高糖環(huán)境培養(yǎng)、lncRNA 58992 過表達SV40 中l(wèi)ncRNA 58992和纖維化標志物表達觀察

丁明璐，王小花，劉海峰

牡丹江市牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江牡丹江157000

糖尿病腎?。―N）是糖尿病患者常見的微血管并發(fā)癥之一，也是發(fā)展為終末期腎病的主要原因，其病理特征表現(xiàn)為腎小球肥大、系膜增生、腎小球基底膜增厚和細胞外基質(zhì)（ECM）沉積［1-6］。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究表明DN 發(fā)展的過程涉及多種機制，主要包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、山梨醇醛糖還原酶活性的激活、晚期糖基化終產(chǎn)物含量的上調(diào)、細胞內(nèi)蛋白激酶C 活性的升高和細胞周期蛋白依賴性激酶表達的增加［7］。近年研究［8］發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）在糖尿病腎纖維化中的具有重要作用，并受到廣泛關(guān)注。

lncRNAs 是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNAs。研究表明，lncRNAs 在劑量補償效應(yīng)、表觀遺傳、細胞周期和細胞分化調(diào)控等眾多生命活動中發(fā)揮著重要作用，目前已成為遺傳學(xué)的研究熱點。最近有研究［9］表明，降低lncRNA ANRIL 可通過調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白和MEK/ERK 信號通路來抑制糖尿病腎小球系膜細胞模型的增殖和纖維化；lncRNA ISG-20通過影響miRNA-486-5p/NFAT5誘導(dǎo)AKT的磷酸化來促進糖尿病腎纖維化［10］；此外，p53 可通過抑制 lncRNA ZEB1-AS1 來抑制 DN 的發(fā)生發(fā)展［11］，以上研究結(jié)果表明，lncRNAs 在糖尿病腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用。

前期生物信息學(xué)的研究顯示，糖尿病腎纖維化小鼠腎臟組織中l(wèi)ncRNA 58992 表達明顯上調(diào)，但其尚未在基礎(chǔ)及臨床研究中進行驗證。2020 年10 月—2021年12月，本研究在高糖環(huán)境下培養(yǎng)腎小球系膜細胞系SV40 建立糖尿病腎纖維化模型，觀察了lncRNA 58992 在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞系SV40中的表達水平，并觀察了過表達lncRNA 58992的腎小球系膜細胞系SV40 中纖維化細胞因子α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（FN）和I 型膠原（Col I）的表達變化，以明確lncRNA 58992 對腎小球系膜細胞系SV40纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞、試劑與儀器 腎小球系膜細胞系SV40 由牡丹江醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存，DME/F12 培養(yǎng)基購自HyClone公司，DMEM 低糖培養(yǎng)基購自Gibco 公司，胎牛血清（FBS）購自于碧云天生物有限公司，過表達lncRNA 58992 的質(zhì)粒pcDNA 3.1-lncRNA 58992 和qRT-PCR 中所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，質(zhì)粒抽提試劑盒和總RNA 提取試劑盒購自O(shè)MEGA，SYBR Green Master試劑購自羅氏上海有限公司，Col I、α-SMA 和 FN 抗體購自Abcam 公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 購自北京中山金橋生物有限公司，Cy3 標記的羊抗 兔 IgG、Hoechst 33342、細 胞 裂 解 液 和 lipofectamine 8000 轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Biosharp 公司，磷酸酶抑制劑購自哈爾濱新?；邢薰荆鞍譵arker 購自Thermo Scientific 公司，其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。主要儀器：熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）、離心機（Thermo Scientific 公司）、恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科技儀器有限公司）、超微量核酸蛋白測定儀（北方北京儀濤商貿(mào)有限公司）、電泳儀（BIO-RAD）、超靈敏多功能成像儀（Eppendorf 公司）和CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司）。

