材料的缺點(diǎn)，將兩種或多種材料進(jìn)行復(fù)合是支架材料研制中的新方向。

Agrawal等[66]發(fā)現(xiàn)：將生物陶瓷結(jié)合聚合物（如羥磷酸鈣結(jié)合PLA），不僅有助于防止因聚合物降解引起的pH值下降及無菌性炎癥，同時(shí)復(fù)合后的材料在強(qiáng)度、脆性、孔隙率和降解性等方面兼具兩種材料的優(yōu)點(diǎn)。

Fu等[67]將BMP-2與PLGA/HA復(fù)合纖維支架以不同的方式結(jié)合，移植到裸鼠體內(nèi)，觀察6周后發(fā)現(xiàn)：從PLGA/HA復(fù)合纖維支架釋放的BMP-2的生物活性保持良好，進(jìn)一步改善了新骨形成和愈合。

自組裝含肽水凝膠是新型生物材料支架[68]。因其中心肽段分別由親水性和疏水性的氨基酸殘基交替組成，從而具有很強(qiáng)的自組裝性。成膠前，可以先和細(xì)胞或生物活性分子（如生長(zhǎng)因子）預(yù)混，在鹽溶液中，肽段會(huì)自組裝形成透明的三維凝膠結(jié)構(gòu)。這種自組裝性使其擁有廣泛的應(yīng)用前景。Galler等[69]將SHEDs和DPSCs分別接種在自組裝多肽水凝膠中，觀察4周后發(fā)現(xiàn)：干細(xì)胞都能進(jìn)行增殖和分化，凝膠也都發(fā)生了降解；SHEDs表現(xiàn)出較高的增殖率和膠原形成量，產(chǎn)生更多軟組織，而DPSCs的增殖率雖較低，但可觀察到礦化現(xiàn)象、成骨樣細(xì)胞表型和相關(guān)基因表達(dá)。

除上述支架外，還有各種復(fù)合支架，如生物活性分子-生長(zhǎng)因子-干細(xì)胞模擬ECM支架[70]、膠原-藻酸鹽牙膠尖支架[71]、膠原-HA支架[72]、氟磷灰石（fluorapatite，F(xiàn)A）-PCL支架[73]、PDS-埃洛石納米管（halloysite nanotubes，HNTs）支架[74]等等，它們可以在一定程度上取長(zhǎng)補(bǔ)短，具有廣闊的研究前景。

3 小結(jié)

目前尚未有理想的牙髓再生支架材料問世，期望未來有更多關(guān)于復(fù)合支架的研究能夠打破單一支架的局限性。牙髓再生治療的方法和步驟仍在不斷改進(jìn)和探索中，將來通過更先進(jìn)的支架材料和大量的病例研究可以規(guī)范牙髓再生治療，提高其治療的成功率，獲得真正的牙髓再生。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。