1.2 腎小球系膜細胞系SV40 的培養(yǎng)及l(fā)ncRNA 58992 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 小鼠腎小球系膜細胞系SV40采用含10% FBS 和1% 青霉素/鏈霉素的DME/F12培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，接種到6孔板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用含有0.5%FBS 培養(yǎng)基饑餓 12 h，將細胞分成 3 組：NG + 58992組、HG 組和 NG 組，其中 NG+58992 組轉(zhuǎn)染過表達lncRNA 58992 質(zhì)粒24 h，繼續(xù)低糖（5 mmol/L）培養(yǎng)24 h；HG 組低糖環(huán)境培養(yǎng)24 h 后再經(jīng)高糖（25 mmol/L）環(huán)境培養(yǎng)24 h；NG 組為低糖培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，進行纖維化相關(guān)基因和蛋白的檢測。

1.3 各組 lncRNA 58992、FN、Col I mRNAs 的檢測 采用qRT-PCR 法。取各組細胞，消化并收集細胞，經(jīng)總RNA 提取試劑盒提取各組細胞的RNA，超微量核酸測定儀檢測總RNA濃度。取RNA 1 μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR檢測纖維化相關(guān)基因。引物序列如下：ColIF：5’-GAGCGGAGAGTACTGGATCG-3’，R：5’-GCTTCTTT TCCTTGGGGTTC-3’；FNF：5’-AATGGAAAAGGGGA ATGGAC-3’，R：5’-CTCGGTTGTCCTTCTTGCTC-3’；GAPDH F：5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’，R：5’-ACACATTGG GGGTAGGAACA-3’。RT-qPCR 反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，正向和反向引物各 0.8 μL、SYBR Green Mix 9 μL、無菌三蒸水7.4 μL。反應(yīng)程序：50 ℃升溫2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火 1 min；擴增 40 個循環(huán)，以 GAPDH 為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.4 各組α-SMA、FN 和Col I 蛋白的檢測 ①采用免疫熒光法。取對數(shù)生長期腎小球系膜細胞系SV40，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%Trition X-100 通透 15 min，5% BSA 室溫封閉 1 h，一抗4 ℃孵育過夜，室溫避光孵育Cy3 標記的山羊抗兔二抗1 h，Hoechst 33342 染核 20 min，激光共聚焦顯微鏡拍取圖片，并觀察各組中紅色熒光表達強弱。②采用Western blotting 法。取各組細胞，消化并收集細胞，離心吸掉上清，細胞裂解液與磷酸酶抑制劑按照100：1 比例重懸細胞，在4 ℃冰箱搖床孵育30 min，4 ℃，1 2 000 r/min 離心 10 min，取上清，Nano Drop 2000 測濃度，用上樣緩沖液稀釋蛋白，100 ℃沸水中煮 10 min，立即放在冰上，取 40 μg 蛋白上樣，進行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。分別置于FN（1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）和 β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃冰箱孵育過夜，放置辣根過氧化酶標記的二抗（1∶20 000）孵育液中，室溫孵育1 h。加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，超靈敏多功能成像儀曝光拍照。用Image J軟件進行灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Graphpad 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。服從正態(tài)分布的計量資料以 xˉ±s 表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 lncRNA 58992、FN、Col I mRNAs 的比較 HG 組、NG 組中l(wèi)ncRNA 58992的相對表達量分別為1.45 ± 0.22、1.00 ± 0.03，兩組比較，t=3.867，P＜0.05。NG+58992 組、HG 組、NG 組 FN mRNA 相對表達量分別為8.78 ± 1.86、13.17 ± 1.95、1.00 ±0.01，三組比較，F(xiàn)=47.26，P＜0.01；NG+58992 組與NG 組相比，t=8.504、P＜0.05；HG 組與NG 組相比，t=10.80、P＜0.01；NG + 58992 組與 HG 組相比，t=3.49、P＜0.05。NG + 58992 組、HG 組、NG 組 Col I mRNA 相對表達量分別為 2.40 ± 0.41、4.16 ±0.83、1.00 ± 0.06，三組比較，F(xiàn)=26.37，P＜0.01；NG+58992 組與NG 組相比，t=6.818，P＜0.05；HG 組與NG 組相比，t=6.472、P＜0.01；NG + 58992 組與 HG組相比，t=3.517、P＜0.05。

2.2 各組Col I、α-SMA 和FN 蛋白的比較 細胞免疫熒光檢測結(jié)果表明，NG 組中 Col I、α-SMA 和 FN蛋白均有少量的紅色熒光，表明該蛋白在細胞中存在本底表達，而 HG 組和 NG + 58992 組中 Col I、α-SMA 和FN 的紅色熒光均增強，說明lncRNA 58992可誘導(dǎo)纖維化相關(guān)的蛋白表達上調(diào)。

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，NG+58992 組、HG 組、NG 組FN蛋白相對表達量分別為0.75±0.24、0.91±0.17、0.27±0.13，三組比較，F(xiàn)=9.81，P＜0.05；NG+58992組與NG 組相比，t=3.376，P＜0.05；HG 組與 NG 組相比，t=9.53，P＜0.05；NG + 58992 組與 HG組相比，t=1.924、P＞0.05。NG+58992組、HG 組、NG組α-SMA蛋白相對表達量分別為0.28±0.03、0.59±0.06、0.14 ± 0.03，三組比較，F(xiàn)=89.37，P＜0.05；NG+58992 組與 NG 組相比，t=3.799、P＜0.05；HG 組與NG 組相比，t=9.438、P＜0.001；NG + 58992 組與HG組相比，t=22.19、P＜0.01。

3 討論

DN是最主要的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是慢性腎病和終末期腎臟病的重要原因。慢性腎病的最終病理結(jié)果是腎間質(zhì)纖維化，其組織病理學(xué)特征包括ECM 過度產(chǎn)生、沉積、炎癥細胞的浸潤、腎小管細胞的損失、肌纖維的聚集和腎小管周圍微血管的變薄。研究表明，當正常腎組織被纖維化組織替代時，腎臟結(jié)構(gòu)顯著改變并導(dǎo)致腎功能受損。另外，患有慢性腎病的患者發(fā)展到腎間質(zhì)纖維化階段，患者的腎功能會逐漸降低，最終需要透析或腎移植來維持其功能。因此，充分了解糖尿病腎纖維化的作用和機制，尋找糖尿病腎纖維化的標志物及治療策略具有理論價值和現(xiàn)實意義。

近年，lncRNAs 在糖尿病腎纖維化中的作用和機制引起越來越多的關(guān)注。LncRNA MALAT1 通過降低miR-2355-3p/IL6ST 軸緩解糖尿病腎纖維化；另外，敲除lncRNA H19 通過促進miR-29 誘導(dǎo)的內(nèi)皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進糖尿病腎纖維化；LncRNA NEAT1通過吸附miR-23c加速DN的發(fā)生和發(fā)展［12］。因此，lncRNAs 與糖尿病腎纖維化密切相關(guān)。lncRNA 58992 是最近新發(fā)現(xiàn)的lncRNAs 分子，但其在糖尿病腎纖維化中的作用尚未進行研究。

腎小球系膜細胞是多種細胞因子的分泌源，同時又是多種細胞因子作用的主要靶細胞，系膜細胞作為腎臟的固有細胞，具有分泌ECM、產(chǎn)生細胞因子、吞噬和清除大分子物質(zhì)以及平滑肌細胞收縮的功能，在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。為了進一步研究lncRNAs與糖尿病腎纖維化之間的關(guān)系，前期生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎纖維化模型小鼠腎臟中異常表達lncRNA 58992。本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 58992在糖尿病腎纖維化模型細胞中表達顯著增加，同時過表達lncRNA 58992可促進正常腎小球系膜細胞系SV40中Col I、α-SMA 和FN 等mRNAs和蛋白的表達增加，提示lncRNA 58992 可影響腎小球系膜細胞系SV40纖維化，可能參與DN的腎臟纖維化進程。總之，本研究首次在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞系SV40 中發(fā)現(xiàn)lncRNA 58992 高表達，同時lncRNA 58992 可以調(diào)控腎小球系膜細胞系SV40 中纖維化的發(fā)生參與DN 的病理過程。接下來，我們將進一步研究lncRNA 58992 促進糖尿病腎纖維化發(fā)生的作用機制，為糖尿病腎纖維化的治療與預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。